專(zhuān)利名稱(chēng)：一種與PHBV的3-HV單體合成相關(guān)的β-酮硫解酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種極端嗜鹽古菌中與可降解材料PHBV的3-HV單體合成相關(guān)的 β-酮硫解酶的研究與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
許多原核生物包括細(xì)菌和某些極端嗜鹽古菌，在碳源過(guò)量，氮、磷、硫、氧等元素限制的培養(yǎng)條件下，胞內(nèi)可以積累聚羥基脂肪酸酯(PHA)。PHA是一類(lèi)由3-羥基脂肪酸(3ΗΑ) 組成的生物聚酯，主要作為碳源、能源及還原力的貯藏性物質(zhì)。PHA具有與傳統(tǒng)的石油化工塑料如聚乙烯、聚丙烯相類(lèi)似的物化性質(zhì)，并且它具有可完全生物降解和利用可再生資源合成的特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種環(huán)境友好型的“生物可降解塑料”，可以從一定程度上緩解石油塑料引起的“白色污染”問(wèn)題。PHA目前已知的應(yīng)用領(lǐng)域包括可生物降解包裝材料，手術(shù)縫合線(xiàn)、藥物釋放載體、聚合物支架等醫(yī)用材料以及其手性單體在藥物合成過(guò)程中的應(yīng)用等。在各種PHA中，由于生產(chǎn)成本的限制，目前只有PHB (聚羥基丁酸酯)與PHBV(聚羥基丁酸羥基戊酸酯)在細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)了半商業(yè)化的生產(chǎn)。PHB是PHA家族中最簡(jiǎn)單、研究最透徹的成員。盡管其性質(zhì)類(lèi)似于熱塑性塑料，但是PHB具有易碎、熱穩(wěn)定性不高、可塑性和機(jī)械性能較差等缺點(diǎn)，因而限制了它的廣泛應(yīng)用。與PHB相比，PHBV由于3-羥基戊酸(3-HV) 單體的摻入，其性能有了很大的改進(jìn)，因此具有更加廣泛的應(yīng)用前景。但是，用細(xì)菌來(lái)生產(chǎn) PHBV需要添加昂貴的丙酸、戊酸等相關(guān)底物來(lái)提供3-HV單體，而且高濃度的相關(guān)底物會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)。與細(xì)菌相比，極端嗜鹽古菌作為PHA的生產(chǎn)菌株可以在很大程度上降低其生產(chǎn)成本，可以在不添加有機(jī)酸等相關(guān)碳源的情況下合成PHBV，并且所合成的PHBV在性能上要優(yōu)于細(xì)菌來(lái)源的PHBV。細(xì)菌中，上述兩種短鏈PHA的生物合成是通過(guò)β -酮硫解酶(PhaA)，β -酮酯酰-CoA還原酶(PhaB)和PHA合酶(PhaC)所催化。β -酮硫解酶與β -酮酯酰-CoA還原酶負(fù)責(zé)提供PHA合成的前體3-HB-CoA和3-HV_CoA。目前，國(guó)際上對(duì)極端嗜鹽古菌PHA的研究還主要集中在發(fā)酵工藝的優(yōu)化方面，而對(duì)此類(lèi)微生物中PHA合成相關(guān)基因的研究相對(duì)較少，在公開(kāi)報(bào)道中未見(jiàn)嗜古鹽菌PHA合成相關(guān)的β-酮硫解酶(PhaA)的報(bào)道，更無(wú)類(lèi)似于細(xì)菌中對(duì)這些相關(guān)基因通過(guò)基因工程技術(shù)進(jìn)行改造，尋求性能更加優(yōu)良的PHA以及實(shí)現(xiàn) PHA的低成本生產(chǎn)的報(bào)道。因此，極端嗜鹽古菌中酮硫解酶基因的發(fā)現(xiàn)、及其在極端嗜鹽古菌中的遺傳工程技術(shù)的改造，對(duì)于極端嗜鹽古菌PHA的生物工程開(kāi)發(fā)具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與PHBV的3-HV單體合成相關(guān)的β -酮硫解酶及其
編碼基因。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，名稱(chēng)為PhaAl，來(lái)源于極端嗜鹽古菌(Haloferax sp.)XHlOOICGMCC No. 3822，蛋白質(zhì) 1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與聚羥基丁酸羥基戊酸酯(PHBV)合成和/或3-羥基脂肪酸(3-HV)合成相關(guān)的由1) 衍生的蛋白質(zhì)。上述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。其中，序列表中序列1由383位氨基酸殘基組成。上述蛋白的編碼基因(phaAl)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述編碼基因?yàn)槿缦?)、2)、3)或4)的所示的基因1)序列表中序列2自5，末端第955-2106位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5’末端第791-2119位核苷酸所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下可以與1)或2)限定的DNA分子雜交且與聚羥基丁酸羥基戊酸酯合成和/或3-羥基脂肪酸合成相關(guān)蛋白的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列至少具有90%同源性，且編碼與聚羥基丁酸羥基戊酸酯合成和/或3-羥基脂肪酸合成相關(guān)蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件可為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜交，并用該溶液洗膜。