一種嗜鹽古菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種嗜鹽古菌(Haloarchaeon?B13-RDX)，其生物保藏信息為CGMCC?No.9210。本發(fā)明公開的嗜鹽古菌用于降解菊酯類農(nóng)藥具有很好的生物活性。
【專利說明】一種嗜鹽古菌及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種嗜鹽古菌，屬于生物科學(xué)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，為了有效防治病蟲害獲得更高的農(nóng)作物產(chǎn)量，農(nóng)藥的使用 量越來越大，由此造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。
[0003] 在這之中，擬除蟲菊酯類（Pyrethroids)農(nóng)藥由于具有性質(zhì)穩(wěn)定，不易光解，無特 殊臭味及安全系數(shù)高，使用濃度低，觸殺作用強(qiáng)，滅蟲速度快，殘效時間長等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)領(lǐng) 域被廣泛的大量使用，但是自然界并無法有效分解該類農(nóng)藥殘留，其廣泛應(yīng)用對生態(tài)環(huán)境 產(chǎn)生了不良影響，時有發(fā)生引起人的急慢性中毒事件。因此尋找能夠有效消除環(huán)境中的擬 除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留的方法已成為農(nóng)藥領(lǐng)域迫切需要解決的問題之一。
[0004] 在這個問題上，由于生物菌種能夠通過自身的生命代謝活動降解環(huán)境中的有 毒、有害物質(zhì)，在有害物質(zhì)降解領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。迄今為止，研究人員已從土壤、污 泥、污水、天然水體、垃圾場和廄肥中分離到降解不同農(nóng)藥的活性微生物，已有的這些 微生物主要集中在降解有機(jī)磷和除草劑方面，對上述的菊酯類農(nóng)藥很少涉及。盡管在 傳統(tǒng)的菌株分離中也發(fā)現(xiàn)了假單胞菌屬（Pseudomonas)、芽孢桿菌屬（Bacillus)、鞘 氨醇單胞菌屬（Sphingomonas)、沙雷氏菌屬（Serratia)、腸桿菌屬（Enterobacter)、 氣單胞菌屬（Aeromonas)、歐文氏菌屬（Erwinia)、耶爾森菌屬（Yersinia)、寡養(yǎng)單胞 菌屬（Stenotrophomonas)、克雷伯菌屬（Klebsiella)、無色桿菌屬（Achromobacter)、 產(chǎn)堿桿菌（Alcaigebes)、酸單胞菌屬（Acidomonas)、弗拉特氏菌屬（Frateuria)、微 球菌屬（Micrococcus)、庫特氏菌屬（Kurthia)、中華根瘤菌屬（Sinorhizbium);真菌 5 屬：曲霉菌（Aspergillus)、木霉菌屬（Trichoderma)、白腐菌屬（Phanerochaete)、 鐮孢霉屬（Fusarium sp.)、毛鏈孢屬（Monilpchaetes);放線菌5屬：鏈輪絲菌屬 (StreptoverticiIlium baldacci)、鏈霉菌屬（Strepomyces)、諾卡氏菌屬(Nocardia Trevisan)、紅球菌屬（Rhodococcus)、戈登氏菌屬（Gordonia)等菌株對降解降解擬除蟲菊 酯類農(nóng)藥具有一定的效果，但這些菌株均存在講解效率較低、耐藥性較差的缺陷，實(shí)用價值 不大，無法滿足大規(guī)模農(nóng)業(yè)應(yīng)用的需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 在長期的研究中， 申請人:從羅布泊不同地區(qū)不同地點(diǎn)的區(qū)域考查采樣，從各類干 鹽湖中分離篩選出一批嗜鹽古菌，并欣喜的發(fā)現(xiàn)其中的1株以溴氰菊酯，聯(lián)苯菊酯，甲氰菊 酯等菊酯類農(nóng)藥作為碳源可以生長的嗜鹽古菌對菊酯類農(nóng)藥具有非常理想的降解能力和 耐藥性。基于上述發(fā)現(xiàn)， 申請人:完成了本發(fā)明。
[0006] 首先，本發(fā)明公開了一種嗜鹽古菌，分類命名為Haloarchaeon sp. B13-RDX，其保 藏單位名稱為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝 陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2014年2月24日，保藏編 號為 CGMCC No. 9210。
[0007] 申請人:進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)研究顯示，該菌株對常見的菊酯類農(nóng)藥，包括但不限于溴氰菊 酯，聯(lián)苯菊酯，甲氰菊酯等，具有不低于95%的降解率，并且在農(nóng)藥濃度高達(dá)100-200mg/L 的情況下降解率依舊保持在80%以上，適于大規(guī)模使用用于降解菊酯類農(nóng)藥殘留。
