一種h9n2亞型禽流感病毒的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明一種H9N2亞型禽流感病毒的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法，包括一個培養(yǎng)MDCK-HA細胞的步驟，將MDCK-HA細胞放置于轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)；一個在MDCK-HA細胞中接種H9N2亞型禽流感病毒的步驟，待轉(zhuǎn)瓶中的細胞長成單層細胞達90%以上時，接種H9N2亞型禽流感病毒，在細胞培養(yǎng)箱中孵育1～2小時，孵育結(jié)束后加入2%NCS?DMEM維持液培養(yǎng)，加入的所述的2%NCS?DMEM維持液的體積為50ml，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收取細胞上清。本發(fā)明采用了MDCK-HA細胞系，而且優(yōu)化了轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的條件，可以使得H9N2亞型禽流感病毒快速增殖，從而達到較高的病毒滴度，并獲得較好的免疫效果。
【專利說明】一種H9N2亞型禽流感病毒的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種細胞的培養(yǎng)方法，具體來說是一種H9N2亞型禽流感病毒的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
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[0002]禽流感(Avian Influenza,Al)是由正粘病毒科A型流感病毒(Avian InfluenzaVirus, AIV)引起的禽類高度接觸性傳染病，有16個HA亞型和9個NA亞型。根據(jù)禽流感病毒致病性的不同，可分為高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒。目前，我國的低致病性禽流感疫情主要以H9亞型為主。我國自1994年首次報道雞群分離到H9N2亞型AIV以來，該亞型禽流感病毒廣泛存在于我國遼寧、安徽、山東、廣東、福建、江蘇、河南、湖南、湖北、上海、廣西、云南、四川、新疆等大部分地區(qū)。H9N2亞型禽流感病毒雖然不引起感染的禽類大量死亡，但是由于該病毒傳播能力極強，存在范圍極廣，導(dǎo)致產(chǎn)蛋下降、免疫抑制病、與其它病原共感染時常導(dǎo)致高死亡率，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。進一步研究發(fā)現(xiàn)，H9N2亞型AIV能在不同宿主雞、鴨、鵪鶉、鴿子間交互傳播，進一步促進了該病毒的流行。同時，H9N2亞型AIV還可以感染豬、人(根據(jù)CDC公布的數(shù)據(jù)，1999年，2003年，2007年皆在香港發(fā)生感染事件)等。因此，H9N2亞型禽流感病毒在經(jīng)濟發(fā)展和公共衛(wèi)生安全上呈現(xiàn)出越來越重要的地位，也越來越引起人們的廣泛關(guān)注。
[0003]接種疫苗是預(yù)防禽流感發(fā)生與傳播最有效的手段，對提高我國的禽病防治水平，對保障我國養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展有十分積極的意義。目前，中國國內(nèi)的H9N2亞型禽流感疫苗均為雞胚尿囊液滅活疫苗，這些H9N2禽流感病毒滅活苗疫苗毒株皆為2002年前分離獲得的。研究發(fā)現(xiàn)，1998年-2006年間的毒株抗原性無變化，疫苗的保護率為100%。但2006年后，在疫苗的選擇壓力下，H9N2亞型的禽流感病毒毒株間抗原性發(fā)生了很大變化，疫苗的保護率在不斷地下降。上海市動物疫病預(yù)防控制中心的一份2009年監(jiān)測報告顯示，在上海三大活禽批發(fā)市場中的樣品H9亞型AIV平均陽性率為8.14%。其中在免疫了 H9N2亞型AIV滅活苗且抗體合格率均大于70%的樣品中分離到45株H9亞型AIV病毒(45/195)，在免疫H9N2亞型AIV滅活苗的抗體合格率達到100%的樣品中分離到了 8株H9亞型AIV (8/90)。這些結(jié)果表明，現(xiàn)有的商品化H9亞型滅活疫苗免疫后，雞只機體產(chǎn)生較高的免疫抗體，但尚不能完全阻止病毒復(fù)制，進行有效地保護。因而，市場需要用現(xiàn)行的H9N2亞型禽流感病毒流行株制備的商品疫苗。
