一種與小麥面粉水溶劑保持力關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記及分子標(biāo)記方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種與小麥面粉水溶劑保持力關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記及分子標(biāo)記方法，所述分子標(biāo)記是以小麥基因組DNA為底物，以gwm642-1D為SSR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的擴(kuò)增片段，用于檢測小麥面粉水溶劑保持力的特性，該標(biāo)記不同的等位變異能夠解釋該性狀表型變異的10.57-15.68％，其中，分子量大小為202bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的提高具有增效作用，分子量大小為188bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的降低具有增效作用。本申請為小麥面粉水溶劑保持力在品質(zhì)育種中的分子標(biāo)記輔助選擇提供一條可行的途徑。
【專利說明】一種與小麥面粉水溶劑保持力關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記及分子標(biāo)記 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種與小麥面粉水溶劑保持力關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記及分子標(biāo)記方法，屬于 作物遺傳育種學(xué)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 1994年美國Nabisco餅干公司的小麥粉及烘焙專家Slade和Levine提出了軟質(zhì) 小麥品質(zhì)評價(jià)的新方法-溶劑保持力（solvent retention capacity,簡稱SRC)，該方法 于1999年通過了美國谷物化學(xué)協(xié)會(huì)（AACC)的認(rèn)定，編號(hào)為AACC 56-11。該方法以含水量 14%的面粉為基準(zhǔn)，經(jīng)過離心后，面粉所保持溶劑質(zhì)量占面粉干重的百分比作為溶劑保持 能力（SRC)。用于檢測的溶劑分為4種，主要有蒸餾水、5%碳酸鈉溶液、5%乳酸溶液以及 50%蔗糖溶液，其中碳酸鈉 SRC與面粉中破損淀粉數(shù)量相關(guān)，乳酸SRC值與麥谷蛋白特性有 關(guān)，蔗糖SRC則與戊聚糖特性有關(guān)，而水SRC受面粉中所有成分的影響，其數(shù)值大小可以反 映面粉的綜合特性。通過4種SRC檢測，則可以反映面粉更多的理化特性，從而能夠更好地 推斷面粉的烘焙特性?，F(xiàn)SRC在美國已成為評價(jià)軟麥品質(zhì)的主導(dǎo)方法。
[0003] 面粉的不同品質(zhì)特性均可以通過不同的SRC得到反映，其中面粉的面筋特性可以 通過乳酸SRC值大小來評價(jià)，在一定范圍內(nèi)，乳酸SRC值越高則表明軟麥的面筋特性越好； 醇溶蛋白的特性可以通過蔗糖SRC值得到反映，在一定范圍內(nèi)，蔗糖SRC值低則醇溶蛋白特 性好；破損淀粉的數(shù)量則可以通過碳酸鈉 SRC值大小來評價(jià)，其值低則表示破損淀粉含量 也較低；而水SRC受面粉中全部成分的影響，反映了面粉組分的綜合特性。因?yàn)轱灨蔀榈退?分含量的烘焙食品，因此要求原料面粉具有較低的吸水率、淀粉破損率和戊聚糖含量，SRC 檢測則正好彌補(bǔ)了餅干測試的某些不足之處，為餅干品質(zhì)的評價(jià)提供了更多的面粉品質(zhì)特 性信息。
[0004] 關(guān)于SRC值在軟麥（主要是餅干粉）評價(jià)中的指標(biāo)的確定，張岐軍研究后認(rèn)為根 據(jù)我國弱筋小麥特點(diǎn)，其適宜的SRC值范圍為：水SRC、碳酸鈉 SRC、蔗糖SRC和乳酸SRC值 分別為彡53 K 66 K 87 %和77. 9 %?85. 1 %，其中與AACC方法劃分標(biāo)準(zhǔn)較為接近的 為水SRC、碳酸鈉 SRC、蔗糖SRC，而乳酸SRC則與之相反。
[0005] Guttieri等研究結(jié)果表明SRC在不同品種間（即基因型間）差異顯著，Guttieri 和Souza等對Vanna/Penawawa, Kantol07/ID0488和M2/ID0470等3個(gè)軟麥組合重組自交系 后代群體的研究表明基因型是影響SRC值的主要因素。張岐軍等研究結(jié)果也表明影響SRC 值的主要因素為基因型，除個(gè)別指標(biāo)外，基因型X環(huán)境間互作對SRC影響均不顯著，因此與 蛋白含量作為弱筋小麥的品質(zhì)選擇指標(biāo)相比以SRC值來篩選弱筋品種則更為可靠。夏云祥 研究結(jié)果表明決定SRC值的主要因素仍是基因型，不同環(huán)境對WSRC影響較小。
