高效利用碳源生產(chǎn)生物塑料phbv的極端嗜鹽古菌工程菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效利用碳源生產(chǎn)PHBV的重組極端嗜鹽古菌。該重組極端嗜鹽古菌是將極端嗜鹽古菌地中海富鹽菌Haloferax?mediterranei基因組中的胞外多糖合成基因簇表達(dá)的至少一種蛋白功能缺失，獲得的胞外多糖合成功能缺失的工程菌。極端嗜鹽古菌由于其不易污染雜菌、PHA提取方便、以非相關(guān)碳源合成PHBV等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是極具優(yōu)勢的PHBV生產(chǎn)菌株。該胞外多糖合成缺陷株工程菌特點(diǎn)是較野生型菌株更高效地利用葡萄糖、淀粉和乳清等多種碳源生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯，在相同的發(fā)酵條件下PHBV的濃度比野生型菌株高20%，同時(shí)解決了胞外多糖積累造成的培養(yǎng)液變粘、大量起泡和溶氧下降等問題。
【專利說明】高效利用碳源生產(chǎn)生物塑料PHBV的極端嗜鹽古菌工程菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯PHBV的極端嗜鹽古菌工程菌。
【背景技術(shù)】
[0002]聚羥基脂肪酸酯是一類由微生物在營養(yǎng)不均衡時(shí)在細(xì)胞體內(nèi)積累的高分子聚酯，作為碳源和能源的儲(chǔ)備物廣泛存在于自然界。由于其具有熱塑性、生物可降解性和生物兼容性，PHA被普遍認(rèn)為是引起白色污染的石化衍生塑料的潛在替代物，可以應(yīng)用于包括日常用品(比如塑料袋，容器)和生物醫(yī)學(xué)材料(比如人造血管，藥物釋放載體)在內(nèi)的多個(gè)領(lǐng)域，且越來越受到科學(xué)界和商業(yè)界的關(guān)注。
[0003]目前，細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)PHA產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的主要是PHB、PHBV和P3HB4HB。PHB在某些性能上與熱塑性塑料相類似 ，力學(xué)性質(zhì)與聚丙烯(PP)相類似。經(jīng)基因工程改造的大腸桿菌菌株VGl (PTU14)利用廉價(jià)的淀粉水解糖做碳源，分批流加培養(yǎng)60小時(shí)，菌濃度可達(dá)216克/升，PHB在菌體內(nèi)的積累量達(dá)細(xì)胞干重的90%。此外，血紅蛋白的過表達(dá)，提高了菌體的攝氧和耐低溶氧的能力；利用裂解基因可控誘導(dǎo)細(xì)胞裂解，釋放出細(xì)胞內(nèi)的PHB。然而，PHB易折裂的缺點(diǎn)卻限制了其應(yīng)用范圍。在PHB中摻入其他單體(如羥基戊酸)可以降低其強(qiáng)度和硬度，材料學(xué)性能有了很大改進(jìn)；但是，生產(chǎn)PHBV過程中丙酸等前體的添加極大的提高了生產(chǎn)成本。
[0004]PHBV是羥基丁酸和羥基戊酸的共聚物，雖然基因工程改造的大腸桿菌也可以通過非相關(guān)碳源合成PHBV，但隨著羥基戊酸組分的增加PHBV的含量也逐漸降低；羥基戊酸組分的摩爾百分含量可達(dá)17.5%，但其PHBV含量只占細(xì)胞干重的12%左右。P3HB4HB作為一種新的PHA材料已經(jīng)受到很大關(guān)注并正在進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。在發(fā)酵過程中添加1，4 丁二醇或gama- 丁酸內(nèi)酯，細(xì)胞體內(nèi)就會(huì)積累P3HB4HB，其中4HB所占的摩爾百分比可控制在0_40%。
[0005]極端嗜鹽古菌是一類依賴高滲透壓環(huán)境生長的極端微生物，其作為PHA的生產(chǎn)菌株具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):高滲的生長環(huán)境可以簡化滅菌過程甚至不用滅菌；對高滲環(huán)境的依賴使菌體在清水中非常容易裂解，從而使PHA的提取安全、簡便。而地中海富鹽菌由于其生長速率較其他極端嗜鹽古菌快，可以利用淀粉、乳清等多種碳源，能夠通過非相關(guān)碳源合成PHBV等優(yōu)點(diǎn)成為極端嗜鹽古菌中最合適的PHA生產(chǎn)菌種。1986年，地中海富鹽菌被報(bào)道可以積累PHA ；1990年，Lillo對培養(yǎng)基的組分及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。隨著其積累的PHA被確定為PHBV(羥基戊酸組分的摩爾百分比最低為10.7%)，地中海富鹽菌又逐漸受到人們的關(guān)注。以處理后的淀粉和米糠(1:8g/g)為碳源，優(yōu)化發(fā)酵工藝，培養(yǎng)大約120個(gè)小時(shí)，PHBV濃度達(dá)到77.8克/升。雖然在一定程度上節(jié)約了碳源的成本，但由于以酵母提取物為氮源，同時(shí)通入了純氧，反而增加了生產(chǎn)的總成本。我們實(shí)驗(yàn)室正在嘗試分別使用廉價(jià)的淀粉和氯化銨做碳源和氮源，同時(shí)在只通入空氣的情況下對PHBV的生產(chǎn)進(jìn)行優(yōu)化。
[0006]地中海富鹽菌在PHBV發(fā)酵生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生多種副產(chǎn)品，如胞外多糖。胞外多糖的合成和積累不僅造成了不必要的碳源浪費(fèi)，而且會(huì)對生產(chǎn)產(chǎn)生一些副作用，包括提高了培養(yǎng)液的黏度、增加了起泡量、降低了溶氧。對于地中海富鹽菌胞外多糖的研究目前僅限于其生產(chǎn)優(yōu)化、理化性質(zhì)、生理功能和組成結(jié)構(gòu)，而在遺傳水平卻沒有報(bào)道。考慮到胞外多糖的合成與PHBV的生產(chǎn)條件比較相似，故在遺傳水平對菌株進(jìn)行改造是必需的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種高效利用碳源生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯PHBV的胞外多糖合成功能缺失的重組極端嗜鹽古菌，及一種極端嗜鹽古菌胞外多糖合成相關(guān)的基因簇。
[0008]本發(fā)明提供的極端嗜鹽古菌胞外多糖合成相關(guān)的基因簇，名稱為eps，來源于地中海富鹽菌Haloferax mediterranei,其保藏編號(hào)為CGMCC 1.2087,其編碼的蛋白質(zhì)為如下
I)-4)所述的蛋白:
[0009]I)由序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)，或者將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列2所示的蛋白相同活性的蛋白質(zhì)；
[0010]和，2)由序列表中序列3所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)，或者將序列表中序列3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列3所示的蛋白相同活性的蛋白質(zhì)；
[0011]和，3)由序列表中序列4所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)，或者將序列表中序列4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列4所示的蛋白相同活性的蛋白質(zhì)；
[0012]和，4)由序列表中序列5所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)，或者將序列表中序列5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列5所示的蛋白相同活性的蛋白質(zhì)。
[0013]所述基因簇的序列為下述脫氧核苷酸之一:
[0014]I)序列表中序列I所示的自5'末端第547-5762位核苷酸序列；
[0015]2)序列表中序列I所示的DNA序列；
[0016]3)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
[0017]4)與1)、2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
[0018]該極端嗜鹽古菌胞外多糖合成的關(guān)鍵基因簇包括一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)編碼區(qū)。序列I中第547-857位核苷酸為啟動(dòng)子區(qū)域，第858-5762位核苷酸為編碼區(qū)。
