牙鲆原始生殖細(xì)胞Nanos3基因的調(diào)控序列及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及牙鲆原始生殖細(xì)胞調(diào)控序列，具體的說是一種牙鲆原始生殖細(xì)胞Nanos3基因的調(diào)控序列及其應(yīng)用。牙鲆Nanos3基因的3’UTR序列如SEQ?ID?No.1中所示。所述SEQ?ID?No.1中所示的核苷酸序列作為在調(diào)控目的基因在原始生殖細(xì)胞中特異表達(dá)的應(yīng)用。本發(fā)明基因序列為牙鲆特有的序列，可以用于牙鲆等海水魚以及其它動(dòng)物譬如斑馬魚PGCs的標(biāo)記，以及PGCs中特異表達(dá)目的基因。
【專利說明】牙鲆原始生殖細(xì)胞Nan〇S3基因的調(diào)控序列及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及牙鲆原始生殖細(xì)胞調(diào)控序列，具體的說是一種牙鲆原始生殖細(xì)胞 Nanos3基因的調(diào)控序列及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 牙鲆，俗稱牙片，為鲆鰈魚類，錄屬于鰈形目、牙鲆科、牙鲆屬，是我國和日韓等國 的重要海水養(yǎng)殖魚類。針對(duì)養(yǎng)殖牙鲆種質(zhì)退化、抗病力下降，嚴(yán)重制約其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn) 象，近年來陸續(xù)在牙鲆中進(jìn)行了多種育種方法的嘗試。其中，性別控制育種、多倍體育種、分 子標(biāo)記輔助選擇育種作為常用的育種方法，既耗時(shí)又需要較大的水體，也無法將外源優(yōu)良 性狀基因?qū)?。而且，通過保存親本進(jìn)行優(yōu)良種質(zhì)保存也需要大面積養(yǎng)殖水體?；谠?生殖細(xì)胞（PGCs)的操作技術(shù)，則可以分離獲得PGCs，并通過PGCs的冷凍保存技術(shù)來有效地 保存優(yōu)良種質(zhì)，如此減少優(yōu)良性狀牙鲆等魚類種質(zhì)資源保存需要的大量水體，也將促進(jìn)人 工分子設(shè)計(jì)育種將外源優(yōu)良性狀基因?qū)爰夹g(shù)的開發(fā)。然而，有關(guān)于牙鲆PGCs相關(guān)研究尚 未見到報(bào)道，PGCs特異基因及PGCs的標(biāo)記也未獲得。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明在于提供一種牙鲆原始生殖細(xì)胞Nanos3基因的調(diào)控序列及其應(yīng)用。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] -種牙鲆原始生殖細(xì)胞Nanos3基因的調(diào)控序列，牙鲆Nanos3基因的3' UTR序列 如SEQ ID No. 1中所示。
[0006] 一種牙鲆原始生殖細(xì)胞Nanos3基因的調(diào)控序列的應(yīng)用，所述SEQ ID No. 1中所示 的核苷酸序列作為在調(diào)控目的基因在原始生殖細(xì)胞中特異表達(dá)的應(yīng)用。
[0007] 所述SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列作為魚類中調(diào)控目的基因在PGCs中特異 表達(dá)的應(yīng)用。
[0008] 所述SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列作為斑馬魚或牙鲆中調(diào)控目的基因在PGCs 中特異表達(dá)的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0010] 本發(fā)明是首次在牙鲆中發(fā)現(xiàn)原始生殖細(xì)胞標(biāo)志因子的調(diào)控序列，并證實(shí)其有原 始生殖細(xì)胞特異性的調(diào)控作用，該序列在魚類包括海水魚類原始生殖細(xì)胞的標(biāo)記、分離等 應(yīng)用中具有極大的價(jià)值，這為魚類包括海水魚類原始生殖細(xì)胞相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)技術(shù)保 證。
[0011] 本發(fā)明基因序列為牙鲆特有的序列，可以用于牙鲆等海水魚以及其它動(dòng)物譬如斑 馬魚PGCs的標(biāo)記以及PGCs中特異表達(dá)目的基因；在不影響原有細(xì)胞功能的條件下活體標(biāo) 記。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的Nanos3 3' UTR RACE電泳圖譜。
[0013] 圖2本發(fā)明實(shí)施例提供的pSP64Poly (A) (Promega)組成示意圖。
[0014] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的牙鲆Nanos3基因能夠驅(qū)動(dòng)GFP特異表達(dá)在斑馬魚 PGCs中的示意圖。其中，GFP-YPNanos3 3' UTR mRNA標(biāo)記斑馬魚原始生殖細(xì)胞（PGCs)，側(cè) 面觀，箭頭所指位置是PGCs。hpf，受精后小時(shí)。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)施例詳述本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)步驟。
