專利名稱：表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的載體及工程菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的載體及工程菌與該工程菌在表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體中的應用。
背景技術：
菌視紫紅質(zhì)(BR)是極端嗜鹽古菌鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarum)中發(fā)現(xiàn)的一種膜結合蛋白，具有光驅(qū)動的質(zhì)子泵功能(Biochim.Biophy.Acta.1979，505215-278)。該蛋白分子量約27kDa，以其216位的賴氨酸上的ε-氨基基團共價結合全反式視黃醛生色團。在鹽沼鹽桿菌細胞膜中，BR形成三聚體，沿細胞膜二維方向有規(guī)律的排列，形成人們所說的紫膜(PM)。
紫膜這一高度特化的生物學結構，由于其天然的質(zhì)子泵功能，以及光電響應和光至變色特性，其各類突變體被認為是目前可用于研制生物計算機，進行海量信息處理，全息圖像儲存，以及人工視網(wǎng)膜，光電響應等領域的，最具開發(fā)潛力的生物納米材料。
人工遺傳工程改造是獲得優(yōu)良紫膜突變體的主要途徑，通過不同的技術途徑人們已得到了一些有應用前景的突變體。這些突變體一般有較長的M、O、P或Q態(tài)，具有良好的光致變色和光電響應等特性，在信息存儲和光電控制元件等方面有一定應用前景。另外通過結合X射線晶體衍射，核磁共振等手段研究突變體的結構變化，對各個重要氨基酸在紫膜功能活性中的作用作了深入的了解，也反過來對更有應用前景的BR突變體的獲得起到了重要指導作用。
通過基因工程方法對紫膜蛋白基因(bop)突變后，一般有兩種表達方法。一種是在將bop基因或突變基因在異源宿主如大腸桿菌中表達，經(jīng)純化后與視黃醛在脂類或去污劑形成的泡囊中重建，得到有功能活性的紫膜突變體(J.Biol.Chem.1988，2637439-7442)，但該種方法獲得的紫膜突變體組成中因缺少極端嗜鹽古菌特異的脂成分等，因而在結構及理化性質(zhì)方面均存在不足；另一種方法是構建能在極端嗜鹽古菌中復制的表達載體或整合表達載體，直接在嗜鹽古菌中表達突變體，然后通過超速離心等方法純化，得到有功能活性的突變體(Proc.Natl.Acad.Sci.1991，88859-863)。第二種方法可以得到天然狀態(tài)的紫膜，以便于體內(nèi)研究紫膜突變體的功能，并有利于篩選新的優(yōu)良突變體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的載體。
本發(fā)明所提供的表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的載體，名稱為pNB-bopD96N；pNB-bopD96N是將具有序列表中序列1的核苷酸序列的極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體編碼基因插入到pNB102的EcoRI和ClaI識別位點間得到的表達質(zhì)粒。
所述極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體，名稱為D96N突變體，具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列。
序列表中的序列2由248個氨基酸殘基組成，自氨基端第96位的天門冬酰胺殘基(N)由天門冬氨酸殘基(D)突變而來。
具有序列表中序列1的核苷酸序列的極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體編碼基因的名稱為bopD96N。
序列表中的序列1由1035個脫氧核苷酸組成，自5′端第507位脫氧核苷酸a由g突變而來；自5′端第1位至第182位脫氧核苷酸為啟動子序列；自5′端第183位至第968位脫氧核苷酸為D96N突變體的原蛋白的編碼序列，其中222位至第965位脫氧核苷酸編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列的紫膜蛋白D96N突變體成熟肽；在翻譯后加工形成成熟肽的過程中，由于極端嗜鹽古菌自身機制，由序列1中222-224cag編碼谷氨酰胺(Q)被加工為谷氨酸(E)，而由序列1中966-968為gac編碼的最后一個氨基酸D則被切除，因此最終可形成序列2的D96N成熟肽氨基酸序列；自5′端第972位至第1035位脫氧核苷酸為終止子序列。
pNB-bopD96N含氨芐青霉素抗性和莫維諾林抗性編碼基因，大腸桿菌和極端嗜鹽古菌復制子，可在大腸桿菌和極端嗜鹽古菌之間穿梭。該質(zhì)粒中bopD96N基因含其自身啟動子和終止子序列，受染色體上反式作用元件的調(diào)控，可用光照和低氧條件來誘導紫膜蛋白的產(chǎn)生。并且在啟動子區(qū)與染色體具有415bp的同源片段，所以除了利用自身復制子復制外，該質(zhì)粒可通過同源重組整合到染色體上。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的工程菌。
本發(fā)明所提供的表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的工程菌，是將pNB-bopD96N導入鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)BRD，得到的可表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的工程菌；所述鹽沼鹽桿菌(Halobacteriumsalinarium)BRD是將鹽沼鹽桿菌(嗜鹽桿菌)(Halobacterium salinarium)AS1.2061的bop基因編碼序列敲除后得到的菌株。