[0019]所述編碼區(qū)在翻譯水平可以表達(dá)出四種蛋白質(zhì)，在基因組中的編號(hào)依次為HFX2145-2148。序列I中第858-2228位核苷酸為HFX2145的編碼區(qū)，其氨基酸序列如序列2所示；序列I中第2228-3286位核苷酸為HFX2146的編碼區(qū)，其氨基酸序列如序列3所示；序列I中第3283-4308位核苷酸為HFX2147的編碼區(qū)，其氨基酸序列如序列4所示；序列I中第4305-5762位核苷酸為HFX2148的編碼區(qū)，其氨基酸序列如序列5所示。預(yù)測四種蛋白質(zhì)的功能依次是=UDP-N-乙酰葡萄糖胺-6-脫氫酶，長醇磷酸-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶，含有糖基轉(zhuǎn)移酶4-相似結(jié)構(gòu)域蛋白，和多糖合成轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
[0020]擴(kuò)增上述基因簇的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0021]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一類高效利用碳源生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的重組極端嗜鹽古菌工程菌。[0022]本發(fā)明所提供的重組極端嗜鹽古菌，是將出發(fā)極端嗜鹽古菌的基因組中的上述的基因簇表達(dá)的至少一種蛋白功能缺失，獲得的胞外多糖合成功能缺失的工程菌。
[0023]將上述基因簇表達(dá)的至少一種蛋白功能缺失即可以使該極端嗜鹽古菌胞外多糖合成的關(guān)鍵基因簇的功能缺失，從而會(huì)導(dǎo)致胞外多糖合成缺陷。
[0024]所述將出發(fā)極端嗜鹽古菌的基因組中的上述胞外多糖合成功能的基因簇的表達(dá)的至少一種蛋白功能缺失的方法是將所述基因簇中編碼所述功能缺失蛋白的基因突變、或/和基因敲除、和/或基因沉默；優(yōu)選將胞外多糖合成功能的基因簇突變、或/和基因敲除、和/或基因沉默、和/或RNA干擾編碼所述功能缺失蛋白的基因的表達(dá)。
[0025]該極端嗜鹽古菌胞外多糖合成的關(guān)鍵基因簇通過質(zhì)粒或非原位同源重組等方法可以恢復(fù)上述胞外多糖合成缺陷菌株的胞外多糖合成能力。
[0026]所述出發(fā)極端嗜鹽古菌為地中海富鹽菌Haloferax mediterranei ;優(yōu)選為地中海富鹽菌 Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087。
[0027]所述基因敲除是通過同源重組實(shí)現(xiàn)的；所述同源重組所用的上游交換臂的序列為自序列表中序列I的5'端第1-865位核苷酸序列；所述同源重組所用的下游交換臂的序列為自序列表中序列I的5'端第5763-6282位核苷酸序列。
[0028]和/或，所述出發(fā)極端嗜鹽古菌在基因敲除所述基因簇前，先敲除其基因組中序列如序列表中序列6的5'端第810-1607位核苷酸序列片段(pyrF基因)獲得尿嘧啶合成缺陷型菌株，再以所述尿嘧啶缺陷型菌株作為出發(fā)菌株進(jìn)行所述基因簇的敲除，獲得尿嘧啶合成缺陷的胞外多糖合成缺陷型菌株，最后，將序列表中序列6的第810-1607位核苷酸序列片段原位敲回，獲得尿嘧啶合成功能與所述出發(fā)極端嗜鹽古菌相同的胞外多糖合成功能缺失的工程菌。
[0029]pyrF敲除株為尿嘧啶合成缺陷株，利用該菌株可以更快速、有效地做基因敲除實(shí)驗(yàn)，故而以尿嘧啶合成缺陷株出發(fā)；而由于是尿嘧啶合成缺陷株，作為PHA生產(chǎn)菌株在生產(chǎn)上需要加入外源尿嘧啶，故而需要將PyrF基因原位回補(bǔ)，事實(shí)上，回補(bǔ)后的pyrF位點(diǎn)與野生型相同；因此，該方法獲得的工程菌株與用野生型極端嗜鹽古菌直接敲除上述基因簇表達(dá)的蛋白編碼基因或者直接敲除所述基因簇獲得的工程菌株的效果一致。
[0030]上述重組極端嗜鹽古菌可用于生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯(PHBV)。該類胞外多糖合成缺陷株的上述重組極端嗜鹽古菌生產(chǎn)的產(chǎn)物聚羥基脂肪酸酯(PHBV)仍是通過非相關(guān)碳源就可以合成的3-羥基丁酸(3HB)和3-羥基戊酸(3HV)共聚物(PHBV)。
[0031]所述在生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，是發(fā)酵所述的重組極端嗜鹽古菌，得到含有聚羥基脂肪酸酯的菌體細(xì)胞；所述發(fā)酵在發(fā)酵罐中進(jìn)行，溫度32-45 °C，通氣量I: 1-2: lvvm，攪拌隨溶氧的變化手動(dòng)調(diào)節(jié)，pH維持在6.5-7.5，罐體內(nèi)壓為I個(gè)大氣壓。所述發(fā)酵溫度為優(yōu)選為37°C。
[0032]所述發(fā)酵用培養(yǎng)基的組分為氯化鈉110-220克/升，氯化鎂0_10克/升，硫酸鎂2-20克/升，氯化鉀1-5克/升，氯化鈣0-1克/升，碳酸氫鈉0-0.3克/升，溴化鈉0-0.5克/升，酵母提取物0-10克/升，氯化銨1-5克/升，磷酸二氫鉀0.02-4克/升，淀粉10-50克/升，檸檬酸鐵銨0.005-0.01克/升，微量元素溶液SL-6 0.5-2毫升/升；pH值為6.5-7.5 ;所述發(fā)酵用培養(yǎng)基的組分優(yōu)選為氯化鈉110克/升，氯化鎂9.6克/升，硫酸鎂14.4克/升，氯化鉀5克/升，氯化鈣I克/升，碳酸氫鈉0.2克/升，溴化鈉0.375克/升，酵母提取物3克/升，氯化銨2克/升，磷酸二氫鉀0.0375克/升，淀粉20克/升，檸檬酸鐵銨0.008克/升,微量兀素溶液SL-6 I暈升/升；所述微量兀素溶液SL-6的各種組分及其含量為:七水合硫酸鋅I克/升，四水合氯化錳0.3克/升，硼酸3克/升，六水合氯化鈷2克/升，二水合氯化銅0.1克/升，六水合氯化鎳0.2克/升，一水合鑰酸鈉0.3克/升；所述微量元素溶液的PH用鹽酸溶液調(diào)節(jié)至3-4。
[0033]所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法還包括在發(fā)酵前進(jìn)行種子培養(yǎng)其中，所述種子培養(yǎng)基的各個(gè)組分及其濃度為:
[0034]酸水解酪素5-10克/升，酵母提取物5-10克/升，谷氨酸鈉1-2克/升，檸檬酸三鈉3-6克/升，氯化鈉110-220克/升，氯化鎂0-9.6克/升，硫酸鎂2_30克/升，氯化鉀1-5克/升，檸檬酸鐵銨0.005-0.01克/升，微量元素溶液SL-6 0.5-1毫升/升。pH調(diào)節(jié)到 6.5-7.5。
[0035]所述種子培養(yǎng)分為兩級(jí)種子培養(yǎng)；所述種子培養(yǎng)的方法是將所述重組極端嗜鹽古菌單克隆接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3天獲得一級(jí)種子培養(yǎng)液，然后將一級(jí)種子培養(yǎng)液以體積百分含量為2%的接種量接入二級(jí)種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3天獲得二級(jí)種子培養(yǎng)液。
[0036]一級(jí)種子培養(yǎng)基的各個(gè)組分及其濃度為:
[0037]酸水解酪素5克/升，酵母提取物5克/升，谷氨酸鈉I克/升，檸檬酸三鈉3克/升，氯化鈉200克/升，七水合硫酸鎂20克/升，氯化鉀2克/升，檸檬酸鐵銨0.008克/升，微量兀素溶液SL-6 I暈升/升。
[0038]所述一級(jí)種子培養(yǎng)基的pH是7.0-7.2。
[0039]二級(jí)種子培養(yǎng)基的各個(gè)組分及其濃度為:
[0040]酸水解酪素10克/升，酵母提取物10克/升，谷氨酸鈉2克/升，檸檬酸三鈉6克/升，氯化鈉200克/升，七水合硫酸鎂20克/升，氯化鉀2克/升，檸檬酸鐵銨0.008克/升，微量元素溶液SL-6 I毫升/升。所述二級(jí)種子培養(yǎng)基的pH是7.0-7.2。
[0041 ] 所述發(fā)酵過程中，如有需要，可以補(bǔ)加補(bǔ)料培養(yǎng)基。
[0042]所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的各個(gè)組分及其濃度為:
[0043]氯化鈉110-220克/升，氯化鎂0_10克/升，硫酸鎂0_20克/升，氯化鉀0_5克/升，氯化鈣0-1克/升，碳酸氫鈉0-0.3克/升，溴化鈉0-0.5克/升，酵母提取物0-10克/升，氯化銨10-100克/升，磷酸二氫鉀0-1克/升，淀粉200-500克/升，檸檬酸鐵銨
0-0.01克/升,微量兀素溶液SL-6 0-1暈升/升。