[0004]目前，雞胚是禽流感病毒疫苗生產(chǎn)和研究的主要材料，PR8病毒是一株雞胚適應(yīng)病毒株，目前也是雞胚高產(chǎn)株之一，禽流感疫苗研制中常常將PR8的6個內(nèi)部基因與流行毒株的HA和NA基因重組(6+2)，并將重組病毒作為疫苗株來提高病毒滴度。然而雞胚培養(yǎng)流感病毒疫苗具有嚴重的缺陷，在疫情發(fā)生時，無法提供足夠的雞胚，因而無法在短期內(nèi)擴大疫苗產(chǎn)品。病毒擴增會受到雞胚中母源抗體的影響，使病毒滴度不能達到疫苗生產(chǎn)的需要；雞胚培養(yǎng)病毒產(chǎn)生大量的廢物，這些廢物的處理不僅需要消耗大量的能源，而且也容易造成環(huán)境污染。細胞培養(yǎng)的流感病毒，可克服這些缺點，因而成為目前流感疫苗研制工作的主要方向之一。流感病毒滅活苗毒種的擴增慢慢地已由雞胚向細胞轉(zhuǎn)化，且越來越顯示出經(jīng)濟效益及社會效益。人流感病毒在細胞疫苗的研究已取得重要突破，Baxter和Novartis等世界疫苗大公司，已用微載體細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)研發(fā)成功人用流感疫苗，并通過歐盟批準上市，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益。在動物流感病毒方面，由于細胞對流感病毒的敏感度不及雞胚，因而細胞所制備的禽流感病毒滴度不夠理想，進一步加劇了禽用疫苗的經(jīng)濟制約，到目前為止尚未有禽流感病毒的細胞疫苗產(chǎn)品上市。
[0005]目前，發(fā)明人從2008-2009兩年中不同地區(qū)分離到的20多株H9N2亞型禽流感病毒進行了序列分析和抗原性分析，篩選到一株抗原性好的毒株[A/Chicken/Shanghai/441/2009 (H9N2),簡稱SH441]。初步的交叉保護實驗顯示，該毒株制備的疫苗能夠較好地保護以前和最近的流行毒株的攻擊。利用流感病毒反向遺傳操作技術(shù)，獲得了含有SH441HA、NA和PR8病毒NS2氨基酸突變的以PR8為骨架的重組病毒[簡稱為SH441/PR8 (NS2 E67&74S)病毒](徐大偉，2012年博士論文《H9N2亞型禽流感病毒與鴨坦布蘇病毒生物學(xué)特征研究及疫苗的初步研制》，http://www.doc88.com/p-7864338622047.html)。該重組病毒在細胞上的生長性能比親本毒PR8更好。除了病毒改造外，我們還對培養(yǎng)的細胞進行了優(yōu)化，通過將H5亞型AIV的HA基因插入MDCK細胞的基因組，建立MDCK-HA細胞系(專利號ZL201010106774.4)。由于細胞膜上表達的H5HA蛋白，使該細胞系MDCK-HA增殖產(chǎn)生的子代流感病毒的HAO蛋白，能借用宿主的蛋白酶裂解為HAl和HA2 (是流感病毒具有感染性的前提)。因而，該細胞系能夠很好地支持低致病力流感病毒像高致病力流感病毒(如H5亞型)在細胞上快速增殖，從而達到較高的病毒滴度。在這些基礎(chǔ)下，我們對H9N2亞型禽流感病毒特別是[SH441/PR8 (NS2 E67&74S)]在轉(zhuǎn)瓶上制備方法進行了優(yōu)化并應(yīng)用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種H9N2亞型禽流感病毒的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法，所述的這種H9N2亞型禽流感病毒的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中禽用細胞疫苗中的病毒滴度不高，從而導(dǎo)致免疫的效果不佳的技術(shù)問題。
[0007]本發(fā)明一種H9N2亞型禽流感病毒的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0008]I) 一個培養(yǎng)MDCK-HA細胞的步驟，將MDCK-HA細胞放置于轉(zhuǎn)瓶中，加培養(yǎng)液，將轉(zhuǎn)瓶放置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~22h ；
[0009]2) 一個在MDCK-HA細胞中接種H9N2亞型禽流感病毒的步驟，待轉(zhuǎn)瓶中的細胞長成單層細胞達90 %以上時，棄去培養(yǎng)液，采用PBS溶液洗I~5次，并棄去PBS溶液，接種H9N2亞型禽流感病毒，接種的劑量為8X 104TCID50，在細胞培養(yǎng)箱中孵育I~2小時，每隔10~20分鐘搖動轉(zhuǎn)瓶一次，孵育結(jié)束后，棄去病毒液，采用PBS洗I~5次，再棄去PBS ；
[0010]3)然后加入2% NCS DMEM維持液，所述DMEM維持液的體積為50ml，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48小時，收取細胞上清。