[0008] 其次，由于本發(fā)明的嗜鹽古菌具有上述優(yōu)越的生物活性，因此本發(fā)明相應(yīng)公開了 該嗜鹽古菌在降解菊酯類農(nóng)藥中的應(yīng)用。
[0009] 其中，上述的降解菊酯類農(nóng)藥包括但不限于聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯或溴氰菊酯，除了 這幾種常見品種以外，其它的菊酯類農(nóng)藥也可采用本發(fā)明的菌株進(jìn)行降解。
[0010]為了最優(yōu)化上述菌種的生物活性，上述嗜鹽古菌優(yōu)選在CM液體培養(yǎng)基中振蕩培 養(yǎng)然后再接種到含有菊酯類農(nóng)藥的CM液體培養(yǎng)基中。
[0011] 其中，為了平衡菌株生長所需碳源和菌株生長量對降解率的影響， 申請人:廣泛研 究了多種接種量（質(zhì)量計(jì)）與最終降解率之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在接種量為4%時，降解率能夠 達(dá)到95% ;繼續(xù)提高接種量則會因?yàn)槲⑸飻?shù)量增加，導(dǎo)致生長所需的碳源不足，影響了菌 株的活性，使得降解率出現(xiàn)下降，因此優(yōu)選的，接種量為4%。
[0012] 同時， 申請人:還研究了不同濃度的菊酯類農(nóng)藥對菌株降解菊酯類農(nóng)藥的降解 率的影響， 申請人:發(fā)現(xiàn)隨著濃度升高降解率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，當(dāng)菊酯類農(nóng)藥濃度在 100-200mg/L時，降解率均在80%以上；當(dāng)濃度在100mg/L及以下時，降解率可達(dá)到95%以 及更高的水平。因此，優(yōu)選的，所述菊酯類農(nóng)藥濃度不高于200mg/L，更優(yōu)選其為100mg/L。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1、2分別為本發(fā)明嗜鹽菌B13-RDX菌株的革蘭氏染色圖片、電子顯微鏡照片 (X 10000)；
[0014] 圖3為采用鄰接法基于本發(fā)明菌株的16S rRNA序列構(gòu)建的發(fā)育系統(tǒng)樹；
[0015] 圖4為3種菊酯類農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)色譜圖，其中1.聯(lián)苯菊酯；2.甲氰菊酯；3.溴氰 菊酯異構(gòu)體；4.溴氰菊酯；
[0016] 圖5為菌株B13-RDX生長和農(nóng)藥降解率的關(guān)系曲線；
[0017] 圖6為不同的接種量對B13-RDX降解3種農(nóng)藥性能的影響；

【具體實(shí)施方式】
[0018] 在下述實(shí)施例中，涉及的原料包括：
[0019] 1. 1菌株樣品：樣品的采集和處理從新疆羅布泊地區(qū)不同距離和不同生態(tài)點(diǎn)，根 據(jù)不同的植被和土壤，挑選樣區(qū)，分別采集土樣裝入無菌離心管內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，于4°C保存。
[0020] 1. 2培養(yǎng)基：CM培養(yǎng)基（complex medium, CM)，常規(guī)生物菌種培養(yǎng)基，各廠商出 產(chǎn)的此類培養(yǎng)基組成大體相同，略有差異，但不影響培養(yǎng)基的活性。典型的組成如下： Casamino acid(Difco)酪蛋白氨基酸 7.5g/L，Yeast extract(Difco)酵母抽提物 10.0g/ L，檸檬酸三鈉 3. 0g/L，MgS04 ·7Η20 20. 0g/L，KCl 2. 0g/L，F(xiàn)eCl2 ·6Η20 10ppm，NaCl 200. 0g/ L, pH 7. 0-7. 2 ；
[0021] 牛奶-鹽-瓊脂培養(yǎng)基（1)脫脂牛奶150ml，8磅20min滅菌；（2)無機(jī)鹽溶液30ml， 8磅30min滅菌，包括MgS0 4 · 7H20 3g，NaCl 60g，KN03 0. 6g，微量檸檬酸鐵；（3)瓊脂溶液 120ml，8 鎊 30min 滅菌，包括 Casamino acid(Difco) 1. 5g，甘油 3g，瓊脂 4. 5g。無菌操作將 ⑵和（3)混勻，用NaOH調(diào)pH至7· 0,然后混入⑴搖勻。
[0022] 1. 3主要菊酯類農(nóng)藥試劑：10%聯(lián)苯菊酯，2. 5 %溴氰菊酯，20 %甲氰菊酯購自新 疆烏魯木齊北站農(nóng)產(chǎn)品市場。溴氰菊酯，聯(lián)苯菊酯，甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品購自天津一方科 技有限公司，濃度為l〇〇ug/ml。
[0023] 實(shí)施例1 :嗜鹽古菌Haloarchaeon B13-RDX的分離
[0024] 首先進(jìn)行菌株的分離：采用倍比稀釋法涂布，37°C光照培養(yǎng)7d，挑去平板上的菌 落，在平板上反復(fù)劃線直到菌落的顏色、大小、形態(tài)完全一致，記錄菌落形態(tài)；將純化的菌 落在平板上于4°C保存。牛奶-鹽-瓊脂平板上觀察單菌落的形態(tài)特征及顏色。