[0006] 在小麥SRC值的QTL定位研究方面，N. Smith和E. Souza 2008年利用187個(gè)選自 美國軟麥實(shí)驗(yàn)室資源庫的品種，采用關(guān)聯(lián)分析的方法定位了分別與碳酸鈉 SRC、乳酸SRC、 鹿糖SRC、餅干直徑等相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記barc98、gwm429、barc010和barclOl等，這些標(biāo)記 均位于2B染色體上。馬慶利用寧7840/Clark的重組自交系群體材料進(jìn)行了 SRC的QTL定 位研究，在染色體5DS上發(fā)現(xiàn)了 1個(gè)與WSRC相關(guān)的QTL，在?、6D染色體上定位出2個(gè)與乳 酸SRC相關(guān)的QTL，加性效應(yīng)分別為4. 7和-5. 4,各自解釋了 11. 5 %和15. 2 %的表型變異。 在4D染色體上發(fā)現(xiàn)與碳酸鈉 SRC相關(guān)的QTL 1個(gè)，加性效應(yīng)1. 4,貢獻(xiàn)率為12. 2 %。在染色 體5A和?上分別發(fā)現(xiàn)與蔗糖SRC相關(guān)的QTL各1個(gè)，這兩個(gè)QTL的加性效應(yīng)分別為-2. 84 和2. 71，各自解釋15. 9%和9. 9%的表型變異。
[0007] 利用關(guān)聯(lián)分析的方法進(jìn)行SRC的QTL關(guān)聯(lián)定位研究國內(nèi)尚未見報(bào)導(dǎo)。
[0008] 盡管SRC檢測所需儀器設(shè)備比較簡單、操作也很方便，但目前在品種遺傳改良中 主要還是用于種質(zhì)資源的篩選方面，尚未有育成品種的報(bào)導(dǎo)。由于水SRC能夠綜合反映面 粉的特性，而且具有易操作等特點(diǎn)，在江蘇里下河地區(qū)農(nóng)科所的高世代小麥品系檢測中已 經(jīng)開始使用。由于小麥品質(zhì)育種的特殊性，往往需要在種子收獲后再根據(jù)有關(guān)理化指標(biāo)的 檢測來進(jìn)行選擇，無法在試驗(yàn)田間就對育種早世代材料進(jìn)行直接選擇，而且在回交或滾動(dòng) 回交育種中則必須根據(jù)籽粒測定結(jié)果進(jìn)行選擇后再于下季進(jìn)行配組，嚴(yán)重影響育種進(jìn)度， 因此如果能篩選出穩(wěn)定可靠的溶劑保持力（SRC)分子標(biāo)記并且在育種中加以應(yīng)用將會(huì)促 進(jìn)弱筋小麥育種效率的提1?。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種與小麥面粉水溶劑保持力關(guān)聯(lián)的分子標(biāo) 記及分子標(biāo)記方法，為小麥面粉水溶劑保持力在品質(zhì)育種中的分子標(biāo)記輔助選擇提供一條 可行的途徑。
[0010] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種與小麥面粉水溶劑保持力關(guān)聯(lián)的 分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記是以小麥基因組DNA為底物，以gwm642-lD為SSR引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增所得的擴(kuò)增片段，用于檢測小麥面粉水溶劑保持力的特性，該標(biāo)記不同的等位變異能 夠解釋該性狀表型變異的10. 57-15. 68%，其中，分子量大小為202bp的條帶對小麥面粉水 溶劑保持力的提高具有增效作用，分子量大小為188bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的 降低具有增效作用。
[0011] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種與小麥面粉水溶劑保持力關(guān)聯(lián)的 分子標(biāo)記方法，包括：
[0012] (l)PCR 反應(yīng)體系為：總計(jì) 10μ 1，包括 4ng/y 1 模板 DNA，lXPCRbuffer，2mmol/ LMg2+，0· 2 μ mol/L 熒光引物，25mmol/LdNTP，0· 6U/μ 1 Taq-DNATaq DNA 聚合酶；
[0013] (2)擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，前兩個(gè)循環(huán)94°C變性45s，65°C退火45s，72°C 延伸55s，隨后每兩個(gè)循環(huán)退火溫度降2°C，直至55°C，保持退火溫度55°C擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)， 最后72°C延伸lOmin，然后降至4°C保存；
[0014] (3)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入3倍體積的無水乙醇沉淀，用70%乙醇洗 滌，然后溶解于30 μ 1無離子水中，用DNA測序儀ABI3730進(jìn)行分析，通過GeneMapper3. 0 進(jìn)行擴(kuò)增條帶的讀取。其中分子量大小為202bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的提高具 有增效作用，分子量大小為188bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的降低具有增效作用。
[0015] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。
[0016] 進(jìn)一步，所述分子標(biāo)記的上游引物序列如SEQ ID NO. 1所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 2 所示。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：
[0018] 1、由于溶劑保持力是通過小麥?zhǔn)斋@后籽粒來檢測面粉的特性，在育種中難以在田 間直接篩選，而與溶劑保持力相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記可以利用葉片盡早進(jìn)行DNA檢測來預(yù)測和篩 選；