鹽沼鹽桿菌H.salinarum AS1.2061，由中國科學院微生物研究所菌種保藏中心保存和出售。該菌可在培養(yǎng)基AS-169(每升培養(yǎng)基成分酪蛋白氨基酸7.5g，酵母抽提物10g，檸檬酸鈉3g，硫酸鎂20g，氯化鉀2g，氯化鈉250g，二價Fe及Mn痕量(10-10～10-12g)，pH7.4)上生長，菌落呈圓形，邊緣整齊，37℃生長7-10天菌落為粉紅色至紫色。
H.salinarum BRD，也在培養(yǎng)基AS-169上生長，菌落呈圓形，邊緣整齊，37℃-40℃生長7-10天菌落為黃色或略顯紅色。
所述bop基因可通過缺失bop基因編碼區(qū)而不再表達野生型極端嗜鹽古菌紫膜蛋白。所述bop基因的編碼區(qū)是由GenBank號為AE005062的第7089位至第7877位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列。
所述鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)BRD可按照如下方法獲得將pBRD101轉(zhuǎn)化鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS1.206l，篩選得到不表達bop基因的菌株即為鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)BRD；所述pBRD101按照如下方法構建1)將具有序列表中序列3的核苷酸序列的由656bp組成的DNA片段插入pUCm-T，得到含有該656bp序列的重組載體pbopP；2)將具有序列表中序列4的核苷酸序列的由641bp組成的DNA片段用Xba I和Hind III酶切后插入pbopP的Xba I和Hind III識別位點之間，得到重組載體pbopPT；3)將莫維諾林(Mevinolin)抗性基因片段插入pbopPT的EcoR I和Kpn I識別位點間，得到bop基因敲除載體pBRD101。
序列表中序列4的自5′端第1位至第6位脫氧核苷酸為Xba I識別序列，自5′端第636位至第641位脫氧核苷酸為Hind III識別序列。
所述表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的工程菌優(yōu)選為鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N。
鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N已于2005年07月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏編號為CGMCC No.1415。
鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415也在培養(yǎng)基AS-169上生長，菌落呈圓形，邊緣整齊，37℃-40℃生長7-10天菌落為淡紫色。
鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415是質(zhì)粒pNB-bopD96N單交換整合到鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)BRD的染色體上的工程菌；傳代證明，鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCCNo.1415具有極好的穩(wěn)定性(在不含莫維諾林(Mevinolin)的AS-169培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)60代，整合的質(zhì)粒仍穩(wěn)定存在)。該工程菌經(jīng)光照和低氧誘導培養(yǎng)，紫膜蛋白產(chǎn)量與野生菌相當。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種表達并純化極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的方法。
本發(fā)明所提供的表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的方法，是將鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415在含10μg/ml的莫維諾林(Mevinolin)的AS-169培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期后，再誘導3-4天至培養(yǎng)物成淡紫色，收集菌體，將菌體懸浮于基本鹽溶液中，加入DNaseI，透析7-10小時，通過超速離心和蔗糖密度梯度離心分離得到純的極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體。
所述基本鹽溶液為硫酸鎂20g，氯化鉀2g，檸檬酸三鈉3g，氯化鈉250g，加水定容至1L。
本發(fā)明表達的紫膜蛋白D96N突變體除在560nm左右有最大吸收峰外，還在410nm處有吸收峰，對應光照產(chǎn)生的M中間態(tài)的存在；在光循環(huán)中出現(xiàn)具有長達5分鐘以上的M態(tài)(野生型僅為毫秒級)，可觀察到經(jīng)光照后由紫色(B態(tài))變?yōu)辄S色(M態(tài))。鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415的紫膜蛋白D96N突變體(26KDa)的表達量為3-5mg/L，本發(fā)明表達的D96N突變體在光學信息存儲、防偽材料制作等方面有很好的應用前景。