[0025] 然后進(jìn)行菌株的篩選：在l〇〇ml的CM液體培養(yǎng)基中分別加入聯(lián)苯菊酯、溴氰菊酯、 甲氰菊酯，使其最終濃度為l〇〇mg/L，以4%的量接種，37°C，180r mirT1振蕩培養(yǎng)4d，樣品平 行2組。
[0026] 其中3種農(nóng)藥的含量測定方法為添加農(nóng)藥的培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)4天后，取1ml加入 5ml帶刻度的試管中，加入3ml正己烷，振蕩5分鐘后，靜置分層后，吸取2ml上清液加入少 量的分析純無水Na 2S04脫水，氣相色譜測定結(jié)果換算為培養(yǎng)液中的農(nóng)藥濃度（ml/L)。
[0027] 降解率=(1-降解菌處理后的擬除蟲菊酯農(nóng)藥濃度/對照組擬除蟲菊酯農(nóng)藥濃 度）X100%。
[0028] 氣相色譜條件：6890-N氣相色譜儀（美國安捷倫科技公司）。進(jìn)樣口 ：200°C，檢 測器：320°C，柱溫 150°C (2min)6°C/min - 270°C (保持 23min)，分流比 10 : 1，速率 lml/ min，色譜柱：HP-5,柱長：30mX0· 32mmX0· 25um。
[0029] 最后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用移液槍準(zhǔn)確的吸取1. 0ml聯(lián)苯菊酯，甲氰菊酯，溴氰 菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液（l〇〇ug/ml)置于10ml容量瓶中，用正己烷定容至刻度，搖勻，配成lO.Oug/ ml的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后再用正己烷逐級稀釋配置為弄濃度為0. 020ug/ml，0. 050ug/ml， 0· 10ug/ml，0. 20ug/ml，0. 50ug/ml，1. 0ug/ml，2. 0ug/ml 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取 lu 1 進(jìn)樣， 以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[1°]。
[0030] 混合標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（圖4)繪制采用上述方法混合及其稀釋3種供試農(nóng)藥其檢測分 離情況、保留時間，標(biāo)準(zhǔn)色譜圖。
[0031] 實(shí)施例2 :嗜鹽古菌Haloarchaeon B13-RDX的種屬鑒定
[0032] 菌株的鑒定分別采用如下方法：
[0033] a采用傳統(tǒng)的鑒定方法，檢測各種生理生化指標(biāo)及其酶學(xué)特征檢測。
[0034] b采用擴(kuò)增、測定16SrRNA序列，通過檢索GenBank數(shù)據(jù)庫鑒定到屬。
[0035] c菌株16SrRNA基因序列測定提取菌株的總DNA，然后使用下述引物【正向： 5' -ATTCCGGTTGATCCTGC-3，，反向：5，-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3，】擴(kuò)增菌株 16SrRNA 基因。PCR反應(yīng)條件為50yL反應(yīng)體系30個循環(huán)；變性：94°C，45s ;退火：50°C，45s ;延伸： 72。。，90s。
[0036] 將菌株的16S rRNA序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的嗜鹽菌16S rRNA序列作比 較，采用Clustalw2.0軟件包進(jìn)行多序列匹配排列，其中形成的缺口用中性元素填補(bǔ)。用 PHYLIP程序包中的DNAdist程序計(jì)算進(jìn)化距離，根據(jù)"Kimura雙參數(shù)"方式，通過序列數(shù)據(jù) 計(jì)算矩陣距離，然后使用Neighbor-joining方法，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹估算。
[0037] 實(shí)施例3 :嗜鹽古菌Haloarchaeon B13-RDX的降解特性研究
[0038] 首先考慮菌株生長曲線與擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解率的關(guān)系：
[0039] 將降解菌B13-RDX接種在CM液體培養(yǎng)基里，37°C，180r min-1振蕩培養(yǎng)4d，按 4%的接菌量轉(zhuǎn)接入含有100mg/L聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯的CM液體培養(yǎng)基中，37 °C， 180r mirT1振蕩培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h、96h測定0D600nm時菌株生長量，以及氣相色譜 檢測24h、48h、72h、96h降解菌B13-RDX對3種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的降解率。