其中，序列表中序列2是由2995個(gè)脫氧核苷酸組成，開(kāi)放閱讀框?yàn)樽?'末端第 955-2106位核苷酸序列，自5'末端第2104-2106位核苷酸序列為phaAl的終止密碼子，編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列；自5'末端第914-954位核苷酸序列為所述編碼基因的啟動(dòng)子區(qū)域，其中第924-931位核苷酸序列為啟動(dòng)子核心序列。含有上述基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；含有上述編碼基因的菌也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍，所述菌優(yōu)選為極端嗜鹽古菌 (Haloferaxsp.)XH1001 CGMCC No. 3822。本發(fā)明的極端嗜鹽古菌(Haloferaxsp. )XH1001 CGMCC No. 3822 于 2010 年 5 月 11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCCJia 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)。所述重組載體為在載體pWL102的多克隆位點(diǎn)插入所述編碼基因得到的重組載體。所述重組菌是將所述編碼基因?qū)胨拗骶玫降闹亟M菌。所述宿主菌為極端嗜鹽古菌，優(yōu)選為極端嗜鹽古菌(Haloarcula hispanica) 或極端嗜鹽古菌(Haloferax mediterranei)，尤其優(yōu)選為極端嗜鹽古菌(Haloarcula hispanica)CGMCC No. 1.2049。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種與PHBV的3-HV單體合成相關(guān)的β -酮硫解酶的應(yīng)用。本發(fā)明提供的應(yīng)用為所述蛋白在合成聚羥基丁酸羥基戊酸酯和/或3-羥基脂肪酸中的應(yīng)用，或所述編碼基因在合成聚羥基丁酸羥基戊酸酯和/或3-羥基脂肪酸中的應(yīng)用。
制備聚羥基丁酸羥基戊酸酯的方法也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，具體為發(fā)酵所述重組菌，得到聚羥基丁酸羥基戊酸酯，所述聚羥基丁酸羥基戊酸酯中3-羥基脂肪酸的摩爾百分比高于發(fā)酵所述宿主菌得到的聚羥基丁酸羥基戊酸酯中3-羥基脂肪酸的的摩爾百分比。所述發(fā)酵的方法為1)將所述重組菌接種于AS-168培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得到對(duì)數(shù)期菌株；每升AS-168培養(yǎng)基按如下方法配制將5. Og酸水解酪素，5. Og 酵母提取物，1. Og 谷氨酸鈉，3. Og 檸檬酸鈉，200g NaCl，20g MgSO4 · 7H20，2. Og KC1，0. 36g FeSO4 · 4H20和0. 36mg MnCl2 · 4H20溶于水中，用水補(bǔ)足體積；所述AS-168培養(yǎng)基的pH值為 7.2 ；2)再將所述對(duì)數(shù)期菌株接種到MG培養(yǎng)基，在 37°C培養(yǎng)3天，得到聚羥基丁酸羥基戊酸酯；每升所述MG培養(yǎng)基按如下方法配制將200g NaCl, 20g MgSO4 ·7Η20，2. Og KCl, Ig 谷氨酸鈉，37. 5mg KH2PO4, 50mg FeSO4 · 7H20,0. 36mg MnCl2 · 4H20, Ig 酵母提取物和 20g 葡萄糖溶于水中，用水補(bǔ)足體積；所述MG培養(yǎng)基的pH值為7. 2。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明，將與聚羥基丁酸羥基戊酸酯和/或3-羥基脂肪酸合成相關(guān)的蛋白的編碼基因?qū)胨拗骶锌梢援a(chǎn)生合成PHBV的3-HV單體，且產(chǎn)生3-HV的摩爾百分比大于所述宿主菌產(chǎn)生3-HV。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中的突變株(Haloferax sp. ) Δ phaAl可以作為一株宿主菌來(lái)驗(yàn)證來(lái)自于其他極端嗜鹽古菌的PhaAl基因的功能，為將來(lái)在極端嗜鹽古菌領(lǐng)域篩選能夠高效提供3HV的β -酮硫解酶提供平臺(tái)。