[0011]進一步的，在接種后，每隔15分鐘搖動轉(zhuǎn)瓶。
[0012]進一步的，所述的H9N2亞型禽流感病毒為A/Chicken/Shanghai/441/2009或者A/chicken/Shangdong/A2093/2012。
[0013]進一步的，所述的H9N2亞型禽流感病毒為SH441/PR8(NS2E67&74S)。
[0014] 進一步的，所述的2% NCS DMEM維持液表示每98ML DMEM培養(yǎng)液中再加入2ml的小牛血清。
[0015]本發(fā)明涉及的MDCK-HA細胞系，其分類名稱為:穩(wěn)定表達高致病性禽流感病毒HA蛋白的長耳短尾獵犬腎細胞株MDCK-HA，已于2010年I月8日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(湖北省武漢市武昌珞珈山中國武漢大學(xué)，430072)，保藏編號是CCTCC NO:C200968。
[0016]MDCK-HA細胞系是通過將H5亞型AIV的HA基因插入MDCK細胞的基因組建立的，MDCK-HA細胞系由于細胞膜上表達的H5HA蛋白，使該細胞系MDCK-HA增殖產(chǎn)生的子代流感病毒的HAO蛋白，能借用宿主的蛋白酶裂解為HAl和HA2 (是流感病毒具有感染性的前提)。因而，該細胞系能夠很好地支持低致病力流感病毒如高致病力流感病毒(如H5亞型)在細胞上快速增殖，從而達到較高的病毒滴度。在這些基礎(chǔ)上，本發(fā)明對H9N2亞型禽流感病毒特別是[SH441/PR8(NS2E67&74S)]在轉(zhuǎn)瓶上的培養(yǎng)方法進行了優(yōu)化。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)選用的病毒感染劑量為8X 14TCID5tl，轉(zhuǎn)瓶細胞接毒后，采用2% NCS DMEM維持液培養(yǎng)MDCK-HA細胞擴增病毒，用50ml維持液的終體積培養(yǎng)細胞，收毒時間為接毒后48h后，H9N2亞型禽流感病毒特別是[SH441/PR8 (NS2E67&74S)]病毒在轉(zhuǎn)瓶中的MDCK-HA細胞上增殖良好，且細胞上清的血凝效價能達到212，滿足疫苗候選株效價的要求。
[0017]本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進步是顯著的。禽用細胞疫苗由于無法像人用一樣，進行高成本的濃縮，所以細胞疫苗中的病毒滴度不高，從而免疫的效果不佳，導(dǎo)致禽用疫苗的市場化的失敗。本發(fā)明采用了 MDCK-HA細胞系，而且對在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)過程中的條件進行了優(yōu)化，可以使得H9N2亞型禽流感病毒特別是[SH441/PR8 (NS2 E67&74S)]快速增殖，從而達到較高的病毒滴度，提高了免疫效果。病毒滴度基本上與雞胚的滴度相一致，突破了重要的研究瓶頸，從而為市場化創(chuàng)造了良好的基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1顯示pMX-HA重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖。
[0019]圖2表達H5HA的細胞系的免疫熒光圖。其中，左圖為表達H5HA的細胞系的熒光圖，而右圖為對照細胞。
[0020]圖3顯示MDCK-HA細胞系Western blot鑒定。其中，M:蛋白預(yù)染Marker ;1:正常MDCK的總蛋白；2 =MDCK 一 HA細胞的總蛋白。
[0021]圖4顯示PCR檢測MDCK-HA細胞系中的HA的轉(zhuǎn)錄。其中M =DNAMarker ；1:MDCK-HA細胞的總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板擴增HA片段。
[0022]圖5顯示H9N2病毒增殖結(jié)果。
[0023]圖6A — 6D分別顯示使用本發(fā)明的MDCK細胞系進行流感病毒增殖實驗所得到的結(jié)果。其中，圖6A顯示的是PR8的增殖結(jié)果；圖6B顯示的是H3N1病毒的增殖結(jié)果；圖6C顯示的是H4N1的增殖結(jié)果；圖6D顯示的是H10N8的增殖結(jié)果。
[0024]圖7顯示了 SH441/PR8 (NS2E67&74S)和野生毒SH441在MDCK-HA上的生長曲線。
[0025]圖8顯示了免疫疫苗后的HI抗體水平。

【具體實施方式】
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[0026]I 材料
[0027]1.1細胞、菌種和質(zhì)粒