下面結合實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。例如，下面實施例是只將紫膜蛋白基因進行一個點突變并構建表達載體，用于工程菌的構建，實現(xiàn)了紫膜蛋白突變體在工程菌胞內(nèi)的高效表達。將實施例稍加修改(按本領域常規(guī)技術)，即可將該基因其他突變體克隆到本發(fā)明所設計的表達載體上，轉(zhuǎn)化本發(fā)明所構建的受體菌細胞(或其它生境來源的極端嗜鹽古菌鹽沼鹽桿菌，并經(jīng)相同技術改造的受體菌細胞)，實現(xiàn)新的紫膜蛋白突變體在工程菌中的表達。


圖1為bopD96N基因獲得方法示意2為表達載體pNB-bopD96N構建過程示意3為pBRD101構建過程示意4為基因敲除載體pBRD101與H.salinarum AS1.2061雙交換示意5A為表達載體pNB-bopD96N與H.salinarum BRD染色體單交換示意5B為工程菌的Southern雜交結果圖6為鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415表達紫膜蛋白D96N突變體的SDS-PAGE檢測圖7為野生型紫膜蛋白與紫膜蛋白D96N突變體的300-700nm吸收光譜曲線圖8為用D96N突變體制作的干膜片用刻字板遮蓋，經(jīng)光照后留下的數(shù)字圖案具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、紫膜蛋白突變體(D96N突變體)的表達一、鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415的獲得1、bop基因的獲得根據(jù)H.salinarum NRC-1 bop基因編碼序列，從保守區(qū)域設計引物，以部分嗜鹽菌的總DNA為模板進行PCR篩選。發(fā)現(xiàn)分離自我國鹽湖及海水曬鹽場并保存于中國科學院微生物研究所菌種保藏中心的6株極端嗜鹽古菌H.halobiumAS1.1952，H.halobium AS1.1959，H.cutirubrum AS1.1962，H.cutirubrumAS1.2060，Halobacterium sp.strain AS1.2061，Halobacterium sp.strainAS1.2062含有bop編碼基因。在此基礎上，設計一對引物bopF 5’agg cag cgg gca ttt cac 3’bopR 5’gtg ggg gac tca tcg tgt 3’以bopF，bopR擴增包含bop編碼基因開放閱讀框，啟動子，終止子序列的1035bp片段，分別回收六株菌的PCR產(chǎn)物，插入T載體pUCm-T(上海生工產(chǎn)品)進行測序。測序結果與H.salinarumNRC-1中bop基因序列(GenBank號AE005062)比對(ClustalW，EMBL)，結果顯示來自AS1.1959和AS1.2061與對照bop基因序列與對照序列100％一致，其它bop基因DNA序列中均有少數(shù)點突變，但是這些基因編碼紫膜蛋白序列與對照序列僅一到兩個氨基酸的差別。
2、bop基因的定點突變與表達載體的構建基本原理是以AS1.2061的bop基因為模板，進行點突變，bop基因閱讀框內(nèi)第325位g(即GenBank號AE005062的第7413位，序列1中的507位)變?yōu)閍，使密碼子由gac變?yōu)閍ac，從而實現(xiàn)其編碼的紫膜成熟蛋白的第96位天冬氨酸(D)突變?yōu)樘於滨０?N)(序列2)。(紫膜成熟蛋白是由bop基因編碼的原蛋白剪切掉N端13個氨基酸殘基后，再經(jīng)修飾加工，即切除后的N端第一個氨基酸由Q變?yōu)镋，并同時去除C端最后一個氨基酸D后獲得如序列2示的成熟肽)。方法如下設計一對overlapping PCR引物如下D96NF 5’gtt gtt gtt aaa cct cgc gtt gct cgt tg 3’D96NR 5’gcg agg ttt aac aac aac agc ggc g 3’然后以圖1策略對AS1.2061的bop基因進行點突變，第1步分別用bopF和D96NR，或者bopR和D96NF兩對引物以AS1.2061基因組DNA為模板進行PCR擴增。其中，25μl PCR反應體系AS1.2061基因組DNA 100-500ng，1×PCR緩沖液(來自上海生工公司的試劑盒)，dNTPs各0.2mM，引物對1(bopF和D96NR)或引物對2(bopR和D96NF)各引物10pmol，Taq DNA聚合酶1-3U；反應條件為先94℃3min預變性；然后94℃45s、56℃45s、72℃45s進行25個循環(huán)；再72℃延伸7min。結果得到大小分別為510bp和530bp的片段。第2步分別從凝膠回收該510bp和530bp片段，以回收的兩個片段互為模板和引物進行PCR擴增。其中25μl PCR反應條件為基本同上，只是DNA模板改為上述兩PCR片段(各1μL，約50-200ng)，引物改為bopR和bopF(各10pmol)。反應條件為先94℃3min預變性；然后94℃45s、56℃45s、72℃90s進行25個循環(huán)；再72℃延伸7min。結果得到1035bp片段。第3步將1035bpPCR片段插入到T載體得到pbopD96N，經(jīng)測序得到正確的突變基因bopD96N，即序列表中序列1的DNA序列。
序列表中的序列1自5′端第507位脫氧核苷酸a由g突變而來；自5′端第1位至第182位脫氧核苷酸為啟動子序列；自5′端第183位至第968位脫氧核苷酸為D96N突變體的原蛋白的編碼序列，其中222位至第965位脫氧核苷酸編碼具有序列表中序列2的氨基酸殘基序列的紫膜蛋白D96N突變體成熟肽；自5′端第972位至第1035位脫氧核苷酸為終止子序列。