圖1為phaAl基因RT-PCR的瓊脂糖電泳2為整合載體pUBPDA的構(gòu)建示意3為PCR驗(yàn)證缺失phaAl基因的突變菌Haloferax sp. AphaAl的瓊脂糖電泳4為菌株積累聚羥基脂肪酸酯(PHA)的氣相色譜檢測(cè)結(jié)果圖5為異源表達(dá)phaAl積累聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)的氣相色譜檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、β -酮硫解酶及其編碼基因的獲得從天津海水鹽場(chǎng)的鹽池底泥中分離菌株，分離采用的培養(yǎng)基為AS-168培養(yǎng)基(每升含有5. Og 酸水解酪素(casamino acids)，5. Og 酵母提取物(yeast extract)，1. Og 谷氨酸鈉(sodium glutamate)，3· Og 檸檬酸鈉，200g NaCl，20g MgSO4 ·7Η20，2. Og KCl，0· 36g FeSO4 · 4H20和0. 36mg MnCl2 · 4 H2O, pH 7. 2)。分離獲得一極端嗜鹽古菌菌株XH1001。該菌株在AS-168瓊脂糖平板(AS-168+1.2%瓊脂糖)上生長(zhǎng)可形成微紅色菌落。菌落不透明、邊緣光滑。該菌革蘭氏染色陰性，電鏡觀察細(xì)胞通常寬1至2μπι，長(zhǎng)2至3μπι。進(jìn)行理化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ΧΗ1001最適生長(zhǎng)NaCl濃度是20% 25%，在10%的NaCl濃度仍可以生長(zhǎng)； 生長(zhǎng)PH范圍為5. 2 8. 0 ；好氧；能利用葡萄糖、淀粉、氨基酸等合成大量的PHBV。經(jīng)過(guò)分子驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌的16S rDNA基因(序列3)與HaloferaxmediterraneiATCC33500的16S rDNA (GenBankNo. Dl 1107)同源性在 99% 以上，因此命名為 Haloferax sp. XH1001.將Haloferax sp. XHlOOl于2010年5月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCCJia 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 3822。通過(guò)對(duì)極端嗜鹽古菌(Haloferax sp. )XHlOOl CGMCC No. 3822基因組進(jìn)行鳥(niǎo)槍法測(cè)序，獲得一 β _酮硫解酶基因，將該基因命名為PhaAl，其核苷酸序列為序列表中序列2的自5'末端第955-2106位核苷酸序列，編碼蛋白為PhaAl，該蛋白的氨基酸序列為序列1所示。實(shí)施例2、phaAl的功能鑒定一、發(fā)酵培養(yǎng)基中基因phaAl的轉(zhuǎn)錄情況1、發(fā)酵培養(yǎng)基中 Haloferax sp. XHlOOl CGMCC No. 3822 菌體總 RNA 的提取1)將 Haloferax sp. XH1001 CGMCC No. 3822 在 AS-168 培養(yǎng)基(每升含有 5. Og 酸水解酪素(casamino acids)，5. Og 酵母提取物(yeast extract)，1. Og 谷氨酸鈉(sodiumglutamate)，3. Og 檸檬酸鈉，200g NaCl，20g MgSO4 · 7H20，2. Og KCl，0.36g FeSO4 · 4Η20和0. 36mg MnCl2 · 4H20,其余為水，pH 7. 2)中37°C培養(yǎng)3-4天，使其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。2)按 5%的接種量，將(Haloferax sp. )XH1001 CGMCC No. 3822 接種在 MG(每升含有200g NaCl，20g MgSO4 · 7H20，2. Og KCl，lg 谷氨酸鈉(sodium glutamate)，37. 5mg KH2PO4, 50mg FeSO4 · 7H20,0. 36mg MnCl2 · 4H20, Ig 酵母提取物(yeastextract)，20g 葡萄糖 (glucose), pH 7. 2)培養(yǎng)基中37°C繼續(xù)培養(yǎng)2天，使其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，用高壓滅菌兩次的EP管收集3-5mL菌體，12，OOOrpm,室溫離心lmin，棄上清，離心甩一次，用移液槍吸盡上清。3)用每個(gè)EP管中加入Iml TRIzol試劑(invitrigen)將提取上述收集菌體中的總RNA，并將總RNA溶解于20-30 μ L DEPC水中。2、RNA濃度與純度的測(cè)定取上述獲得的1. 5 μ L RNA溶液加入到300 μ L TE溶液中，用BECKMAN DU800測(cè)定其濃度，對(duì)照為300 μ L TE加入1. 5 μ L DEPC水。測(cè)得0D260/280為2. 05，說(shuō)明RNA的純度符合下一步的實(shí)驗(yàn)要求。測(cè)得RNA的濃度為5. 6 μ g/ μ L。3、將 RNA 用 DNase 消化將提取的總 RNA 15 μ g 用 RNase-free RQlDNase (Promega)處理，5O μ L 體系 (DNase buffer 5 μ L, DNase 5 μ L，15 μ g RNA, DEPC 水補(bǔ)足至 50 μ L)，37°C反應(yīng) 4-5 小時(shí)。4、RT-PCR根據(jù)phaAl的核苷酸序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)RT-PCR引物phaARTF/phaARTR，引物序列如下phaARTF 5' CGCCGTTCCTGTGATTCT3‘phaARTR 5‘ GCCCCCGCAAGTGTAGAC3‘以DNase消化后的RNA為模板，利用OneSt印RT-PCR試劑盒(Qiagen公司)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)上的步驟進(jìn)行RT-PCR。