[0044]所述發(fā)酵時(shí)，將所述二級(jí)種子培養(yǎng)液接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，二級(jí)種子培養(yǎng)液的接種量為體積百分比為10%的量接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中。
[0045]本發(fā)明提供的這類高效利用碳源生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的極端嗜鹽古菌工程菌是通過遺傳工程改造對胞外多糖合成的關(guān)鍵基因簇實(shí)現(xiàn)了功能缺失的地中海富鹽菌，是胞外多糖合成缺陷株。
[0046]該類胞外多糖合成缺陷株由于胞外多糖合成的關(guān)鍵基因簇的功能缺失，不再具有合成及分泌胞外多糖的能力，從而避免了碳源的浪費(fèi)，同時(shí)解決了胞外多糖積累造成的培養(yǎng)液變粘、大量起泡和溶氧下降等問題。
[0047]利用本發(fā)明提供的這類高效利用碳源生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯PHBV的極端嗜鹽古菌工程菌，在相同的生產(chǎn)條件下聚羥基脂肪酸酯PHBV的濃度比野生型菌株提高20%以上；同時(shí)解決了胞外多糖積累造成的培養(yǎng)液變粘、大量起泡和溶氧下降等問題。利用本發(fā)明提供的聚羥基脂肪酸生產(chǎn)方法，發(fā)酵72小時(shí)，聚羥基脂肪酸酯PHBV的濃度可達(dá)21.28克/升。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0048]圖1為胞外多糖合成關(guān)鍵基因簇及其上下游序列的結(jié)構(gòu)圖及其預(yù)測的功能注釋；圖中，HFX2145預(yù)測功能為UDP-N-乙酰葡萄糖胺_6_脫氫酶；HFX2146預(yù)測功能為長醇磷酸-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶；HFX2147的預(yù)測功能為含有糖基轉(zhuǎn)移酶4-相似結(jié)構(gòu)域蛋白；HFX2148的預(yù)測功能為多糖合成轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
[0049]圖2為pyrF基因及其上下游序列的結(jié)構(gòu)圖
[0050]圖3為比較各個(gè)菌株的菌落形態(tài)(圖3中A)、胞外多糖含量(圖3中B)及胞外多糖樣品中甘露糖基組分(圖3中C)，圖中，(I為Haloferax mediterranei ApyrF, II為Haloferax mediterranei Δ pyrF Δ eps, III為 Haloferax mediterranei Δ pyrF Δ eps::pffL502-eps, IV 為 Haloferax mediterranei ApyrFΔ eps::pffL502, V 為 Haloferaxmediterranei CGMCC L 2087, VI為 Haloferax mediterranei ESlX
[0051]圖4為比較胞外多糖合成關(guān)鍵基因簇敲除株與野生型菌株的真實(shí)細(xì)胞質(zhì)量、PHBV 濃度及總糖濃度，圖中 WT 為 Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087，ESl 為Haloferaxmediterranei ESl0
【具體實(shí)施方式】
[0052]下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0053]下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量
[0054]下述實(shí)施例中所用 的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0055]地中海富鹽菌Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087購自中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)。
[0056]基因敲除和敲入所使用的菌株地中海富鹽菌Haloferax mediterranei Δ pyrF(將地中海富鹽菌Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087中的pyrF基因(自序列6中的5'端第810-1607位核苷酸序列)敲除后獲得的尿嘧啶合成缺失菌株，以方便篩查提高敲除效率)、敲除出發(fā)載體PHFX (含有pyrF基因)、篩選培養(yǎng)基及相關(guān)原理和方法在文獻(xiàn)(Liu, H., J.Han, et al.(2011)."Development of pyrF-based gene knockout systems forgenome-wide manipulation of the archaea Haloferax mediterranei and Haloarculahispanica."Tournal of Genetics and Genomics 38(6):261-269.)公開，公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得。
[0057]基因回補(bǔ)所使用的質(zhì)粒載體pWL502在文獻(xiàn)(Cai，S.，L.Cai，etal.(2012)."Identification of the Haloarchaeal Phasin(PhaP) That Functionsin Polyhydroxyalkanoate Accumulation and Granule Formation in Haloferaxmediterrane1."Applied and Environmental Microbiology 78 (6): 1946-1952.)中公開過，公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得。
[0058]實(shí)施例1、胞外多糖合成關(guān)鍵基因簇的確定及其基因的獲得[0059]基于地中海富鹽菌的全基因組序列和注釋，總結(jié)了全部糖基轉(zhuǎn)移酶。經(jīng)過分析，基因HFX2145-2148被認(rèn)為是可能的胞外多糖合成的關(guān)鍵基因簇(eps)。這四個(gè)基因可能共用一個(gè)啟動(dòng)子，其中，HFX2145涉及前體物質(zhì)UDP-N-乙酰葡萄糖胺酸的生物合成，HFX2146、HFX2147涉及糖基依次轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜載體長醇磷酸，HFX2148涉及三糖單體的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。這四個(gè)編碼基因的結(jié)構(gòu)及上下游基因的排布關(guān)系如圖1所示。
[0060]設(shè)計(jì)一對引物epsFl/epsRl用于對包括胞外多糖合成的關(guān)鍵基因簇(eps)在內(nèi)的核苷酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下:
[0061]epsFl:5’-GCTCTAGACATCGCTTTGGGTCG_3’(Xba T )(與自序歹Il I 的 5’ 端第 544-558匹配)
[0062]epsRl:5’ ~CATGCCATGGCGGTACAGACCCTTTCA~3，(Nco T )(與自序列 I 的 5’ 端第5796-5812 匹配)
[0063]以地中海富鹽菌Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087的基因組為模板,用引物對epsFl/epsRl進(jìn)行擴(kuò)增，得到5269bp長度的PCR產(chǎn)物。
[0064]PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 5min 預(yù)變性；94°C 30s、54°C 30s,68°C 330s 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；68°C延伸7min。擴(kuò)增體系為25μ1。
[0065]將經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xba I和Nco I雙酶切的PCR產(chǎn)物和載體質(zhì)粒pWL502用T4DNA連接酶16°C連接過夜，然后熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)，在含有氨芐青霉素抗性的平板上進(jìn)行篩選，將獲得的陽性克隆進(jìn)行測序。將鑒定正確的上述含有PCR產(chǎn)物的pWL502重組質(zhì)粒命名為pWL502-印S。