用EcoRI和ClaI將bopD96N從質(zhì)粒pbopD96N切下，插入中國發(fā)明專利ZL02100714.4保護的pNB101的衍生載體pNB102(pNB102構建過程的詳見Biotechnol Lett，2004，261107-1113)中的EcoRI和ClaI識別位點間，得到含有bopD96N的表達質(zhì)粒載體pNB-bopD96N(圖2)。該質(zhì)粒含氨芐青霉素抗性和莫維諾林抗性編碼基因，大腸桿菌和極端嗜鹽古菌復制子，可在大腸桿菌和極端嗜鹽古菌之間穿梭。該質(zhì)粒中bopD96N基因含其自身啟動子和終止子序列，受染色體上反式作用元件的調(diào)控，可用光照和低氧條件來誘導紫膜蛋白的產(chǎn)生。并且在啟動子區(qū)與染色體具有415bp的同源性，所以除了利用自身復制子復制外，該質(zhì)?？赏ㄟ^同源重組整合到染色體上。
3、bop基因缺失的嗜鹽桿菌菌株的構建為獲得bop基因缺失的嗜鹽桿菌受體菌株，構建了基因敲除載體pBD101。pBD101構建方法為首先擴增bop基因上下游序列，設計兩對引物bopPF5’ ccg atc acc gac ctc cac 3’bopPR5’ cca tac ccc agc agc atc 3’bopTF5’ cttct agatcg cac acg cag gac agc 3’(帶下劃線的序列為XbaI識別位點)bopTR5’ tcaaag cttgcg ggg gga ggt cga tct 3’(帶下劃線的序列為HindIII識別位點)以AS1.2061基因組DNA為模板，用bopPF和bopPR擴增包含啟動子的bop基因上游656bp序列(序列3)，插入T載體pUCm-T，得到含有該656bp序列的重組載體pbopP；再用bopTF和bopTR作引物擴增bop基因下游641bp序列(序列4)，Xba I和Hind III酶切后插入pbopP的Xba I和Hind III位點之間，得到含有bop基因上游656bp序列和bop基因下游641bp序列的重組載體pbopPT；最后用EcoRI和Kpn I酶切pUBP2(Blaseio U，Pfeifer F.Transformation of halobacteriumhalobiumDevelopment of vectors and investigation of gas vesicle synthesis.Proc Natl Acad Sci USA，1990，876772-6776)，得到3.6kb的Mevinolin抗性基因片段，插入pbopPT的EcoR I和Kpn I識別位點間，得到bop基因敲除載體pBRD101(圖3)。
用pBRD101轉(zhuǎn)化AS1.2061，方法參見(Zhou M，Xiang H，Sun C，Tan H.Construction of a novel shuttle vector based on an RCR-plasmid from ahaloalkaliphilic archaeon and transformation into other haloarchaea.Biotechnol Lett，2004，261107-1113)。由于pBRD101沒有嗜鹽菌復制子，只能通過同源序列重組到AS1.2061染色體上，轉(zhuǎn)化后在含莫維諾林(Mevinolin)10μg/ml的AS-169平板上篩選轉(zhuǎn)化子。在得到的轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒通過單交換整合到染色體上，將其在不含莫維諾林的AS-169液體培養(yǎng)基中反復傳代培養(yǎng)120代，最后涂平板篩選不具備莫維諾林抗性的克隆，挑選不能被光照誘導呈淺紫色的克隆，按照如下方法進行PCR驗證提取基因組DNA，以bopPF和bopTR為引物作PCR反應，25μL反應體系為基因組DNA 100-500ng，1×PCR緩沖液(來自上海生工試劑盒)，dNTPs各0.2mM，bopPF和bopTR各10pmol，Taq DNA聚合酶1-3U；反應條件為先94℃3min預變性；然后94℃45s、56℃45s、72℃120s進行25個循環(huán)；再72℃延伸7min。結果只得到閱讀框部分缺失后的1.3kb的帶，而不能得到含完整閱讀框1.84kb的帶，說明不能被光照誘導呈淺紫色的克隆為雙交換后bop基因編碼區(qū)按預先設計被敲除的菌株H.salinarumBRD(圖4)。H.salinarumBRD在不含莫維諾林的AS-169培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)60代，該遺傳性狀仍然保持穩(wěn)定不變。經(jīng)傳代培養(yǎng)和莫維諾林抗性確認該菌株具備較好的遺傳穩(wěn)定性的突變株，即可作為表達bop及其突變基因的受體菌株。
4、嗜鹽菌的轉(zhuǎn)化與工程菌的篩選由于pNB-bopD96N含有嗜鹽古菌復制子，將pNB-bopD96N轉(zhuǎn)化H.salinarumBRD，能得到兩種轉(zhuǎn)化子。一種是質(zhì)粒游離于染色體自主復制，其中突變的bop基因的拷貝數(shù)比較高。另一種是質(zhì)粒通過染色體上仍保留的bop啟動子同源序列發(fā)生單交換整合到染色體上，其外源片段的穩(wěn)定性好，且突變的bop基因具有與野生型bop基因一樣的基因座位。這樣菌株突變的bop基因為單拷貝數(shù)，與野生型菌株在紫膜蛋白的表達機制相同，紫膜蛋白的表達受其上游增強子和調(diào)控蛋白的調(diào)控。質(zhì)粒pNB-bopD96N單交換整合到染色體上的工程菌的制備方法如下從得到的轉(zhuǎn)化子中篩選能誘導變?yōu)樽仙模崛∑浠蚪MDNA，用限制酶BamHI，Kpn I，Sac I分別酶切處理5小時，用pNB101的Rep蛋白編碼序列750bp片段(序列5)作為探針進行Southern雜交。選擇質(zhì)粒pNB-bopD96N整合到染色體上的菌株作為工程菌，工程菌的Southern雜交結果如圖5B所示，泳道1為BamHI處理，得到約14.3kb的帶；泳道2為Kpn I處理，因為嗜鹽菌中位點較少且此酶易受高鹽影響失活，總DNA故沒有切開；泳道3為Sac I處理，得到5.8kb左右的帶，在較大分子量處有雜帶為基因組DNA酶切不完全所致。酶切結果與交換圖分析(圖5A)結果一致。共篩選得到5株工程菌，將其中的一株即鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.1415。