程序分為兩步第一步，利用RT-PCR后引物phaARTR，以總 RNA為模板，將目的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；第二步，利用RT-PCR引物phaARTF/phaARTR，以第一步中反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，進(jìn)行PCR。在第二步中，要用Dnase消化后的總RNA作陰性對(duì)照，用極端嗜鹽古菌(Haloferax sp.)XHlOOICGMCC No. 3822的DNA作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果如圖 1所示圖1中泳道1為RT-PCR條帶；泳道2為DNA為模板的陽(yáng)性對(duì)照；泳道3為Dnase消化后的總RNA為模板的陰性對(duì)照；泳道M為IOObp marker。從圖1中可以看出，泳道1的條帶與陽(yáng)性對(duì)照(泳道2)的條帶一致，證明phaAl基因在發(fā)酵培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)錄。二、基因phaAl的功能(一 )、通過(guò)構(gòu)建缺失基因phaAl的突變菌株Haloferax sp. Δ phaAl來(lái)驗(yàn)證1、敲除phaAl基因的同源重組整合質(zhì)粒pUBPDA的構(gòu)建pUBPDA的構(gòu)建過(guò)程如圖2所示，具體步驟如下1)用于敲除phaAl的同源重組雙交換臂的擴(kuò)增根據(jù)phaAl的核苷酸序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)雙交換臂的擴(kuò)增引物N1/N2和C1/C2 Nl 5' ATCAAGCTTTGCCACCGACCCAATACG 3‘(帶下劃線(xiàn)的序列為 HindIII 識(shí)別位占)N2 5' ATAGGATCCCGCCGAAGGTGGGGAAGG 3'(帶下劃線(xiàn)的序列為 BamHI 識(shí)別位占)Cl 5' ATAGGATCCCCGGGAAGGTCGTTACGT 3'(帶下劃線(xiàn)的序列為 BamHI 識(shí)別位占)C2 5' ATAGGTACCCGGTGACGGCATAGAGAT 3‘(帶下劃線(xiàn)的序列為 KpnI 識(shí)別位點(diǎn))以由實(shí)施例1獲得的DNA為模板，用引物對(duì)N1/N2擴(kuò)增破壞phaAl的雙交換左臂 (pha-L)，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 3min 預(yù)變性；然后 94°C 30s、54°C 30s,72°C 40s 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C再延伸7min ；擴(kuò)增體系為25μ L ；擴(kuò)增得到796bp的片段，經(jīng)測(cè)序表明該片段具有序列表中序列2的自5'端第1-796位核苷酸序列，即為敲除phaAl的左臂(pha_L)；以由實(shí)施例1獲得的DNA為模板，用引物對(duì)C1/C2擴(kuò)增敲除phaAl的雙交換右臂 (pha-R)，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 3min 預(yù)變性；然后 94°C 30s、54°C 30s,72°C 40s 進(jìn)行 30 個(gè)循環(huán)；72°C再延伸7min ；擴(kuò)增體系為25μ L ；擴(kuò)增得到781bp的片段，經(jīng)測(cè)序表明該片段具有序列表中序列2的自5'端第2215-2995位核苷酸序列，即為敲除phaAl的右臂(pha-R)。瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物pha-L和pha_R。2)敲除phaAl的整合載體pUBPDA的構(gòu)建用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和KpnI分別雙酶切載體pUBP(Han，J.，Lu，Q.，Zhou, L.， Zhou, J. , Xiang, H. 2007. Molecular characterization of the PhaECllm genes, required forbiosynthesis of poly(3-hydroxybutyrate)in the extremely halophilic archaeon Haloarculamarismortui. Appl Environ Microbiol, 73 (19), 6058-65.，公眾可從中國(guó)禾斗學(xué)院微生物研究所獲得)和PCR產(chǎn)物pha-R，連接酶切后的載體和PCR片段，然后用CaCl2化學(xué)法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109，在含有氨芐青霉素的抗性平板上進(jìn)行篩選，將獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序；結(jié)果表明片段Pha-R(其核苷酸序列為序列表中序列2的自5'末端第2215-2995位核苷酸序列)已經(jīng)正確插入載體pUBP的BamHI和KpnI位點(diǎn)間，將其命名為重組載體pUBP-R。