[0066]測序結(jié)果表明在質(zhì)粒pWL502中插入的核苷酸序列如序列I中第544-5812位核苷酸所示，其中第547-5762位核苷酸為胞外多糖合成的關(guān)鍵基因簇eps，第547-857位核苷酸為基因簇的啟動(dòng)子區(qū)域，第858-5762位核苷酸為基因簇的編碼區(qū)；編碼區(qū)包括4個(gè)基因，在基因組中的編號(hào)依次為HFX2145-2148。自序列I中的5’第858-2228位核苷酸為HFX2145的編碼區(qū)，其編碼的氨基酸序列如序列2所示；自序列I的5’第2228-3286位核苷酸為HFX2146的編碼區(qū)，其編碼的氨基酸序列如序列3所示；自序列I的5’第3283-4308位核苷酸為HFX2147的編碼區(qū)，其編碼的氨基酸序列如序列4所示；自序列I的5’第4305-5762位核苷酸為HFX2148的編碼區(qū)，其編碼的氨基酸序列如序列5所示。
[0067]實(shí)施例2、胞外多糖合成關(guān)鍵基因簇eps功能的鑒定
[0068]利用基因工程技術(shù)對印s進(jìn)行敲除及回補(bǔ)，通過遺傳學(xué)方法驗(yàn)證其是胞外多糖合成所必需的。
[0069]1、尿嘧啶合成缺陷的胞外多糖合成關(guān)鍵基因簇(印s)敲除株的構(gòu)建
[0070]利用基于pyrF基因的遺傳操作系統(tǒng)，pyrF基因及其上下游序列的結(jié)構(gòu)圖如圖2 所不，以 Haloferax mediterranei ΔpyrF (Haloferax mediterranei ApyrF 為以地中海富鹽菌Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087為出發(fā)菌株，敲除pyrF基因獲得的尿嘧啶合成缺陷菌株，以方便基因敲除與回補(bǔ)的篩選，提高敲除的效率；Liu，H.，J.Han,et al.(2011)."Development of pyrF-based gene knockout systems forgenome-wide manipulation of the archaea Haloferax mediterranei and Haloarculahispanica."Tournal of Genetics and Genomics 38(6):261-269.)為出發(fā)菌株，構(gòu)建尿喃唳合成缺陷的eps敲除株。先構(gòu)建用于敲除eps的整合質(zhì)粒pHFX-Δ eps,再依次經(jīng)同源重組單交換和同源重組雙交換，對獲得的菌株進(jìn)行篩選及驗(yàn)證，即得到目的菌株，具體步驟如下:
[0071]I)敲除eps的整合質(zhì)粒pHFX-Δ eps的構(gòu)建
[0072]根據(jù)序列I中印s編碼區(qū)及其上下游核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)了上、下游交換臂的擴(kuò)增引物 epsF2/epsR2 和 epsF3/epsR3:
[0073]epsF2:5’ -AACTGCAGGAGTGGGTGGTCCTGAAT-3，(Pst T )(與自序列 I 的 5’ 端第
1-18匹配)
[0074]epsR2:5，-TAGTGACAGGTTCAACCACAGGCACGACA-3，(與 epsF2 有 Ilbp 長度的相同序M)(與自序列I的5’端第848-865匹配)
[0075]epsF3:5，-CCTGTGGTTGAACCTGTCACTAGTACAATA-3> (與 epsRl 有 Ilbp 長度的相同序列)(與自序列I的5’端第5763-5781匹配)
[0076]epsR3:5’ ~GGGGTACCTTCCATAAACAACCAC~3，(Kpn T )(與自序列 I 的 5’ 端第6267-6282 匹配)
[0077]以地中海富鹽菌Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087的基因組為模板,用引物對epsF2和epsR2擴(kuò)增敲除eps的上游交換臂865bp(序列為自序列表中序列I的5'端第1-865位核苷酸序列)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 5min預(yù)變性；94°C 30s、54°C 30s,68°C 60s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；68°C延伸7min。擴(kuò)增體系為25 μ I。
[0078]以Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087 的基因組為模板,用引物對 epsF3 和epsR3擴(kuò)增敲除印s的下游交換臂520bp (序列為自序列表中序列I的5'端第5763-6282位核苷酸序列)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94V 5min預(yù)變性；94°C 30s,54°C 30s,68°C 60s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；68°C延伸7min。擴(kuò)增體系為25μ1。
[0079]以回收后的上、下游交換臂產(chǎn)物為模板，用引物對印sF2和印sR3為上、下游引物進(jìn)行銜接PCR,借助epsR2和epsF3交疊的部分序列將上、下游交換臂連接到一起并實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。此片段被命名為Λ印s，長度為1385bp。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 5min預(yù)變性；94°C 30s、54°C 30s,68°C 90s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；68°C延伸7min。擴(kuò)增體系為25 μ I。
[0080]將經(jīng)限制性內(nèi)切酶Pst I和Kpn I雙酶切的PCR產(chǎn)物Λ eps和載體質(zhì)粒pHFX(Liu, H., J.Han, et al.(2011)."Development of pyrF-based gene knockout systems forgenome-wide manipulation of the archaea Haloferax mediterranei and Haloarculahispanica."Tournal of Genetics and Genomics 38(6):261-269.)用 T4DNA 連接酶 16°C連接過夜，然后熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)，在含有氨芐青霉素抗性的平板上進(jìn)行篩選，將獲得的陽性克隆進(jìn)行測序。將經(jīng)測序表明含有Aeps的整合質(zhì)粒命名為pHFX-Λ印S。
[0081]2)單交換菌株的構(gòu)建、篩選及驗(yàn)證
[0082]采用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將整合質(zhì)粒pHFX-Aeps轉(zhuǎn)化Haloferaxmediterranei Δ pyrF,轉(zhuǎn)化后涂布于篩選培養(yǎng)基AS-168SY (所述篩選培養(yǎng)基AS-168SY各種組分及其含量為:酸水解酪素5.0g/L、谷氨酸鈉1.0g/L、檸檬酸鈉3.0g/L、NaCl 200g/L、MgSO4.7H20 20g/L、KCl 2.0g/L、FeSO4.7H20 0.36g/L、MnCl2.4H20 0.36mg/L ;所述篩選培養(yǎng)基AS-168SY的pH值為7.1)固體平板，37°C培養(yǎng)4天左右。能在該固體培養(yǎng)基上正常生長的單克隆為單交換菌株。[0083]單交換菌株的驗(yàn)證:
[0084]根據(jù)序列I中eps編碼序列，設(shè)計(jì)一對位于eps內(nèi)部的擴(kuò)增引物epsF4和epsR4(604bp),用于對單交換菌株進(jìn)行PCR驗(yàn)證:
[0085]epsF4:5’ -ATTATCCTACTTACACCCAAAC-3’(與自序列 I 的 5’ 端 3735-3756 匹配)
[0086]epsR4:5’ -TTGAAGCTAAATCCGTGA-3’(與自序列 I 的 5’ 端 4321-4338 匹配)
[0087]以待驗(yàn)證單交換菌株的基因組為模板，分別用引物對epsF2和印sR3和引物對epsF4和印sR4進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 5min預(yù)變性；94°C 30s,54 °C 30s、72°C 90s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。擴(kuò)增體系為25μ1。若兩對引物都能擴(kuò)增出相應(yīng)大小的片段(即epsF2和印sR3能擴(kuò)增出1385bp長度的片段且epsF4和印sR4能擴(kuò)增出604bp長度的片段)，則證明此菌株為單交換菌株。