含游離或整合型表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子都能表達紫膜蛋白，但是整合的表達質(zhì)粒由于bop突變體基因與野生型bop基因的位置及拷貝數(shù)完全相同，因而不會對受體菌生長產(chǎn)生負面影響。同時含有嗜鹽菌復制子，即使被重新環(huán)化從染色體上掉下來，質(zhì)粒也不會丟失，因為其在復制過程中，又會整合到染色體上，所以具有更好的穩(wěn)定性，這樣的工程菌是很好的紫膜生產(chǎn)菌株。
鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415是質(zhì)粒pNB-bopD96N單交換整合到鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)BRD的染色體上的工程菌；傳代證明，鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCCNo.1415具有極好的穩(wěn)定性(在不含莫維諾林(Mevinolin)的AS-169培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)60代，整合的質(zhì)粒仍穩(wěn)定存在)。該工程菌經(jīng)光照和低氧誘導培養(yǎng)，紫膜蛋白產(chǎn)量與野生菌相當。
二、紫膜蛋白突變體(D96N突變體)的表達1、紫膜蛋白的誘導表達挑取鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415單菌落接種到含莫維諾林10μg/ml的AS-169液體培養(yǎng)基的試管中37℃，200rpm震蕩培養(yǎng)直到對數(shù)中期。以試管中的菌液作為種子接種到裝有35mL含莫維諾林10μg/ml的AS-169液體培養(yǎng)基的容積為250mL三角瓶中，37℃，200rpm培養(yǎng)直到對數(shù)中期，再將菌液接種到裝有200mL含莫維諾林10μg/ml的AS-169液體培養(yǎng)基的容積為500mL三角瓶中，37℃，200rpm培養(yǎng)至對數(shù)期后將轉(zhuǎn)速降至150rpm，并將瓶口密閉，同時用100W philips白熾燈距離50em持續(xù)照射，誘導3-4天。
2、紫膜蛋白D96N突變體的分離純化操作在室溫中，離心在4℃進行。
誘導后的培養(yǎng)物在12000rpm離心5min收集菌體，將菌體懸浮于50mL基本鹽溶液(每升基本鹽溶液成分硫酸鎂20g，氯化鉀2g，檸檬酸鈉3g，氯化鈉250g)，加入2-5毫克的DNaseI，置于冰上于水平搖床中輕搖1小時，然后對10mMTris-Cl(pH7.2)透析過夜。將透析物12000rpm離心10min，去除雜質(zhì)，上清為紫色。取上清50000g(20000rpm)離心40min，上清為無色，沉淀懸浮于去離子水，置于30-50％蔗糖密度梯度上，100000g離心2小時。吸出紫色帶，對ddH2O透析過夜，再次50000g(20000rpm)離心40min，棄上清，將沉淀懸浮于少量ddH2O，4℃保存。
取保存液5μL作SDS-PAGE檢測蛋白分子量大小與純度，結果如圖6所示，純化的紫膜蛋白D96N突變體在26KDa處有較濃的帶，為細胞內(nèi)主要功能蛋白；在接近22KDa處有一條較弱的帶為細胞內(nèi)對紫膜蛋白進一步加工產(chǎn)生。將電泳圖譜進行掃描后利用Image Master軟件分析計算得到紫膜蛋白D96N突變體表達水平，鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415的紫膜蛋白D96N突變體(26KDa)的表達量為3-5mg/L。
三、紫膜蛋白D96N突變體的光致變色特性1、紫膜蛋白D96N突變體的吸收光譜檢測將紫膜蛋白D96N突變體懸浮于10mM pH7.0的磷酸鈉緩沖液中，并調(diào)整濃度使其ODλmax在0.8左右，在DU800紫分光光度儀上進行300nm-700nm波長的吸光值檢測。結果如圖7所示，表明野生型紫膜蛋白和紫膜蛋白D96N突變體都在560nm左右有最大吸收峰，不同的是紫膜蛋白D96N突變體在410nm處還有個吸收峰，對應光照產(chǎn)生的M中間態(tài)的存在。
2、光致變色特性的檢測因為D96N突變體質(zhì)子轉(zhuǎn)移過程關鍵氨基酸被突變，轉(zhuǎn)運過程被減速，使在光循環(huán)中出現(xiàn)具有長達5分鐘以上的M態(tài)(野生型僅為毫秒級)，所以可觀察到經(jīng)光照后由紫色(B態(tài))變?yōu)辄S色(M態(tài))，本發(fā)明用制作干膜的方法檢測其光致變色特性。方法如下將紫膜蛋白D96N突變體去離子水懸浮液加入到10％非變性凝膠液中，配成總體積5mL的凝膠液中含1.7mL 30％丙烯酰胺-0.8％甲叉雙丙烯酰胺、1.3mL 1.5MTris-HCl、1mL紫膜蛋白D96N突變體去離子水懸浮液、1mL ddH2O?；靹蚝蠹尤?0μL10％過硫酸銨，5μL TEMED，灌注到1mm間隙的兩塊玻璃板之間，最后在凝膠液上覆蓋一層水。膠凝后倒掉覆蓋水，揭開玻璃板，將凝膠取下夾在兩張玻璃紙之間，用木框固定，室溫晾干，即可得到紫色干膜。由于紫色干膜中含有紫膜蛋白突變體，用鏤刻有數(shù)字“863”的板蓋在膜片上，在強光照射下照射5分鐘。此時，未被遮蓋的紫膜蛋白受光激發(fā)圖案變?yōu)辄S色(M態(tài))，而被遮蓋的蛋白沒有光激發(fā)仍為紫色(B態(tài))，所以揭開板可觀察到明顯的數(shù)字圖案留在膜片上，可分辨的數(shù)字能維持5分鐘左右(圖8)。而野生型紫膜蛋白由于光循環(huán)過程只有幾毫秒，無法觀察到中間態(tài)的存在，在光照后觀察不到顏色的變化。因此具有如此獨特光致變色特性的D96N突變體在光學信息存儲、防偽材料制作等方面有很好的應用前景。