[0016] 實(shí)施例1
[0017] 1. RNA提取及SMATer3' RACE文庫的構(gòu)建
[0018] 牙鲆性腺的總RNA提取采用Trizol (Invitrogen)提取，具體步驟如下：取大約 0. lmg牙鲆性腺，加入0. lmL Trizol，充分混勻，然后加入TrizolO. 9mL，室溫放置5min。加 入氯仿0. 2mL，劇烈振蕩15s，室溫放置3min。12000 X g，4°C，離心15min，離心后將離心管小 心取出。取上清到新的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置l〇min，12000 X g，4°C， 離心10min。去掉異丙醇，加入預(yù)冷的75%乙醇lmL洗漆沉淀，7500Xg，4?，離心5min。去 掉乙醇，置于超凈臺(tái)中使乙醇揮發(fā)。加入水（無 RNA酶）30yL，55-60°C水浴10min使RNA 溶解，取出后置于冰上。加入luL DNase (無 RNA酶），37°C水浴15min，消化DNA以去除 DNA的殘余。取出后置于冰上，lyL電泳檢測(cè)質(zhì)量及完整度，測(cè)吸光度檢測(cè)濃度及質(zhì)量。直 接用于余下實(shí)驗(yàn)，或者液氮速凍，-80°C保存
[0019] SMATer3' RACE cDNA 文庫的合成利用 SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)試劑盒進(jìn)行，具體操作如下：合成所用的引物：3'-RACEα)SPrimerA5'-AAGCAGTGGTATCA ACGCAGA GTA C(T)30VN - 3'（12 μ M)。
[0020] 取性腺總 RNA3. 75 μ L，1 μ L 反轉(zhuǎn)錄引物 3' -RACE CDS primer A70°C 3min，冰 上冷卻 2min，離心，加入 2· 0 μ L5X First-Strand Buffer，1· 0 μ L DTT(20mM)，1· 0 μ L dNTP Mix (lOmM),0. 25 μ L RNase Inhibitor (40U/μ L),1. 0 μ L SMARTScribe? Reverse Transcriptase (100U)，混勻后離心，42°C溫育 90min，然后 70°C 10min。離心后加 20 μ L 水 (無 RNA酶）稀釋，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0021] 2、Nanos3 3' UTR 的獲得。
[0022] PCR 所用弓丨物如下：（1) 10X Universal Primer A Mix(UPM)長弓丨物 5' - CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAG AGT - 3'（0· 4 μ Μ)，短引物 5' - CTAATACGACTCACTATAGGGC - 3' (2 μ Μ) ； (2)Nested Universal Primer A(NUP)5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGT-3,（10μΜ) ;(3)RACE15, -CCGACCTGGTGTATGGATCC CACTGG-3'（10μΜ) ;(4)RACE2 5'-CTGCGACAGTACGTGTGTCC CCTCTG-3'（10μΜ)。
[0023] 按照巢式PCR進(jìn)行兩次反應(yīng)。
[0024] 第一次反應(yīng)PCR管分配及所含混合物如下：
[0025]

【權(quán)利要求】
1. 一種牙鲆原始生殖細(xì)胞Nanos3基因的調(diào)控序列，其特征在于：牙鲆Nanos3基因的 3' UTR序列如SEQ ID No. 1中所示。
2. -種權(quán)利要求1所述的牙鲆原始生殖細(xì)胞Nanos3基因的調(diào)控序列的應(yīng)用，其特征在 于： 所述SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列作為在調(diào)控目的基因在原始生殖細(xì)胞中特異表 達(dá)的應(yīng)用。
3. 按權(quán)利要求2所述的牙鲆原始生殖細(xì)胞Nanos3基因的調(diào)控序列的應(yīng)用，其特征在 于：所述SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列作為魚類中調(diào)控目的基因在PGCs中特異表達(dá)的 應(yīng)用。
4. 按權(quán)利要求3所述的牙鲆原始生殖細(xì)胞Nanos3基因的調(diào)控序列的應(yīng)用，其特征在 于：所述SEQ ID No. 1中所示的核苷酸序列作為斑馬魚或牙鲆中調(diào)控目的基因在PGCs中特 異表達(dá)的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104120129SQ201410336602
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】譚訓(xùn)剛, 李美潔, 王倩, 尤鋒, 焦爽 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院海洋研究所