[0028]本實驗所需要的MDCK-HA細胞，293T細胞、JM109感受態(tài)、載體PBD和病毒PR8反向遺傳操作系統(tǒng)、H9N2亞型禽流感病毒[A/chicken/Shanghai/441/2009 (H9N2)]都由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所水禽流感實驗室提供。
[0029]1.2SPF 雞胚
[0030]實驗所需的SPF雞胚均購自北京梅莉亞公司。
[0031]1.3主要試劑
[0032]脂質(zhì)體2000，Opt1-MEM購自Invitrogen公司；DMEM培養(yǎng)液購自GIBCO公司；小牛血清、胎牛血清購自加拿大的PAA Laboratories Inc ；Pryobest DNA聚合酶購自寶生物公司;TPCK-Trypsin 購自 Sigma 公司。
[0033]實施例1SH441/PR8(NS2E67&74S)突變病毒的拯救與驗證
[0034]1、重組質(zhì)粒PBD-NSE67/74S的構(gòu)建
[0035]PR8病毒株NS2基因突變:以帶有PR8NS基因的質(zhì)粒(參考中國獸醫(yī)科學(xué)，2010,40:788))為模板，利用 Pyrobest DNA 聚合酶(TakaRa)，用 Sap1-NS-F、PR8-NS2_204R和PR8-NS2-193F、Sap1-NS-R(表1)分別進行PCR擴增。獲得的兩條PCR產(chǎn)物I和2，割膠純化。以上述兩條PCR純化產(chǎn)物為模板，用Sap1-NS-F和Sap1-NS-R(表1)進行PCR擴增，獲得PCR產(chǎn)物3。將純化的PCR產(chǎn)物3和PBD載體分別用BSPQI (NEB)酶切，然后將兩者連接，轉(zhuǎn)化于JM109感受態(tài)細胞。挑取陽性菌，抽提質(zhì)粒。經(jīng)PCR鑒定疑似陽性的重組質(zhì)粒PBD-NS2E67/74S，送公司進行測序驗證。
[0036]測序結(jié)果表明，PBD-NSE67/74S質(zhì)粒上的NS2氨基酸序列僅第67位和第74位同時發(fā)生了預(yù)期的突變，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。表1拯救病毒及鑒定所用的引物
[0037]

【權(quán)利要求】
1.一種H9N2亞型禽流感病毒的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟: 1)一個培養(yǎng)MDCK-HA細胞的步驟，將MDCK-HA細胞放置于轉(zhuǎn)瓶中，加培養(yǎng)液，將轉(zhuǎn)瓶放置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~22h ； 2)—個在MDCK-HA細胞中接種H9N2亞型禽流感病毒的步驟，待轉(zhuǎn)瓶中的細胞長成單層細胞達90%以上時，棄去培養(yǎng)液，采用PBS溶液洗I~5次，并棄去PBS溶液，接種H9N2亞型禽流感病毒，接種的劑量為8X104TCID50，在細胞培養(yǎng)箱中孵育I~2小時，每隔10~20分鐘搖動轉(zhuǎn)瓶一次，孵育結(jié)束后，棄去病毒液，采用PBS洗I~5次，再棄去PBS ； 3)然后加入2%NCSDMEM維持液培養(yǎng)，所述DMEM維持液的體積為50ml，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48小時，收取細胞上清。
2.如權(quán)利要求1所述的H9N2亞型禽流感病毒的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法，其特征在于，在接種后，每隔15分鐘搖動轉(zhuǎn)瓶。
3.如權(quán)利要求1所述的H9N2亞型禽流感病毒的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的H9N2 亞型禽流感病毒為 A/Chicken/Shanghai/441/2009、或者 A/chicken/Shangdong/A2093/2012。
4.如權(quán)利要求3所述的H9N2亞型禽流感病毒的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的H9N2亞型禽流感 病毒為SH441/PR8(NS2 E67&74S)病毒。
【文檔編號】C12R1/93GK104073470SQ201410306875
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】李澤君, 滕巧泱 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所