[0088]3)雙交換菌株的構(gòu)建、篩選及驗(yàn)證
[0089]將步驟2)篩選到的單交換菌株在液體添加終濃度50微克/毫升的尿嘧啶的篩選培養(yǎng)基AS-168SY中傳代培養(yǎng)50代，將培養(yǎng)液稀釋IO7涂布于添加終濃度50微克/毫升尿嘧啶和250微克/毫升5-F0A的篩選培養(yǎng)基AS-168SY固體平板，37°C培養(yǎng)4天左右。挑取單克隆劃線于添加終濃度50微克/毫升尿嘧啶和250微克/毫升5-F0A的篩選培養(yǎng)基AS-168SY固體平板，在該固體平板上能正常生長的單克隆為雙交換菌株。
[0090]雙交換菌株驗(yàn)證:
[0091]以待驗(yàn)證雙交換菌株的基因組為模板，分別用引物對epsF2/印sR3和印sF4/epsR4 進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?MV 5min 預(yù)變性；94°C 30s,54°C 30s,72°C 90s 進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。擴(kuò)增體系為25 μ I。若印sF2和印sR3能擴(kuò)增出1385bp長度的片段，而epsF4和印sR4不能擴(kuò)增出604bp長度的片段，則證明此菌株為雙交換菌株。
[0092]經(jīng)驗(yàn)證的雙交換菌株即為尿喃唳合成缺陷的eps敲除株，被命名為Haloferaxmediterranei ΔpyrF Δ eps。
[0093]2、胞外多糖合成的關(guān)鍵基因簇印s經(jīng)由質(zhì)?；匮a(bǔ)
[0094]將eps經(jīng)由pyrF作為篩選基因的具有自主復(fù)制能力的質(zhì)粒pWL502回補(bǔ),驗(yàn)證eps的功能。先構(gòu)建用于回補(bǔ)eps的整合質(zhì)粒pWL502_eps,將其轉(zhuǎn)化到尿喃唳合成缺陷的eps敲除株Haloferax mediterranei Δ pyrF Δ eps中，經(jīng)篩選及驗(yàn)證，即得到目的菌株，具體步驟如下:
[0095]1)回補(bǔ)eps的整合質(zhì)粒pWL502_eps的構(gòu)建
[0096]將實(shí)施例1中經(jīng)測序表明含有eps的整合質(zhì)粒命名為pWL502_印S，此整合質(zhì)粒即可用于eps的回補(bǔ)。
[0097]2)回補(bǔ)菌株的構(gòu)建及篩選
[0098]采用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將整合質(zhì)粒pWL502_eps轉(zhuǎn)化Haloferaxmediterranei Δ pyrF Δ eps,轉(zhuǎn)化后涂布于篩選培養(yǎng)基AS-168SY固體平板，37°C培養(yǎng)4天左右。在該固體培養(yǎng)基上能正常生長的單克隆為回補(bǔ)菌株?；匮a(bǔ)菌株命名為Haloferaxmediterranei Δ pyrF Δ eps::pWL502_epso
[0099]作為回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的對照，空的質(zhì)粒pWL502轉(zhuǎn)化Haloferax mediterranei八？7!^八印8，轉(zhuǎn)化后涂布于篩選培養(yǎng)基八3-1683丫固體平板，37 °C培養(yǎng)4天左右。在該固體培養(yǎng)基上能正常生長的單克隆為回補(bǔ)對照菌株?；匮a(bǔ)對照菌株命名為Haloferaxmediterranei Δ pyrF Δ eps::pWL502o
[0100]3、胞外多糖合成能力的檢測
[0101]通過菌落形態(tài)的觀察、胞外多糖濃度的測定和甘露糖組分的檢測這三個(gè)層面確定待檢測菌株是否具有胞外多糖合成的能力。
[0102]I)菌落形態(tài)的觀察
[0103]將待觀察的菌株劃線于篩選培養(yǎng)基AS-168SY固體平板上(Haloferaxmediterranei ApyrF和 Haloferax mediterranei Δ pyrF Δ eps 的生長區(qū)域在劃線前涂布終濃度50微克/毫升的尿嘧啶)，37°C培養(yǎng)4天，即可對菌落形態(tài)進(jìn)行觀察。
[0104]2)胞外多糖的生產(chǎn)與樣品的回收
[0105]將待測菌株由單克隆接種到液態(tài)篩選培養(yǎng)基AS-168SY (培養(yǎng)Haloferaxmediterranei Δ pyrF 和 Haloferax mediterranei Δ pyrF Δ eps 的培養(yǎng)基添加終濃度 50微克/暈升的尿卩密唳)中，37°C培養(yǎng)3天,此為種子液；分別將種子液以4%的接種量接種到 EPS 高產(chǎn)培養(yǎng)基(培養(yǎng) Haloferax mediterranei Δ pyrF 和 Haloferax mediterraneiΔ pyrF Δ eps的培養(yǎng)基添加終濃度50微克/毫升的尿嘧啶)中，37°C培養(yǎng)60小時(shí)。培養(yǎng)液經(jīng)兩次10000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，然后經(jīng)0.22微米孔徑的濾器過濾以完全除去菌體。所得處理后的培養(yǎng)液上清即為胞外多糖樣品。
[0106]所述EPS高產(chǎn)培養(yǎng)基的各種組分及其含量為:30%的人工鹽水833毫升/升，葡萄糖10克/升，氯化銨I克/升，磷酸二氫鉀0.15克/升，檸檬酸鐵銨0.008克/升，微量元素溶液SL-6 I毫升/升；所述 EPS高產(chǎn)培養(yǎng)基的pH值為7.0-7.2，并另加15.1克/升PIPES (哌嗪-N-N’ -二(2-乙磺酸))緩沖EPS生產(chǎn)過程中pH的變化。
[0107]所述30%人工鹽水的各種組分及其含量為:氯化鈉240克/升，六水合氯化鎂30克/升，七水合硫酸鎂35克/升，氯化鉀7克/升，二水合氯化鈣0.5克/升；所述30%人工鹽水用濃度為I摩爾/升，pH為7.5的Tris鹽酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至7.5。
[0108]所述微量元素溶液SL-6的各種組分及其含量為:七水合硫酸鋅I克/升，四水合氯化錳0.3克/升，硼酸3克/升，六水合氯化鈷2克/升，二水合氯化銅0.1克/升，六水合氯化鎳0.2克/升，一水合鑰酸鈉0.3克/升；所述微量元素溶液的pH用鹽酸溶液調(diào)節(jié)至 3-4。
[0109]3)蒽酮比色法測定胞外多糖樣品中總糖的含量
[0110]培養(yǎng)液上清經(jīng)I X IO5分子量的透析袋在蒸餾水中透析四次，每次6小時(shí)。透析后的胞外多糖樣品用蒽酮比色法測定總糖的含量。
[0111]所述蒽酮比色法測定總糖含量的具體步驟為:
[0112]取7支大試管，分別加入100微克/毫升的糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2,0.4,0.6,0.8、1.0、
1.2、1.4毫升，以蒸餾水補(bǔ)充體積到2毫升；另取I支大試管加入2毫升蒸餾水，作為空白對照。加4毫升蒽酮試劑，搖勻，沸水浴加熱15分鐘，冰水冷卻后在625納米波長處測出光密度值。以糖濃度為橫坐標(biāo)，0D625為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取稀釋到一定濃度的待測樣品溶液2毫升，加4毫升蒽酮試劑，搖勻，沸水浴加熱15分鐘，冰水冷卻后在625納米波長處測出光密度值。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總糖含量。
[0113]所述糖標(biāo)準(zhǔn)溶 液是精確稱取10毫克無水葡萄糖(于80°C烤箱內(nèi)干燥恒重)，以蒸餾水定容到100毫升。[0114]所述蒽酮試劑是精確稱取100毫克蒽酮，以硫酸定容到100毫升。
[0115]4)離子色譜法檢測甘露糖基組分
[0116]取透析后的胞外多糖樣品4毫升，加入濃鹽酸I毫升，于120°C水解4小時(shí)。將鹽酸和蒸餾水用水泵抽干后，用5毫升雙蒸水完全溶解殘余物質(zhì)。取I毫升雙蒸水重新溶解的水解糖溶液，于1.5毫升離心管中旋轉(zhuǎn)抽干，用100微升雙蒸水溶解殘余物質(zhì)。將1/10體積雙蒸水重新溶解的濃縮水解糖溶液經(jīng)0.22微米孔徑的濾器過濾后用高效陰離子色譜法檢測甘露糖，以此代表胞外多糖中甘露糖基組分。以甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液作為對照。