右臂成功連入后，再用HindIII和BamHI分別雙酶切連有右臂的pUBP重組載體 PUBP-R和PCR產(chǎn)物pha-L，連接酶切后的載體和PCR片段，然后用CaCl2化學(xué)法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109，在含有氨芐青霉素的抗性平板上進(jìn)行篩選，將獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序；結(jié)果表明片段Pha-L(其核苷酸序列為序列表中序列2的自5'末端第1-796位核苷酸序列)已經(jīng)正確插入載體pUBP-R的BamHI和HindIII位點(diǎn)間，得到含有pha_L和pha_R 完整的雙交換整合載體，并將其命名為pUBPDA。2、phaAl 缺失突變株 Haloferax sp. ) Δ phaAl 的構(gòu)建通過(guò)pUBPDA 的雙交換臂與極端嗜鹽古菌(Haloferax sp. ) XHlOOl CGMCCNo. 3822 基因組中的PhaAl進(jìn)行同源重組，敲除Haloferax sp. XHlOOl CGMCC No. 3822 基因組中的 phaAl，具體步驟如下所述1)整合載體 pUBPDA 轉(zhuǎn)化 Haloferax sp. XHlOOl CGMCC No. 3822采用PEG 介導(dǎo)的方法(按照文獻(xiàn) Cline，S. W.，W. L. Lam, R. L. Charlebois, L. C. Schalkwyk, and W. F. Doolittle. 1989. Transformation methods for halophilic archaebacteria. Can J Microbiol 35 148-52.所述的方法)將 pUBPDA 轉(zhuǎn)化極端嗜鹽古菌(Haloferaxsp.) XHlOOl CGMCC No. 3822，轉(zhuǎn)化后在含有 5mg/L 莫維諾林的 AS-168 (每升含有5. Og 酸水解酪素(casamino acids)，5. Og 酵母提取物(yeast extract)，1. Og 谷氨酸鈉(sodium 81肚&11^{6)，3.(^檸檬酸鈉，20(^ NaCl，20g MgSO4 · 7Η20，2. Og KCl，0.36g FeSO4 · 4H20和0. 36mg MnCl2 · 4H20,12g瓊脂，pH 7. 2)固體平板上篩選轉(zhuǎn)化子。2)篩選基因phaAl的單交換菌株在步驟1)得到的轉(zhuǎn)化子中，進(jìn)行PCR驗(yàn)證抽取總DNA，以m和C2作為引物反應(yīng)，反應(yīng)體系為IXPCR緩沖液，dNTPs 0. 2μΜ, Mg2+L 5 μ L(終濃度1.5μΜ)，Nl和C2各 1 μ L(終濃度0. 4nM)，Taq DNA聚合酶1 μ 1 (3U)；反應(yīng)條件為先94°C 3min預(yù)變性；然后 940C 45s,540C 45s,72°C 150s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C再延伸7min。結(jié)果如圖3所示，泳道1 為極端嗜鹽古菌(Haloferax sp.) XH1001 CGMCCNo. 3822陰性對(duì)照；泳道2和泳道3為極端嗜鹽古菌(Halof印ax sp.) XH1001 CGMCCNo. 3822的重組菌，泳道4為pUBPDA質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照。從圖中看出，陰性對(duì)照的的PCR產(chǎn)物大小2995bp，陽(yáng)性對(duì)照的PCR產(chǎn)物大小1577bp，泳道2的PCR產(chǎn)物大小分別為2995bp和1577bp，說(shuō)明對(duì)應(yīng)的菌株為發(fā)生phaAl單交換的極端嗜鹽古菌(Haloferaxsp.)XH1001 CGMCC No. 3822 菌株。3)同源重組雙交換后缺失phaAl的突變株(Haloferax sp. AphaAl)的篩選將步驟2)篩選到的phaAl單交的極端嗜鹽古菌(Haloferax sp. ) XH1001 CGMCCNo. 3822菌株在不含莫維諾林的液體AS-168培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)80代，重復(fù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng) 4次后將傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)液倍比稀釋109，在固體AS-168培養(yǎng)基平板上涂布均勻，培養(yǎng)一周左右得到單克隆，挑取單克隆同時(shí)在AS-168固體平板上及含5mg/L莫維諾林的AS-168的固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)。待菌生長(zhǎng)一周后，挑取在抗性平板上不生長(zhǎng)但在非抗性平板上生長(zhǎng)的單菌落，抽提其基因組DNA作為模板，同樣以m和C2作為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，反應(yīng)體系和條件與篩選單交換菌株相同。PCR結(jié)果如圖3所示，其中泳道3所示重組菌的PCR產(chǎn)物大小為 1577bp，說(shuō)明對(duì)應(yīng)的菌株為發(fā)生雙交換導(dǎo)致phaAl缺失的極端嗜鹽古菌(Haloferax sp.) XH1001 CGMCC No. 3822 菌株，將其命名為 Haloferax sp. AphaAl03、phaAl缺失突變株Haloferax sp. Δ phaAl積累PHA種類(lèi)的檢測(cè)檢測(cè)Haloferax sp. Δ phaAl在積累PHA的培養(yǎng)基中所積累PHA的變化，用野生菌 Haloferax sp. XH1001 CGMCC No. 3822作為陽(yáng)性對(duì)照。具體操作如下所示
