一種m13噬菌體介導(dǎo)的納米鐵還原鎘離子的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了屬于環(huán)境污染治理及納米材料制備領(lǐng)域的一種M13噬菌體介導(dǎo)的納米鐵還原鎘離子的方法。該方法采用鐵吸附特異性M13噬菌體介導(dǎo)合成均勻分散的零價納米鐵顆粒，采用鎘吸附特異性M13噬菌體M13(Cd-s)均勻分散二價鎘離子，然后將上述M13噬菌體介導(dǎo)分散的零價納米鐵作為還原劑，高效還原均勻分散于M13(Cd-s)表面的二價鎘離子。本發(fā)明的方法還原效率高，反應(yīng)快速，能夠高效催化二價鎘離子在噬菌體表面被還原為零價鎘，從而去除環(huán)境中的鎘污染，也能快速制備零價鐵、鐵氧化物和零價鎘的納米顆粒。
【專利說明】—種M13噬菌體介導(dǎo)的納米鐵還原鎘離子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米材料制備及環(huán)境污染治理【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種M13噬菌體介導(dǎo)的納米鐵還原鎘離子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鎘(cadmium, Cd)廣泛應(yīng)用于電鍍、電池、汽車、航空、顏料、油漆、印刷、塑料工業(yè)等行業(yè)。鎘在環(huán)境中的常見價態(tài)主要是二價和零價。對大多數(shù)的生物來說，鎘及其化合物都有一定程度的毒性:鎘對呼吸道存在刺激作用，長期暴露會造成嗅覺喪失、牙齦黃斑；鎘化合物不易被腸道吸收，但可經(jīng)呼吸被人體吸收，積存于肝或腎臟造成危害；鎘還可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和軟化。因此，美國環(huán)境保護(hù)署和歐盟都將鎘及其化合物列為高危害有毒物質(zhì)。許多國家對水中鎘含量有嚴(yán)格的規(guī)范，例如美國環(huán)境保護(hù)署只允許飲用水含有IOppb的鎘。隨著近代工業(yè)的發(fā)展，工業(yè)廢水以及廢氣中的鎘及其化合物成為環(huán)境中鎘元素的主要來源。
[0003]鎘污染的治理主要手段之一是通過將環(huán)境中的可溶性鎘及其化合物變成難溶的單質(zhì)或鹽加以去除。因此，鎘污染的治理的關(guān)鍵問題是如何將可溶性鎘及其化合物變成難溶的單質(zhì)或鹽。
[0004]含鎘化合物的還原手段主要有:(I)常規(guī)氧化還原工藝:向污染源中投入改良劑、抑制劑等，改變PH和電導(dǎo)等理化性質(zhì)，使鎘發(fā)生氧化還原作用，降低鎘的生物有效性。例如當(dāng)土壤溶液中金屬陽離子濃度在介質(zhì)中發(fā)生改變(pH、0H\ S042_等)時，能形成金屬的沉淀物而降低環(huán)境中鎘的污染；(2)電化學(xué)方法:美國正在研究用電來凈化土壤。這種方法是利用電流的作用對污染的土壤和地下水進(jìn)行凈化處理，其本質(zhì)也是一種氧化還原作用；
(3)生物除鎘技術(shù):利用環(huán)境中的某些微生物對鎘產(chǎn)生吸收、沉淀、氧化和還原等作用，使環(huán)境中的鎘形成難溶磷酸鹽；原核生物(細(xì)菌、`放線茵)比真核生物(真菌)對鎘更敏感，革蘭氏陽性菌可吸收鎘。
[0005]零價納米鐵作為一種常用的還原劑，在重金屬污染的治理過程中扮演著越來越重要的角色。相比于普通鐵粉，納米鐵具有粒徑小、比表面積大的優(yōu)勢，這些優(yōu)點大大提高了重金屬還原反應(yīng)的效率。然而納米鐵在制備過程中極易團(tuán)聚，穩(wěn)定性不高，因此如何解決納米零價鐵在制備過程中的團(tuán)聚問題將成為該法成敗的關(guān)鍵。