[0117]所述高效陰離子色譜法使用的色譜柱是CarboPac PAl陰離子交換分離柱，使用的樣品檢測器為脈沖安培檢測器。
[0118]所述高效陰離子色譜法的操作流程如下:200毫摩爾/升氫氧化鈉溶液以I毫升/分鐘的流速清洗色譜柱20分鐘，15毫摩爾/升氫氧化鈉溶液以I毫升/分鐘的流速平衡色譜柱20分鐘，10微升待測樣品經(jīng)由上樣環(huán)上樣并進(jìn)入色譜柱，15毫摩爾/升氫氧化鈉溶液以I毫升/分鐘的流速洗脫色譜柱20分鐘。甘露糖的出峰時(shí)間為13.5分鐘左右。
[0119]所述甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液是精確稱取10毫克無水甘露糖(于80°C烤箱內(nèi)干燥恒重)，以蒸餾水定容到100毫升。
[0120]結(jié)果如圖3 所不，Haloferax mediterranei Δ pyrF 的菌落較 Haloferaxmediterranei Δ pyrF Δ eps 濕潤且光滑，暗不 Haloferax mediterranei ApyrFAeps 可能失去了胞外多糖合成及分泌的能力；胞外多糖濃度的測定和甘露糖基組分的檢測證明了Haloferax mediterranei Δ pyrF Δ eps完全喪失了合成及分泌胞外多糖的能力。將整合質(zhì)粒pWL502_eps轉(zhuǎn)化到Haloferax mediterranei Δ pyrF Δ eps中可以恢復(fù)胞外多糖合成和分泌的能力，而空的質(zhì)粒PWL502卻不可以。以上的基因敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明了預(yù)測的胞外多糖合成的關(guān)鍵基因簇eps是胞外多糖合成必需的。
[0121]實(shí)施例3、不依賴外源添加尿嘧啶生長的eps敲除株的構(gòu)建
[0122]尿卩密唳合成缺陷的eps敲除株Haloferax mediterranei Δ pyrF Δ eps由于依賴外源添加的尿嘧啶，即便可以高效利用碳源生產(chǎn)PHBV，卻難以作為工業(yè)生產(chǎn)的菌株，所以有必要原位回補(bǔ)其缺失基因pyrF。
[0123]1、尿嘧啶合成缺陷菌株缺失基因pyrF的原位敲入
[0124]利用基于pyrF基因的遺傳操作系統(tǒng)，以Haloferax mediterranei Δ pyrF Δ eps為出發(fā)菌株，原位敲入缺失的基因pyrF，構(gòu)建不依賴外源添加尿嘧啶的eps缺失突變株。先構(gòu)建用于原位敲入PyrF的整合質(zhì)粒pT-pyrFr,再依次經(jīng)同源重組單交換和同源重組雙交換，對獲得的菌株進(jìn)行篩選及驗(yàn)證，即得到目的菌株，具體步驟如下:
[0125]I)原位敲入pyrF的整合質(zhì)粒pT-pyrFr的構(gòu)建
[0126]根據(jù)序列6中pyrF編碼序列及其上下游核苷酸序列，設(shè)計(jì)了一對包括pyrF編碼區(qū)和上、下游交換臂的擴(kuò)增引物pyrFFl/pyrFRl:`
[0127]pyrFFl:5’ ~GGGGTACCCGACGATGCGTGGCTGTA~3，(Kpn T )(與自序列 6 的 5’ 端第2533-2550 匹配)
[0128]pyrFRl: 5 ’-ACATGCATGCCGCCTTGTTCCTTCTGTAGACT-3 ’ (Sph I )(與自序列 6 的 5’端第77-98匹配)
[0129]以Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087 的基因組為模板，用引物對 pyrFFl/pyrFRl擴(kuò)增pyrF編碼區(qū)和上、下游交換臂。此片段被命名為pyrFr，長度為2474bp。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94°C5min 預(yù)變性；94°C 30s、54°C 30s、68°C 180s 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；68°C延伸 7min。擴(kuò)增體系為25 μ I。
[0130]將經(jīng)限制性內(nèi)切酶Kpn I和Sph I雙酶切的PCR產(chǎn)物pyrFr和載體質(zhì)粒pUCm_T(購自生工生物工程(上海)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為SK2211)用T4DNA連接酶16°C連接過夜，然后熱激轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)，在含有氨芐青霉素抗性的平板上進(jìn)行篩選，將獲得的陽性克隆進(jìn)行測序。將經(jīng)測序表明含有pyrFr的整合質(zhì)粒命名為pT-pyrFrο
[0131]2)單交換菌株的構(gòu)建、篩選及驗(yàn)證
[0132]采用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，將pT-pyrFr轉(zhuǎn)化Haloferaxmediterranei Δ pyrF Δ eps,轉(zhuǎn)化后涂布于篩選培養(yǎng)基AS-168SY固體平板,37°C培養(yǎng)4天左右。在該固體培養(yǎng)基上能正常生長的單克隆為單交換菌株。
[0133]單交換菌株的驗(yàn)證: [0134]根據(jù)序列6 (pyrF基因編碼區(qū)和上下游基因的核苷酸序列)中pyrF編碼序列及其上下游核苷酸序列，設(shè)計(jì)了兩對位于上、下游交換臂外部且產(chǎn)物盡量小的擴(kuò)增引物pyrFF2/pyrFR2(1482bp)和 pyrFF3/pyrFR3 (869bp):
[0135]pyrFF2:CGCTCAACAGTATCTGGTGGC (與自序列 6 的 5’ 端第 2738-2758 匹配)
[0136]pyrFR2:CGTCGTCAAGCAGGTTCG (與自序列 6 的 5’ 端第 1277-1294 匹配)
[0137]pyrFF3:GACAAGGCTGCGGGACA (與自序列 6 的 5’ 端第 853-869 匹配)
[0138]pyrFR3:GGGGTCAAGTCAAGGGTAATC (與自序列 6 的 5’ 端第 1-21 匹配)
[0139]以待驗(yàn)證單交換菌株的基因組為模板，分別用引物對pyrFF2/pyrFR2和pyrFF3/pyrFR3 進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?MV 5min 預(yù)變性；94°C 30s,54°C 30s,72°C 120s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。擴(kuò)增體系為25 μ I。若兩對引物中任一對引物能擴(kuò)增出相應(yīng)大小的片段(即pyrFF2/pyrFR2能擴(kuò)增出1482bp長度的片段或pyrFF3/pyrFR3能擴(kuò)增出869bp長度的片段)，則證明此菌株為單交換菌株。
[0140]3)雙交換菌株的構(gòu)建、篩選及驗(yàn)證
[0141]將步驟2)篩選到的單交換菌株在液體篩選培養(yǎng)基AS-168SY中傳代培養(yǎng)50代，將培養(yǎng)液稀釋IO7再次涂布于篩選培養(yǎng)基AS-168SY固體平板，37°C培養(yǎng)4天左右。挑取單克隆劃線于篩選培養(yǎng)基AS-168SY固體平板。
[0142]雙交換菌株驗(yàn)證:
[0143]以待驗(yàn)證雙交換菌株的基因組為模板，分別用引物對pyrFF2/pyrFR2和pyrFF3/pyrFR3 進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 5min 預(yù)變性；94°C 30s、54°C 30s,72°C 120s 進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7min。擴(kuò)增體系為25 μ I。若兩對引物都能擴(kuò)增出相應(yīng)大小的片段(即pyrFF2/pyrFR2能擴(kuò)增出1482bp長度的片段且pyrFF3/pyrFR3能擴(kuò)增出869bp長度的片段)，則證明此菌株為雙交換菌株。
[0144]經(jīng)驗(yàn)證的雙交換菌株即為不依賴外源添加尿卩密唳的eps敲除株Haloferaxmediterranei Δ eps,被命名為Haloferax mediterranei ESI。該胞外多糖合成關(guān)鍵基因簇敲除株Haloferax mediterranei ESl仍依賴于高滲透壓環(huán)境,在清水中容易裂解；細(xì)胞仍成桿狀，能夠利用多種碳源生長，具有很強(qiáng)的淀粉水解及應(yīng)用能力；在固體培養(yǎng)基上形成粉紅色菌落，但菌落表面變得干燥、褶皺；適宜培養(yǎng)溫度為25-50°C，最適宜培養(yǎng)溫度為450C ;適宜培養(yǎng)pH值為中性，最適宜pH為7.0-7.2。