[0040] 然后研究菌株的接種量與擬除蟲菊酯類農(nóng)藥降解率的關(guān)系：
[0041] 將降解菌B13-RDX接種在CM液體培養(yǎng)基里37°C，180r min-1振蕩培養(yǎng)4d，分別按 4%、8 %、12%、16%的量轉(zhuǎn)接入含有100mg/L聯(lián)苯菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯的CM液體培養(yǎng) 基中，37°C，180r mirT1振蕩培養(yǎng)，4d后氣相色譜檢測農(nóng)藥含量。
[0042] 最后進(jìn)行了菌株對農(nóng)藥耐受能力的檢測：
[0043] 將降解菌 B13-RDX 分別點(diǎn)接于含有 100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L 聯(lián)苯菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯的CM瓊脂培養(yǎng)基，37°C，培養(yǎng)4-7d觀察是否生長。
[0044] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下所述：
[0045] 1.將嗜鹽古菌Haloarchaeon B13-RDX在牛奶固體培養(yǎng)基平板上厭氧光照培養(yǎng) 5d，形成黃色的圓形菌落，邊緣整齊光滑。經(jīng)鑒定，B13-RDX的生理生化特征為：革蘭氏染色 陰性，桿狀，V-P反應(yīng)陰性，不能利用淀粉，H 2S反應(yīng)，明膠檢測，酯酶檢測，過氧化氫酶，硝酸 鹽還原均為陽性。
[0046] 2.從該菌16S rRNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3)上看，菌株B13-RDX與鹽紅菌屬 Haloarchaeon分在同一類群中，序列同源性為95%。根據(jù)生物學(xué)領(lǐng)域的通常認(rèn)知，16S rRNA基因序列同源性低于98%，可以認(rèn)為屬于不同種，同源性小于93% -95%，可認(rèn)為屬于 不同屬。因此基于系統(tǒng)發(fā)育樹和16S rRNA同源性角度，菌株B13-RDX是鹽紅菌屬中的一個 新成員， 申請人:將其命名為新疆羅布泊嗜鹽古菌HaloarchaeonB13-RDX。
[0047] 3、本實(shí)施例所采用方法的線性范圍與檢出限
[0048] 取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 μ 1進(jìn)樣測定，以待測物峰面積對其濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表 1〇
[0049] 由該結(jié)果可看出，3種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在0. 02 μ g/ml?2. 0 μ g/ml范圍內(nèi)呈良 好的線性關(guān)系（r為0. 99808?0. 99859)。
[0050] 表1標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限
[0051]

【權(quán)利要求】
1. 一種嗜鹽古菌（Haloarchaeon B13-RDX)，其生物保藏信息為CGMCC No.9210。
2. 權(quán)利要求1所述嗜鹽古菌在降解菊酯類農(nóng)藥中的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述降解菊酯類農(nóng)藥為聯(lián)苯菊酯、甲氰菊 酯或溴氰菊酯。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述嗜鹽古菌在CM液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng) 然后接種到含有菊酯類農(nóng)藥的CM液體培養(yǎng)基中。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于接種量為4%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于菊酯類農(nóng)藥濃度不高于200mg/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于菊酯類農(nóng)藥濃度為100mg/L。
【文檔編號】C12N1/20GK104195062SQ201410250126
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】迪麗拜爾·托乎提, 買熱帕提阿依, 迪麗烏孜·安尼瓦爾, 旭格拉, 趙和平, 周宇光, 米麗班·霍加艾合買提 申請人:迪麗拜爾·托乎提, 新疆師范大學(xué)