[0006]有研究表明，M13噬菌體十二肽展示肽庫和七肽展示肽庫中十二肽或七肽表達(dá)在M13噬菌體一端5個拷貝的p3蛋白N末端，復(fù)雜度為~2.7X IO9個轉(zhuǎn)化子。肽庫中各噬菌體及野生型噬菌體周身2700個拷貝的p8蛋白N-末端序列均為N-Ala-Glu-Gly-Asp-Asp-Pro-Ala....。這些M13噬菌體具有特異性吸附鐵陽離子的能力(Ling T，et al.Virus-mediated FCC Iron Nanoparticle Induced Synthesis of UraniumDioxide Nanocrystal.Nanotechnology, 2008，19 (11):115608-115613)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種常溫常壓條件下高效還原二價鎘離子(Cd(II))的方法。
[0008]本發(fā)明的方法從生物和納米技術(shù)前沿出發(fā)，以對人類無害的大腸桿菌病毒——絲狀 Ml3 卩遼菌體(Sambrook J 等，Molecular Cloning:A Laboratory manual, Cold SpringHarbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989)為模板(約 880X 7nm),通過具有鐵吸附特異性和鎘吸附特異性的兩種M13噬菌體對零價納米鐵合成和二價鉻離子分散的分別介導(dǎo)，在常溫常壓條件下實現(xiàn)了二價鎘陽離子(Cd(II))的高效還原。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0010]一種M13噬菌體介導(dǎo)的納米鐵還原鎘離子的方法，于常溫常壓下，首先采用鐵吸附特異性M13噬菌體(M13 (Fe-s))制備M13噬菌體表面分散的納米零價鐵(Fe-Ml3 (Fe-s))，再采用鎘吸附特異性Ml3噬菌體(Ml3 (Cd-s))制備Ml3噬菌體表面分散的二價鎘離子(0(1(11)^13化(1-8))，最后將上述肌3噬菌體表面分散的納米零價鐵作(Fe-M13(Fe-s))為還原劑，與M13噬菌體表面分散的二價鎘離子(Cd (II)-M13 (Cd-s))混合，實現(xiàn)鎘離子的還原。
[0011]氧化還原反應(yīng)后，Cd(II)在噬菌體表面被還原為納米零價鎘，零價鐵則在噬菌體表面被氧化為鐵的氧化物。
[0012]所述M13噬菌體表面分散的納米零價鐵的制備方法為:是將溶解在pH7.5的Tris-HCl緩沖液中的鐵吸附特異性的M13噬菌體與氯化亞鐵溶液混合后，再經(jīng)硼氫化鈉還原得到。
[0013]上述M13(Fe_s)介導(dǎo)合成的納米零價鐵的直徑約為5_10nm。
[0014]所述M13噬菌體表面分散的二價鎘離子的制備方法，是將溶解在pH7.5的Tris-HCl緩沖液中的鎘吸附特異性的M13噬菌體與二 氯化鎘溶液均勻混合，得到M13噬菌體表面分散的二價鎘離子。
[0015]所述鐵吸附特異性M13噬菌體為pVIII衣殼蛋白未經(jīng)改造的M13噬菌體。
[0016]所述pVIII衣殼蛋白未經(jīng)改造的M13噬菌體為野生型M13噬菌體(例如，NEB公司，Beverly，MA)或者末端5個拷貝的PIII蛋白插入十二肽或七肽的重組M13噬菌體。
[0017]所述鎘吸附特異性M13噬菌體為pVIII衣殼蛋白N-末端具有鎘吸附特異性七肽的基因重組Ml3噬菌體。
[0018]所述的鎘吸附特異性七肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 或 SEQID NO:9 所示。
[0019]本發(fā)明的目的同時在于提供一種鎘吸附特異性M13噬菌體。
[0020]本發(fā)明的目的也在于提供一種含有上述鎘吸附特異性七肽的基因的M13噬菌體表達(dá)載體。