[0145]2、胞外多糖合成能力的檢測
[0146]檢測得到的工程菌株Haloferax mediterranei ESl是否因?yàn)閜yrF基因的原位敲入影響到胞外多糖合成缺陷的性狀。
[0147]通過菌落形態(tài)的觀察、胞外多糖濃度的測定和甘露糖組分的檢測確定其胞外多糖合成的能力，具體步驟可參照實(shí)施例1中第4部分。
[0148]結(jié)果如圖3所示，pyrF基因的原位敲入不會(huì)影響到工程菌株Haloferaxmediterranei ESl的胞外多糖合成缺陷的性狀。
[0149]實(shí)施例4、工程菌株與野生菌株生產(chǎn)PHBV的比較研究
[0150]1、用于PHBV生產(chǎn)的培養(yǎng)基組分、發(fā)酵條件及工藝流程
[0151]I)種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基的配制
[0152]一級(jí)種子培養(yǎng)基的各個(gè)組分及其濃度為:
[0153]酸水解酪素5克/升，酵母提取物5克/升，谷氨酸鈉I克/升，檸檬酸三鈉3克/升，氯化鈉200克/升，七水合硫酸鎂20克/升，氯化鉀2克/升，檸檬酸鐵銨0.008克/升，微量兀素溶液SL-6 I暈升/升。
[0154]所述一級(jí)種子培養(yǎng)基的pH是7.0-7.2。
各個(gè)組分及其濃度為:
[0156]酸水解酪素10克/升，酵母提取物10克/升，谷氨酸鈉2克/升，檸檬酸三鈉6克/升，氯化鈉200克/升，七水合硫酸鎂20克/升，氯化鉀2克/升，檸檬酸鐵銨0.008克/升，微量兀素溶液SL-6 I暈升/升。
[0157]所述二級(jí)種子培養(yǎng)基的pH是7.0-7.2。
[0158]發(fā)酵培養(yǎng)基的各個(gè)組分及其濃度為:
[0159]氯化鈉110克/升，氯化鎂9.6克/升，硫酸鎂14.4克/升，氯化鉀5克/升，氯化鈣I克/升，碳酸氫鈉0.2克/升，溴化鈉0.375克/升，酵母提取物3克/升，氯化銨2克/升，磷酸二氫鉀0.0375克/升，淀粉20克/升，檸檬酸鐵銨0.008克/升，微量元素溶液SL-6 I暈升/升。
[0160]補(bǔ)料培養(yǎng)基的各個(gè)組分及其濃度為:
[0161]氯化鈉129克/升，氯化銨45.45克/升，淀粉500克/升。
[0162]所述一級(jí)種子培養(yǎng)基、二級(jí)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基于8磅蒸汽壓力條件下濕熱滅菌30分鐘。
[0163]2)菌種活化和種子培養(yǎng)
[0164]將地中海富鹽菌的兩個(gè)菌株Haloferax mediterranei ESl和地中海富鹽菌Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087由單克隆接種到一級(jí)種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3天，此為一級(jí)種子液；將一級(jí)種子液以2% (體積百分含量)的接種量分別接種到二級(jí)種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3天，此為二級(jí)種子液。二級(jí)種子液作為發(fā)酵罐的種子液。
[0165]3) PHBV的發(fā)酵生產(chǎn)
[0166]將地中海富鹽菌的菌株Haloferax mediterranei ESl 二級(jí)種子液和地中海富鹽菌Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087的二級(jí)種子液以10% (體積百分比)的接種量分別接種到裝有4升發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，進(jìn)行PHBV的發(fā)酵生產(chǎn)。發(fā)酵生產(chǎn)的條件為:溫度37°C ;用2M鹽酸溶液或2M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH穩(wěn)定在6.95-7.05范圍內(nèi)；通氣量
1.25: lvvm，攪拌隨溶氧的變化手動(dòng)調(diào)節(jié)以維持兩個(gè)發(fā)酵罐中的溶氧都較適宜為宜；罐體內(nèi)壓為I個(gè)大氣壓；發(fā)酵過程產(chǎn)生的氣泡通過消泡電極的感應(yīng)控制消泡劑蠕動(dòng)泵的攪動(dòng)，從而加入消泡劑；發(fā)酵時(shí)間72小時(shí)。發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)行到第28小時(shí)，補(bǔ)料液以10.5毫升/小時(shí)的速率恒速加入發(fā)酵液，至發(fā)酵結(jié)束。
[0167]所述消泡劑是10毫升聚氧丙烯聚氧乙烯丙三醇醚(商品名稱為泡敵)溶解于體積濃度為20%的乙醇水溶液。
[0168]2、相關(guān)參數(shù)的的檢測及分析
[0169]在發(fā)酵過程中，從二級(jí)種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基的時(shí)刻(即第O小時(shí))開始每8個(gè)小時(shí)取100毫升左右的培養(yǎng)液，用于對發(fā)酵液中各個(gè)參數(shù)進(jìn)行檢測，從而作出分析。
[0170]I)菌體的回收及PHBV的測定
[0171]取50毫升培養(yǎng)液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，傾倒干凈上清，將離心管和殘留在底部的菌體于_70°C冷凍過夜。將裝有冷凍菌體的離心管迅速放到真空冷凍干燥器中冷凍抽干。抽干后的菌體稱量總重，計(jì)算細(xì)胞干重(即每升培養(yǎng)液中的干菌體質(zhì)量);干菌體經(jīng)研磨均勻后稱取70毫克左右，置于酯化管中，加入2毫升酯化液(3毫升濃硫酸溶解于97毫升色譜純的甲醇中，并精確稱取0.1克苯甲酸溶于其中作為內(nèi)標(biāo)用于定量)和2毫升氯仿，混勻后于100°C烤箱中酯化4小時(shí)。酯化反應(yīng)后的樣品冷卻至室溫，加入I毫升雙蒸水，混勻后室溫靜置至水相和氯仿相分層清晰(一般要兩個(gè)小時(shí)以上)。用氣相色譜法檢測氯仿相(下層)中丁酸甲酯和戊酸甲酯的含量，二者分別代表PHBV中羥基丁酸和羥基戊酸的含量；以標(biāo)準(zhǔn)品(商品購得)做對照，計(jì)算PHBV濃度(即每升培養(yǎng)液中的PHBV總質(zhì)量)。細(xì)胞真實(shí)質(zhì)量比細(xì)胞干重更能說明菌 體的生長情況。結(jié)合細(xì)胞干重，計(jì)算細(xì)胞真實(shí)質(zhì)量(即細(xì)胞干重減去PHBV濃度)。
[0172]2)殘余總糖的測定
[0173]取I毫升培養(yǎng)液經(jīng)兩次10000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘完全除去菌體，將培養(yǎng)液上清稀釋到一定倍數(shù)，用蒽酮比色法測定培養(yǎng)液上清中殘余總糖的含量。殘余總糖的含量接近淀粉濃度。所述蒽酮比色法的具體步驟可參照實(shí)施例1中第4部分的步驟2)。
[0174]結(jié)果如圖4 所不，Haloferax mediterranei ESl 和 Haloferax mediterraneiCGMCC1.2087具有相同的生長速率，胞外多糖合成途徑的切斷并沒有對碳源的吸收及利用產(chǎn)生反饋抑制；在Haloferax mediterranei ESl中，本來用于胞外多糖合成的碳源由于胞外多糖合成缺陷流向了包括PHBV合成的其他代謝通路。用Haloferax mediterranei ESl發(fā)酵生產(chǎn)PHBV，發(fā)酵72小時(shí)，PHBV在發(fā)酵液中的濃度達(dá)到21.28克/升；在相同的發(fā)酵條件下 PHBV 的濃度比 Haloferax mediterranei CGMCC 1.2087 (17.80 克 / 升)提高 20%。
【權(quán)利要求】