1)將上述獲得的Haloferax sp. Δ phaAl在AS-168培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)3-4天，使其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。2)按5%的接種量，將Haloferax sp. Δ phaAl接種在MG培養(yǎng)基中37°C繼續(xù)培養(yǎng) 3天，然后離心收集菌體。3)將收集的菌體冰干，然后稱(chēng)取約75mg冰干的菌體，將其置于酯化管中，再向其中加入2mL酯化液(3%體積的濃硫酸溶于甲醇中，含lg/L苯甲酸作為內(nèi)標(biāo))和2mL氯仿， 混勻后將其置于100°C的烤箱中酯化4小時(shí)。酯化后加入ImL蒸餾水，混勻，待有機(jī)相和水相分層后，取1 μ L下層有機(jī)相用氣相色譜進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。檢測(cè)結(jié)果如圖4Α和4Β所示(圖中顯示3_ΗΒ和3_HV單體峰即表明可產(chǎn)生PHBV)，其中A為極端嗜鹽古菌(Haloferax sp.) XHlOOl CGMCC No. 3822野生菌積累的聚羥基丁酸戊酸共聚酯結(jié)果；B為缺失phaAl基因的突變菌Haloferax sp. AphaAl 的結(jié)果。結(jié)果表明，未經(jīng)任何處理的Haloferax sp. XHlOOl CGMCC No. 3822野生菌株在MG 培 養(yǎng)基中積累的PHA種類(lèi)為PHBV (圖4A)，而Haloferax sp. AphaAl在相同的培養(yǎng)條件下由于缺失了基因phaAl，合成的PHA種類(lèi)變?yōu)镻HB (圖4B)。證明本發(fā)明的phaAl蛋白及其編碼基因與3-HV合成相關(guān)。(二)、將phaAl基因回轉(zhuǎn)Haloferax sp. AphaAl突變菌后驗(yàn)證phaAl基因的功
臺(tái)匕
!!匕將基因phaAl導(dǎo)入突變株Haloferax sp. Δ phaAl，以驗(yàn)證phaAl基因的功能，具體操作如下1、構(gòu)建重組載體pWL102-A根據(jù)Haloferax sp. XHlOOl的基因組序列設(shè)計(jì)引物HmeFl 5' ATAGGATCCCCAGCTTCCAGGGTCATT 3‘(帶下劃線(xiàn)的序列為 BamHI 識(shí)別位點(diǎn))HmeRl:5' ATCGGTACCTCGGCGAAGATGATAGTT 3‘(帶下劃線(xiàn)的序列為 KpnI 識(shí)別位占)以 Haloferax sp. XHlOOl CGMCC No. 3822 的基因組 DNA 為模板，用引物 HmeFl 和 HmeRl 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件為94°C 3min 預(yù)變性；然后 94°C 30s、54°C 30s,72°C 70s 進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C再延伸7min ；擴(kuò)增體系為25μ L ；擴(kuò)增得到1329bp的片段，回收 PCR產(chǎn)物，然后用BamHI/Kpnl切割；并用相同的內(nèi)切酶切割穿梭載體pWL 102 (Lam, W. L.， and W. F. Doolittle. 1989. Shuttle vectors for thearchaebacterium Halobacterium volcanii.Proc Natl Acad Sci USA 86 :5478_82，公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得)。連接酶切后的載體和片段，并將連接產(chǎn)物用CaCl2化學(xué)法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，在含有氨芐青霉素的抗性平板上進(jìn)行篩選，篩選獲得陽(yáng)性克隆，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，載體PWL102的BamHI和KpnI位點(diǎn)間插入的序列具有序列表中序列2自5'末端第 791-2119位核苷酸序列，將該重組載體命名為pWL102-A，且序列2自5'末端第791-2119 位核苷酸序列包括PhaAl的開(kāi)放閱讀框(序列2自5'末端第955-2106位核苷酸序列)。2、構(gòu)建重組菌 Δ phaAl/A將步驟1獲得的PWL102-A通過(guò)PEG介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化至步驟一中獲得的突變菌 Haloferax sp. AphaAl中，并在含有5mg/L莫維諾林的AS-168固體平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，再對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行提取質(zhì)粒及酶切和測(cè)序驗(yàn)證，證明獲得了已經(jīng)導(dǎo)入重組載體 PWL102-A的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，將含有pWL102-A的重組極端嗜鹽古菌(Haloferax sp. ) AphaAl 命名為AphaAl/A。 