序列表<160>5<210>1<211>1035<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1aggcagcggg catttcacag ccgctgtggc ccacacactc ggtggggtgc gctattttgg 60tatggtttgg aatccgcgtg tcggctccgt gtctgacggt tcatcggtct aaattccgtc120acgagcgtac catactgatt gggtcgtaga gttacacaca tatcctcgtt aggtactgtt180gcatgttgga gttattgcca acagcagtgg agggggtatc gcaggcccag atcaccggac240gtccggagtg gatctggcta gcgctcggta cggcgctaat gggactcggg acgctctatt300tcctcgtgaa agggatgggc gtctcggacc cagatgcaaa gaaattctac gccatcacga360cgctcgtccc agccatcgcg ttcacgatgt acctctcgat gctgctgggg tatggcctca420caatggtacc gttcggtggg gagcagaacc ccatctactg ggcgcggtac gctgactggc480tgttcaccac gccgctgttg ttgttaaacc tcgcgttgct cgttgacgcg gatcagggaa540cgatccttgc gctcgtcggt gccgacggca tcatgatcgg gaccggcctg gtcggcgcac600tgacgaaggt ctactcgtac cgcttcgtgt ggtgggcgat cagcaccgca gcgatgctgt660acatcctgta cgtgctgttc ttcgggttca cctcgaaggc cgaaagcatg cgccccgagg720tcgcatccac gttcaaagta ctgcgtaacg ttaccgttgt gttgtggtcc gcgtatcccg780tcgtgtggct gatcggcagc gaaggtgcgg gaatcgtgcc gctgaacatc gagacgctgc840tgttcatggt gcttgacgtg agcgcgaagg tcggcttcgg gctcatcctc ctgcgcagtc900gtgcgatctt cggcgaagcc gaagcgccgg agccgtccgc cggcgacggc gcggccgcga960ccagcgactg atcgcacacg caggacagcc ccacaaccgg cgcggctttt caacgacaca 1020cgatgagtcc cccac1035<210>2<211>248<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Glu Ala Gln Ile Thr Gly Arg Pro Glu Trp Ile Trp Leu Ala Leu Gly1 5 10 15Thr Ala Leu Met Gly Leu Gly Thr Leu Tyr Phe Leu Val Lys Gly Met20 25 30Gly Val Ser Asp Pro Asp Ala Lys Lys Phe Tyr Ala Ile Thr Thr Leu35 40 45Val Pro Ala Ile Ala Phe Thr Met Tyr Leu Ser Met Leu Leu Gly Tyr50 55 60Gly Leu Thr Met Val Pro Phe Gly Gly Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp65 70 75 80Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asn85 90 95Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp Gln Gly Thr Ile Leu Ala Leu Val100 105 110Gly Ala Asp Gly Ile Met Ile Gly Thr Gly Leu Val Gly Ala Leu Thr115 120 125Lys Val Tyr Ser Tyr Arg Phe Val Trp Trp Ala Ile Ser Thr Ala Ala130 135 140Met Leu Tyr Ile Leu Tyr Val Leu Phe Phe Gly Phe Thr Ser Lys Ala145 150 155 160Glu Ser Met Arg Pro Glu Val Ala Ser Thr Phe Lys Val Leu Arg Asn165 170 175Val Thr Val Val Leu Trp Ser Ala Tyr Pro Val Val Trp Leu Ile Gly180 185 190Ser Glu Gly Ala Gly Ile Val Pro Leu Asn Ile Glu Thr Leu Leu Phe195 200 205Met Val Leu Asp Val Ser Ala Lys Val Gly Phe Gly Leu Ile Leu Leu210 215 220Arg Ser Arg Ala Ile Phe Gly Glu Ala Glu Ala Pro Glu Pro Ser Ala225 230 235 240