1.極端嗜鹽古菌胞外多糖合成相關(guān)的基因簇，其編碼的蛋白質(zhì)為如下1)-4)所述的蛋白: O由序列表中序列2所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)，或者將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列2所示的蛋白相同活性的蛋白質(zhì) 和，2)由序列表中序列3所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)，或者將序列表中序列3的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列3所示的蛋白相同活性的蛋白質(zhì)； 和，3)由序列表中序列4所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)，或者將序列表中序列4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列4所示的蛋白相同活性的蛋白質(zhì)； 和，4)由序列表中序列5所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)，或者將序列表中序列5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列5所示的蛋白相同活性的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因簇，其特征在于:所述基因簇的序列為下述脫氧核苷酸之一: 1)序列表中序列I所示的自5'末端第547-5762位核苷酸序列； 2)序列表中序列I所示的DNA序列； 3)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列I限`定的DNA序列雜交的核苷酸序列。 4)與1)、2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
3.擴(kuò)增權(quán)利要求1或2所述基因簇的引物對。
4.一種重組極端嗜鹽古菌，是將其出發(fā)極端嗜鹽古菌的基因組中的如權(quán)利要求1或2所述的基因簇表達(dá)的至少一種蛋白的功能缺失，獲得的胞外多糖合成功能缺失的工程菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組嗜鹽古菌，其特征在于:所述出發(fā)極端嗜鹽古菌為地中海富鹽菌 Haloferax mediterranei ;優(yōu)選為地中海富鹽菌 Haloferax mediterraneiCGMCC1.2087。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組嗜鹽古菌，其特征在于:所述將出發(fā)極端嗜鹽古菌的基因組中的權(quán)利要求1或2所述的基因簇表達(dá)的至少一種蛋白的功能缺失的方法是將所述基因簇中編碼所述蛋白的基因突變、或/和基因敲除、和/或基因沉默、RNA干擾其表達(dá)轉(zhuǎn)錄；優(yōu)選將權(quán)利要求1或2所述的基因簇突變、或/和基因敲除、和/或基因沉默、和/或RNA干擾基因簇中編碼所述蛋白的基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組嗜鹽古菌，其特征在于:所述基因敲除是通過同源重組實(shí)現(xiàn)的；所述同源重組所用的上游交換臂的序列為自序列表中序列I的5'端第1-865位核苷酸序列；所述同源重組所用的下游交換臂的序列為自序列表中序列I的5'端第5763-6282位核苷酸序列； 和/或，所述出發(fā)極端嗜鹽古菌在基因敲除所述基因簇前，先敲除其基因組中序列如序列表中序列6的5'端第810-1607位核苷酸序列片段獲得尿嘧啶合成缺陷型菌株，再以所述尿嘧啶缺陷型菌株作為出發(fā)菌株進(jìn)行所述基因簇的敲除，獲得尿嘧啶合成缺陷的胞外多糖合成缺陷型菌株，最后，將序列表中序列6的5'端第810-1607位核苷酸序列片段原位敲回，獲得尿嘧啶合成功能與所述出發(fā)極端嗜鹽古菌相同的胞外多糖合成功能缺失的工程菌。
8.權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的重組極端嗜鹽古菌在生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述在生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法，是發(fā)酵權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的重組極端嗜鹽古菌，得到含有聚羥基脂肪酸酯的菌體細(xì)胞；所述發(fā)酵在發(fā)酵罐中進(jìn)行，溫度32-45°C，通氣量1: 1-2: lvvm，攪拌隨溶氧的變化手動(dòng)調(diào)節(jié)，pH維持在6.5-7.5，罐體內(nèi)壓為I個(gè)大氣壓；所述發(fā)酵溫度為優(yōu)選為37°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述發(fā)酵用培養(yǎng)基的組分為氯化鈉.110-220克/升，氯化鎂0-10克/升，硫酸鎂2-20克/升，氯化鉀1_5克/升，氯化鈣0_1克/升，碳酸氫鈉0-0.3克/升，溴化鈉0-0.5克/升，酵母提取物0-10克/升，氯化銨1-5克/升，磷酸二氫鉀0.02-4克/升，淀粉10-50克/升，檸檬酸鐵銨0.005-0.01克/升，微量元素溶液SL-6 0.5-2毫升/升；pH值為6.5-7.5 ;所述發(fā)酵用培養(yǎng)基的組分優(yōu)選為氯化鈉110克/升，氯化鎂9.6克/升，硫酸鎂14.4克/升，氯化鉀5克/升，氯化鈣I克/升，碳酸氫鈉0.2克/升，溴化鈉0.375克/升，酵母提取物3克/升，氯化銨2克/升，磷酸二氫鉀0.0375克/升，淀粉20克/升，檸檬酸鐵銨0.008克/升，微量元素溶液SL-6 I毫升/升; 和/或，所述生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的方法還包括在發(fā)酵前進(jìn)行菌種活化和種子培養(yǎng)；其中，所述種子培養(yǎng)基的各個(gè)組分及其濃度為: 酸水解酪素5-10克/升，酵母提取物5-10克/升，谷氨酸鈉1-2克/升，檸檬酸三鈉.3-6克/升，氯化鈉110-220克/ 升，氯化鎂0-9.6克/升，硫酸鎂2_30克/升，氯化鉀1_5克/升，檸檬酸鐵銨0.005-0.01克/升，微量元素溶液SL-6 0.5-1毫升/升。pH調(diào)節(jié)到.6.5-7.5 ； 和/或，所述種子培養(yǎng)分為兩級(jí)種子培養(yǎng)；所述種子培養(yǎng)的方法是將所述重組極端嗜鹽古菌單克隆接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3天獲得一級(jí)種子培養(yǎng)液，然后將一級(jí)種子培養(yǎng)液以體積百分含量為2%的接種量接入二級(jí)種子培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)3天獲得二級(jí)種子培養(yǎng)液； 一級(jí)種子培養(yǎng)基的各個(gè)組分及其濃度為: 酸水解酪素5克/升，酵母提取物5克/升，谷氨酸鈉I克/升，檸檬酸三鈉3克/升，氯化鈉200克/升，七水合硫酸鎂20克/升，氯化鉀2克/升，檸檬酸鐵銨0.008克/升，微量兀素溶液SL-6 I暈升/升；所述一級(jí)種子培養(yǎng)基的pH是7.0-7.2 ； 二級(jí)種子培養(yǎng)基的各個(gè)組分及其濃度為: 酸水解酪素10克/升，酵母提取物10克/升，谷氨酸鈉2克/升，檸檬酸三鈉6克/升，氯化鈉200克/升，七水合硫酸鎂20克/升，氯化鉀2克/升，檸檬酸鐵銨0.008克/升，微量元素溶液SL-6 I毫升/升；所述二級(jí)種子培養(yǎng)基的pH是7.0-7.2 ； 和/或，所述發(fā)酵過程中，補(bǔ)加補(bǔ)料培養(yǎng)基；所述補(bǔ)料培養(yǎng)基的各個(gè)組分及其濃度為:氯化鈉110-220克/升，氯化鎂0-10克/升，硫酸鎂0-20克/升，氯化鉀0_5克/升，氯化鈣0-1克/升，碳酸氫鈉0-0.3克/升，溴化鈉0-0.5克/升，酵母提取物0-10克/升，氯化銨10-100克/升，磷酸二氫鉀0-1克/升，淀粉200-500克/升，檸檬酸鐵銨0-0.01克/升，微量兀素溶液SL-6 0-1暈升/升； 所述微量元素溶液SL-6的各種組分及其含量為:七水合硫酸鋅I克/升，四水合氯化錳0.3克/升，硼酸3克/升，六水合氯化鈷2克/升，二水合氯化銅0.1克/升，六水合氯化鎳0.2克/升，一水合鑰酸鈉0.3克/升；所述微量元素溶液的pH用鹽酸溶液調(diào)節(jié)至3-4 ； 和/或，所述發(fā)酵時(shí)，將所述二級(jí)種子培養(yǎng)液接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，二級(jí)種子培養(yǎng)液的接種量為體積百分比為 10%的量接種于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中。
【文檔編號(hào)】C12P7/62GK103451201SQ201210181052
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年6月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月4日
【發(fā)明者】向華, 趙大賀 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所