采用同樣的方法將空載體pWL102導(dǎo)入重組極端嗜鹽古菌(Haloferax sp.) AphaAl 中獲得重組菌 AphaAl/pWL102。3、發(fā)酵重組菌Δ phaAl/A以檢測(cè)其積累PHA的種類(lèi)將其得到的AphaAl/A工程菌按照步驟一 3中所述的方法進(jìn)行發(fā)酵，再按照步驟一 3所述的方法進(jìn)行酯化反應(yīng)(經(jīng)過(guò)甲酯化處理后)，然后用氣相色譜檢測(cè)AphaAl/A工程菌所積累PHA的種類(lèi)。以極端嗜鹽古菌(Haloferax sp.) XHlOOl CGMCC No. 3822野生菌和重組菌AphaAl/pWL102為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，檢驗(yàn)結(jié)果與圖4C所示，將圖4A與4B —起對(duì)照比較，A為極端嗜鹽古菌(Haloferax sp.)XH1001 CGMCC No. 3822野生菌積累的聚羥基丁酸戊酸共聚酯結(jié)果 (或重組菌AphaAl/pWL102積累的聚羥基丁酸戊酸共聚酯結(jié)果，二者結(jié)果相同)；B為缺失 phaAl基因的突變菌Haloferax sp. AphaAl的結(jié)果；C為導(dǎo)入phaAl基因的菌Haloferax sp. AphaAl/A的結(jié)果；D為聚羥基丁酸戊酸共聚酯標(biāo)樣(圖中顯示3_HB和3_HV單體峰即表明可產(chǎn)生PHBV)。氣相色譜檢測(cè)的各樣品經(jīng)過(guò)甲醇高溫處理生成羥基脂肪酸甲酯，4. 85min 的出峰位置對(duì)應(yīng)Ing苯甲酸的甲酯化產(chǎn)物(內(nèi)標(biāo))。從圖中可以看出，phaAl基因和其本身啟動(dòng)子(第914-954位核苷酸序列)導(dǎo)入 Haloferax sp. AphaAl后獲得的重組菌AphaAl/A能夠產(chǎn)生3-HV組分，表明phaAl基因及其本身啟動(dòng)子的導(dǎo)入使得原來(lái)喪失3-HV組分合成能力的菌株重新獲得了 PHBV的積累能力；對(duì)比圖4A與圖4C，可以看出3-HV組分的摩爾比與野生菌Haloferax sp. XH1001 CGMCC No. 3822 相當(dāng)。證明Haloferax sp.中phaAl編碼的蛋白具有β -酮硫解酶的功能。同時(shí)表明， 突變株Haloferax sp. Δ phaAl可以作為一株宿主菌來(lái)驗(yàn)證來(lái)自于其他極端嗜鹽古菌的 PhaAl基因的功能，為將來(lái)在極端嗜鹽古菌領(lǐng)域篩選能夠高效提供3-HV的β -酮硫解酶提供平臺(tái)。實(shí)施例3、phaAl基因應(yīng)用將實(shí)施例2步驟二構(gòu)建的重組質(zhì)粒pWL102-A通過(guò)PEG介導(dǎo)的方法(Can JMicrobiol. 35 148-52.)轉(zhuǎn)化至未經(jīng)任何處理的野生型菌株Haloarcula hispanica CGMCCNo. 1. 2049 (購(gòu)自CGMCC，菌株編號(hào)為CGMCC No. 1. 2049)中，將獲得的重組菌命名為 Haloarcula hispanica/pffL 102-A。按實(shí)施例2所述方法進(jìn)行發(fā)酵與分析。采用同樣的方法將空載體PWL102導(dǎo)入 Haloarcula hispanica CGMCC No. 1. 2049 得到的重組菌(命名為 Haloarculahispanica/ PWL102)進(jìn)行發(fā)酵與分析，作為對(duì)照。未經(jīng)任何處理的野生型菌株Haloarculahispanica CGMCC No. 1. 2049也作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5中A為Haloarculahispanica/ PWL102產(chǎn)生的聚羥基丁酸戊酸共聚酯結(jié)果(或野生型菌株Haloarculahispanica CGMCC No. 1.2049產(chǎn)生的聚羥基丁酸戊酸共聚酯結(jié)果，二者結(jié)果相同)；B為Haloarcula hispanica/pffL102-A產(chǎn)生的聚羥基丁酸戊酸共聚酯結(jié)果；C為聚羥基丁酸戊酸共聚酯標(biāo)樣(圖中顯示3-HB和3-HV單體峰即表明可產(chǎn)生PHBV)。從圖中看 出，野生型菌株Haloarcula hispanica CGMCC No. 1. 2049、Haloarcula hispanica/pWL102 禾口 Haloarcula hispanica/ PWL102-A產(chǎn)生PHBV的總量沒(méi)有明顯變化，但是Haloarculahispanica/pWL102產(chǎn)生PHBV 中3-HV摩爾百分比為3. 6左右，轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pWL102-A的菌株Haloarcula hispanica/ PWL102-A產(chǎn)生PHBV中3-HV摩爾百分比為9. 7左右。轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pWL102_A的菌株產(chǎn)生的 PHBV中3-HV摩爾百分比比轉(zhuǎn)入空載體pWL102的菌株提高了 1. 7倍。