[0021]本發(fā)明的目的還在于提供含有上述鎘吸附特異性七肽的基因的轉(zhuǎn)化體。
[0022]上述高效還原二價鎘離子的方法，在鉻離子、鉛離子、銅離子、鋅離子、鈾離子、鈷離子等其它重金屬陽離子中的也可普遍應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明一種高效還原二價鎘的方法，所有反應(yīng)步驟均在常溫常壓下進(jìn)行。本發(fā)明鐵吸附特異性的M13噬菌體介導(dǎo)合成的零價鐵納米顆粒，均勻分散于曬菌體表面,顆粒直徑僅為5~IOnm,遠(yuǎn)低于無曬菌體介導(dǎo)時硼氫化鈉化學(xué)還原合成的鐵納米顆粒(100~200nm)，從而具有更好的反應(yīng)性；采用上述零價納米鐵來還原經(jīng)鎘吸附特異性的M13噬菌體均勻分散的鎘離子，由于鐵納米顆粒不發(fā)生團(tuán)聚，鎘離子還原后還可沉積到鎘特異性噬菌體表面從而避免產(chǎn)物沉積到鐵納米顆粒表面造成反應(yīng)減緩或終止，因此反應(yīng)快速，不到60秒就可以完成還原反應(yīng)，還原率可以達(dá)到100%。與化學(xué)法合成的零價鐵納米顆粒還原二價鎘離子相比，還原率提高43%。采用本發(fā)明提出的一種還原二價鎘離子(Cd (II))的方法，可以高效去除環(huán)境中的鎘污染，也能快速制備零價鐵、鐵氧化物和零價鎘的納米顆粒，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1無噬菌體介導(dǎo)條件下硼氫化鈉還原合成的納米零價鐵電鏡照片。
[0025]圖2鐵吸附特異性M13噬菌體介導(dǎo)合成的納米零價鐵(Fe_M13 (Fe-s))電鏡照片。
[0026]圖3鎘離子在鎘吸附特異性噬菌體上的吸附和均勻分散；A，鎘吸附特異性噬菌體M13(Cd-s)在電鏡下的原始形貌；B，鎘特異性噬菌體M13 (Cd-s)吸附鎘離子后在電鏡下的形貌。
[0027]圖4采用鐵特異性M13噬菌體介導(dǎo)的納米零價鐵(Fe_M13 (Fe-s))高效還原鎘特異性噬菌體分散的鎘離子(Cd(II)-M13 (Cd-S))。
[0028]圖5無噬菌體介導(dǎo)條件下納米零價鐵還原二價鎘離子的產(chǎn)物電鏡照片。
[0029]圖6兩種噬菌體介導(dǎo)的Fe_M13 (Fe-s)還原Cd (II) _M13 (Cd-s)的產(chǎn)物電鏡照片。
【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0031]實施例1鐵吸附特異性M13噬菌`體介導(dǎo)的零價鐵納米顆粒合成
[0032]鐵吸附特異性M13噬菌體的擴(kuò)增:M13噬菌體十二肽展示肽庫試劑盒(Ph.D.-12?Phage Display Peptide Library Kit)和七妝展不妝庫試劑盒(Ph.D._7? Phage DisplayPeptide Library Kit)從NEB公司購買。其中，十二肽和七肽表達(dá)在M13噬菌體一端5個拷貝的PlII蛋白N末端，復(fù)雜度為~2.7X IO9個轉(zhuǎn)化子。肽庫中各噬菌體及野生型噬菌體周身2700個拷貝的pVIII蛋白N-末端序列均為N-Ala-Glu-Gly-Asp-Asp-Pro-Ala....。前期研究表明，這些M13噬菌體具有特異性吸附鐵陽離子的能力(Ling T, etal.Virus-mediated FCC Iron Nanoparticle Induced Synthesis of Uranium DioxideNanocrystal.Nanotechnology, 2008，19(11): 115608-115613)，稱作鐵吸附特異性 M13 噬菌體 M13 (Fe-s)。