[0019] 2、本發(fā)明通過關(guān)聯(lián)分析定位了與面粉水溶劑保持力極顯著相關(guān)聯(lián)的SSR分子 標(biāo)記gwm642_lD(位于roder發(fā)表的小麥遺傳連鎖圖1D的75cM處，參考文獻(xiàn)：R0der MS, Korzun V, ffendehake K, Plaschke J, Tixier MH, Leroy P, Ganal MW. A microsatellite map of wheat. Genetics, 1998,149 (4) :2007-2023)，可以解釋水溶劑保持力表型變異的 10. 57-15. 68%，檢測程序簡單，適于雜交和回交育種中目的（供體）單株的確定，提高選擇 效率。
[0020] 3、本發(fā)明提供了一種與小麥面粉水溶劑保持力極顯著（ρ〈0· 01)相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo) 記，使用的與小麥面粉水溶劑保持力相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記在國內(nèi)外均未有發(fā)表過。利用該標(biāo) 記可對田間植株DNA進(jìn)行小麥面粉溶劑保持力的分子標(biāo)記輔助選擇，從而節(jié)約成本，提高 育種效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為3730DNA測序儀熒光標(biāo)記結(jié)果，gwm642-lD等位變異188bp圖；
[0022] 圖2為3730DNA測序儀熒光標(biāo)記結(jié)果，gwm642-lD等位變異202bp圖；

【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限 定本發(fā)明的范圍。
[0024] 實(shí)驗(yàn)例
[0025] 一、試驗(yàn)材料：
[0026] 試驗(yàn)收集了 190個(gè)品種，在進(jìn)行基因型分析時(shí)根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果剔除了 14個(gè)親緣關(guān)系 過近的品種，實(shí)際用于關(guān)聯(lián)分析的品種清單見表1。
[0027] 表1 :用于分析的176個(gè)品種

【權(quán)利要求】
1. 一種與小麥面粉水溶劑保持力關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記是以 小麥基因組DNA為底物，以gwm642-lD為SSR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的擴(kuò)增片段，用于 檢測小麥面粉水溶劑保持力的特性，該標(biāo)記不同的等位變異能夠解釋該性狀表型變異的 10. 57-15. 68%，其中，分子量大小為202bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的提高具有增 效作用，分子量大小為188bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的降低具有增效作用。
2. -種與小麥面粉水溶劑保持力關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記方法，其特征在于，包括： 1. PCR 反應(yīng)體系為：總計(jì) 10μ 1，包括 4ng/y 1 模板 DNA，lXPCRbuffer，2mmol/LMg2+， 0.2以111〇1/1熒光引物，25111111〇1/1(1階13,0.6"4 1丁&9-0嫩丁&9 0嫩聚合酶； 2) 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，前兩個(gè)循環(huán)94°C變性45s，65°C退火45s，72°C延伸 55s，隨后每兩個(gè)循環(huán)退火溫度降2°C，直至55°C，保持退火溫度55°C擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸lOmin，然后降至4°C保存； 3) 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入3倍體積的無水乙醇沉淀，用70%乙醇洗滌，然后 溶解于30以1無離子水中，用0嫩測序儀41313730進(jìn)行分析，通過661161&^^6『3.0進(jìn)行擴(kuò)增 條帶的讀取。其中分子量大小為202bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的提高具有增效作 用，分子量大小為188bp的條帶對小麥面粉水溶劑保持力的降低具有增效作用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的分子標(biāo)記方法，其特征在于，所述分子標(biāo)記的上游引物序列 如SEQ ID NO. 1所示，下游引物序列如SEQ ID NO. 2所示。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104046627SQ201410249902
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月6日
【發(fā)明者】張勇, 張伯橋, 高德榮, 吳宏亞, 張曉 , 張曉祥, 朱冬梅, 程凱 申請人:江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所