說(shuō)明異源表達(dá)phaAl 基因，可以大幅度提高Haloarculahispanica CGMCC No. 1. 2049菌產(chǎn)生3-HV組分的能力。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與聚羥基丁酸羥基戊酸酯合成和/或3-羥基脂肪酸合成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述編碼基因，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?)、2)、3)或 4)的所示的基因1)序列表中序列2自5，末端第955-2106位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5’末端第791-2119位核苷酸所示的DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的DNA分子雜交且與聚羥基丁酸羥基戊酸酯的合成和 /或3-羥基脂肪酸的合成相關(guān)的DNA分子；4)與1)或2)限定的DNA序列至少具有90%同源性且編碼與聚羥基丁酸羥基戊酸酯合成和/或3-羥基脂肪酸合成相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和重組菌；含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體或重組菌，其特征在于所述重組載體為在載體 PWL102的多克隆位點(diǎn)插入權(quán)利要求2或3所述編碼基因得到的重組載體；所述重組菌為將權(quán)利要求2或3所述編碼基因?qū)胨拗骶玫降闹亟M菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的菌，其特征在于所述含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的菌為極端嗜鹽古菌(Haloferax sp.)XHlOOl CGMCC No. 3822。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于所宿主菌為極端嗜鹽古菌，優(yōu)選為極端嗜鹽古菌(Haloarcula hispanica)或極端嗜鹽古菌(Haloferax mediterranei)，尤其優(yōu)選為極端嗜鹽古菌(Haloarcula hispanica)CGMCC No. 1.2049。
8.權(quán)利要求1所述蛋白在合成聚羥基丁酸羥基戊酸酯和/或3-羥基戊酸中的應(yīng)用，或權(quán)利要求2或3所述編碼基因在合成聚羥基丁酸羥基戊酸酯和/或3-羥基戊酸中的應(yīng)用。
9.一種制備聚羥基丁酸羥基戊酸酯的方法，發(fā)酵權(quán)利要求4或7所述重組菌，得到聚羥基丁酸羥基戊酸酯，所述聚羥基丁酸羥基戊酸酯中3-羥基脂肪酸的摩爾百分比高于發(fā)酵所述宿主菌得到的聚羥基丁酸羥基戊酸酯中3-羥基脂肪酸的的摩爾百分比。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵的方法為1)將所述重組菌接種于AS-168培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得到對(duì)數(shù)期菌株；每升AS-168培養(yǎng)基按如下方法配制將5. Og酸水解酪素，5. Og酵母提取物，1. Og谷氨酸鈉，3. Og檸檬酸鈉，200g NaCl，20g MgSO4 · 7Η20，2· Og KCl，0. 36g FeSO4 · 4H20 禾口 0. 36mg MnCl2 · 4H20 溶于水中，用水補(bǔ)足體積；所述AS-168培養(yǎng)基的pH值為7. 2 ；2)再將所述對(duì)數(shù)期菌株接種到MG培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)3天，得到聚羥基丁酸羥基戊酸酯；每升所述MG培養(yǎng)基按如下方法配制將200g NaCl，20g MgSO4 · 7H20, 2. Og KCl，Ig谷氨酸鈉，37. 5mg KH2PO4, 50mg FeSO4 · 7H20,0. 36mg MnCl2 · 4H20, Ig 酵母提取物和 20g 葡萄糖溶于水中，用水補(bǔ)足體積；所述MG培養(yǎng)基的pH值為7. 2。
全文摘要
本發(fā)明提供一種極端嗜鹽古菌中與可生物降解材料PHBV的3-HV單體合成相關(guān)的β-酮硫解酶的研究與應(yīng)用，本發(fā)明提供的蛋白是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與PHBV和/或3-HV合成相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明，將與聚羥基丁酸羥基戊酸酯和/或3-羥基脂肪酸合成相關(guān)的蛋白的編碼基因?qū)胨拗骶锌梢援a(chǎn)生合成PHBV的3-HV單體摩爾百分比大于所述宿主菌產(chǎn)生3-HV。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102268424SQ201010195738
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2010年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月1日
發(fā)明者馮博, 向華, 韓靜 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所