Gly Asp Gly Ala Ala Ala Thr Ser245<210>3<211>656<212>DNA<213>鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)<400>3ccgatcaccg acctccactg tccgcggtgc ggatccgacg tgaagatggg gctcccgatg 60ggtgcaaccg tgaagtccgt cacggctgcg tcacgacagg agccgaccag cgacacccag120aaggtgcgaa cggttgagtg ccgcaacgat cacgagtttt tcgtgcgctt cgagtggtaa180cacgcgtgca cgcatcgact tcaccgcggg tgtttcgacg ccagccggcc gttgaaccag240caggcagcgg gcatttcaca gccgctgtgg cccacacact cggtggggtg cgctattttg300gtatggtttg gaatccgcgt gtcggctccg tgtctgacgg ttcatcggtc taaattccgt360cacgagcgta ccatactgat tgggtcgtag agttacacac atatcctcgt taggtactgt420tgcatgttgg agttattgcc aacagcagtg gagggggtat cgcaggccca gatcaccgga480cgtccggagt ggatctggct agcgctcggt acggcgctaa tgggactcgg gacgctctat540ttcctcgtga aagggatggg cgtctcggac ccagatgcaa agaaattcta cgccatcacg600acgctcgtcc cagccatcgc gttcacgatg tacctctcga tgctgctggg gtatgg656<210>4<211>641<212>DNA<213>鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)<400>4tctagatcgc acacgcagga cagccccaca accggcgcgg cttttcaacg acacacgatg 60agtcccccac tcggtcttgt actcgcacga tcgcgcgacg acggcgacgc cgacggcgac120tttccagcgt cgctcaacag gctggctgtc gtcgcgctcg ctggtgcggc tctcgtcggt180gcggcgggtc tgttcgccgt gccgttcctg cggtcgttcg gcatgacgtt ttgggaagcg240ttcaccgttg ttggtgtctc cgagttcgtc tcggccatcg tggcggccct cgcgggctac300cacctctaca ccacgcccga cgactagcag ggcccgctgg cgagccatca ctcccgctgt360ggcgaggcga cggccgttct gtaccgctac cgccggcccg gagtccggga catcggcggg420
gcgatgcgca tcgaacggtc accccacgat tgccggcatg caccgggcgc cgggtcggtt480cgtccggccg agacgcgctg tcgatcccgg cgagacgaca ctgatttacc cgcggtcggc540gtactgccgt cccgacatgg aggaacggac ccgtgcgtat ctccgggggc ggttcggcga600cgtgtaccgc cgtgcggaga tcgacctccc cccgcaagct t641<210>5<211>750<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5atgaacaacc gtccagacgc gagagagggc gtcagccgcc gggtttcgga actcgacccg 60tccgcccttc ccgacggcac cgcgttccgc ccgatctccg tcaccgaggg caccggcctg120cgcgacgagg ccgtgctggt ccgcaccgag aacgggcacc gggcaccgct ggacacgttc180gagtcggtgc cagatggcgc agaactgcag gcacggtccg tctaccgggt gctgaacgca240tggcgggact ggttcgatgg ctaccggaac gcgcacatcg agtacgagga cccggacggg300aaaaccgtac gcacaccgct tgagaacagc tatcagccgg agtacgggaa acgctactac360gcgaagatca aggactggga gcgtggcata gaacgggcgt atcaggcccc gacgatggtg420atggtgacac tttcagcatc gagcgagaac gcgaagggtg ggcgacggtg cccggccgat480cacatgcgcg acatcgccag aggctggaac agcgcgagaa aggcgctaca ccgcgtactc540gacggtttcg agtgggagta cgcgaaggtc tgggagcctc accagagcgg ctacggtcac600atgcacgtcg cggtcgccgt cgacgacccg gccgacgaga tcgagggcga gacgttccgg660ccggtggtcc ggtcgcacgt cgagaacgtg gaaccggcag gatcggccgc acacggcctg720aacgccgtgg gcatgggcga tacggtgagc 750