[0033]試劑盒中提供的宿主大腸桿菌E.coli ER2738，生長迅速，用于M13噬菌體的增殖。在四環(huán)素抗性平板上挑取ER2738單菌落至20ml LB培養(yǎng)基中，加20 μ I四環(huán)素(20mg/ml乙醇溶液)，371:，200印111搖床培養(yǎng)12h左右(菌體處于對數(shù)前期)，得到可供擴(kuò)增噬菌體使用的大腸桿菌ER273的菌液。將菌液用無菌LB培養(yǎng)基(蛋白胨:10g/L酵母粉:5g/L，氯化鈉:10g/L, ρΗ7.0)進(jìn)行1:100稀釋后加入I μ I NEB試劑盒中的原始肽庫噬菌體，37°C，200rpm搖床培養(yǎng)4.5h至對數(shù)中期。將培養(yǎng)物分裝至7ml離心管，每管盛裝約5ml, 4°C,lOOOOrpm，離心10min。將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，同樣條件下再次離心。吸取上部的上清液(約4ml)，轉(zhuǎn)移到新的離心管，每管加入1/6體積(約700 μ I)的無菌聚乙二醇PEG/NaCl溶液(20%(w/v)PEG-8000，2.5M NaCl)，抽吸混勻，4°C過夜沉淀噬菌體。離心15min，倒掉上清，再離心5min，吸去殘留上清液。加入1ml無菌TBS緩沖液(50mM Tris-HCl，150mMNaCl, pH7.5)重懸，離心5min，使殘余細(xì)胞沉淀。將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5ml微量離心管，200 μ I PEG/NaCl再沉淀,冰上孵育60min。同樣條件下離心10min,棄上清,再離心2min,吸去殘余上清。將沉淀重懸在200 μ I TBS中，離心lmin，沉淀任何殘余的不溶物，即得到擴(kuò)增后的鐵吸附特異性M13噬菌體M13 (Fe-S)0
[0034]M13噬菌體介導(dǎo)的納米零價鐵顆粒合成:取Iml M13 (Fe-s)噬菌體的TBS緩沖液(噬菌體滴度為IOllPfu),室溫條件下與Iml FeC12溶液(4mM)混合5~lOmin，再加入1ml濃度為4mM的NaBH4溶液還原，靜置lOmin。即可得到均勻分散在M13 (Fe_s)表面的納米零價鐵小顆粒，如附圖2所示，顆粒直徑僅為5~10nm，且未發(fā)生團(tuán)聚。在無M13噬菌體條件下，直接將Iml FeC12溶液(4mM)與Iml濃度為4mM的NaBH4溶液混合，即可得到化學(xué)法制備的納米零價鐵顆粒，如附圖1所示，鐵納米顆粒直徑約為100~200nm。
[0035]實施例2鎘吸附特異性的基因工程噬菌體M13 (Cd-s)構(gòu)建
[0036]具有鎘吸附特異性的7肽淘選:使用購自NEB公司的M13噬菌體pill蛋白七肽展示肽庫試劑盒(Ph.D.-7TM Phage Display Peptide Library Kit),進(jìn)行鎘吸附特異性的多肽淘選。鎘金屬塊購自國藥化學(xué)試劑有限公司(上海)。將鎘金屬小塊置于裝有200 μ I含0.1%吐溫-20的TBST緩沖液的小離心管中，加入10 μ 17肽的原始肽庫，震蕩結(jié)合60min。倒掉緩沖液，采用200 μ I的0.1%吐溫-20的TBST緩沖液對金屬塊進(jìn)行10次清洗，只有與Cd結(jié)合力較強(qiáng)的噬菌體才能保留在金屬塊上。再將金屬塊放入200 μ I含20mM Cd離子的TBS緩沖液中進(jìn)行競爭性洗脫。將洗脫得到的噬菌體按照如實施例1所述方法進(jìn)行擴(kuò)增。將TBST緩沖液中的吐溫-20濃度增加到0.3%，采用同樣方法完成第2輪淘選。進(jìn)一步將TBST緩沖液中的吐溫-20濃度增加到0.5%來進(jìn)行第3次、第4次和第5次淘選，最終獲得的M13噬菌體具有與金屬鎘的特異性結(jié)合能力。