權利要求
1.表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的載體pNB-bopD96N，是將具有序列表中序列1的核苷酸序列的極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體編碼基因插入到pNB102的EcoRI和ClaI識別位點間得到的表達質(zhì)粒。
2.表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的工程菌，是將pNB-bopD96N導入鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)BRD，得到的可表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的工程菌；所述鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)BRD是將鹽沼鹽桿菌(嗜鹽桿菌)(Halobacterium salinarium)AS1.2061的bop基因編碼序列敲除后得到的菌株。
3.根據(jù)權利要求2所述的表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的工程菌，其特征在于所述鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)BRD按照如下方法獲得將pBRD101轉(zhuǎn)化鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS1.2061，篩選得到不表達bop基因的菌株即為鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)BRD；所述pBRD101按照如下方法構建1)將具有序列表中序列3的核苷酸序列的由656bp組成的DNA片段插入pUCm-T，得到含有該656bp序列的重組載體pbopP；2)將具有序列表中序列4的核苷酸序列的由641bp組成的DNA片段用Xba I和Hind III酶切后插入pbopP的Xba I和Hind III識別位點之間，得到重組載體pbopPT；3)將莫維諾林(Mevinolin)抗性基因片段插入pbopPT的EcoR I和Kpn I識別位點間，得到bop基因敲除載體pBRD101。
4.根據(jù)權利要求2所述的表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的工程菌，其特征在于所述表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的工程菌為鹽沼鹽桿菌(Halobac terium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415。
5.表達純化極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的方法，是將鹽沼鹽桿菌(Halobacterium salinarium)AS-D96N CGMCC No.1415在含10μg/ml的莫維諾林(Mevinolin)的AS-169培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期后，再誘導3-4天至培養(yǎng)物成淡紫色，收集菌體，將菌體懸浮于基本鹽溶液中，加入DNaseI，透析7-10小時，通過超速離心和蔗糖密度梯度離心分離得到純的極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的載體及工程菌與應用。本發(fā)明所提供的表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的載體pNB－bopD96N，是將具有序列表中序列1的核苷酸序列的極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體編碼基因插入到pNB102的EcoRI和ClaI識別位點間得到的表達質(zhì)粒。本發(fā)明所提供的表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的工程菌，是將pNB－bopD96N導入鹽沼鹽桿菌BRD，得到的可表達極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的工程菌；所述鹽沼鹽桿菌BRD是將鹽沼鹽桿菌AS1.2061的bop基因編碼序列敲除后得到的菌株。本發(fā)明工程菌表達的極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體的表達量為3－5mg/L，該工程菌表達的極端嗜鹽古菌紫膜蛋白突變體在光學信息存儲、防偽材料制作等方面有很好的應用前景。
文檔編號C12P21/02GK1746303SQ20051008772
公開日2006年3月15日 申請日期2005年8月5日 優(yōu)先權日2005年8月5日
發(fā)明者向華, 周利剛, 周梅先, 孫超岷, 周堅 申請人:中國科學院微生物研究所