使用試劑盒EZgeneTMPlasmid Miniprep Kit(BIOMIGA)提取60個獲得的M13噬菌體中的M13KE質(zhì)粒，使用5’ -GTATGGGATTTTGCTAAACAAC-3’為測序引物，對M13KE載體上的pill蛋白基因(gill)的N-末端(北京諾賽公司，SinoGeno`Max(Beijing)C0.，Ltd)進(jìn)行測序,得到如下9個反復(fù)出現(xiàn)的 Cd 特異性吸附多肽:SEQ ID NO:1, SCPICPG ;SEQ ID NO:2, CLDPVCA ；SEQ ID N0:3,YVDRSEH ；SEQ ID NO:4, MPHQLIC ;SEQ ID N0:5, EAHTQPA ；SEQ ID N0:6, DTYFVYC ；SEQ IDNO:7, PIRPRPL ；SEQ ID NO:8，CPTASRP 和 SEQ ID NO:9，QDVPHIG。
[0037]鎘吸附特異性的7肽在M13噬菌體p8衣殼蛋白表面的重組展示:采用內(nèi)切酶 Pst I (15U/μ I,購自 TaKaRa Biotechnology, Dalian)對重組 Μ13ΚΕ 卩遼菌體載體(Mao et al.Virus-Based Toolkit for the Directed Synthesis of Magnetic andSemiconducting Nanowires.Science.2004，303:213-217)進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系為:Pst I,1μ I ；10ΧΗ Buffer,2μ I ;重組Μ13ΚΕ，1μ g ;加無菌水至總體積20 μ 1，37°C，反應(yīng)2小時。將Pst I酶切后的重組M13KE載體進(jìn)行鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，引物序列為:。PCR體系為:LA Taq 聚合酶，5υ/μ 1，0.5μ I ;10XLA PCRBuffer，5 μ I ;dNTPs，8 μ 1，Pst I 酶切液，lng，引物1，序列為:AGGGTGAGGATCCCGCAAAA，20 μ M，I μ I ;導(dǎo)入鎘特異性吸附多肽序列SEQID NO:1 的引物2，序列為:CTACTACAAGGATCCCCCGGACAAATCGGACAG CTGCCTGCAGCGAAAGACAGCATCGGAACGAG，20 μ M，I μ I ;補(bǔ)足無菌水至 50 μ I。94°C，5min 后，94°C，30S，55°C，30S，72°C，7min, 30個循環(huán)。4°C保藏。擴(kuò)增獲得的基因產(chǎn)物采用BamH I降解，反應(yīng)條件同前，只將緩沖液替換為IOXK Buffer。使用T4DNA連接酶，常規(guī)條件下16°C過夜連接。將IOng連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)ΛΕ.coli ER2738的感受態(tài)細(xì)胞，加入1ml SOC培養(yǎng)基(蛋白胨，20g/L ;酵母粉，5g/L ;氯化鈉，0.5g/L，氯化鉀，0.186g/L，氯化鎂，0.95g/L ;葡萄糖，3.6g/L，ρΗ7.0 )，37 °C 孵育 30min。將重組細(xì)胞轉(zhuǎn)入45°C頂層瓊脂(每升含 IOgBacto-Tryptone, 5g Yeast extract, IOg NaCl,Ig MgCl2.6H20, 7g瓊脂粉。)混合，再立刻轉(zhuǎn)移到加入異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)和 5-bromo-4-chloro-3-1ndolyl-β -D-galactoside (X-gal) (50mg IPTG,40mg X_gal,溶于Iml 二甲基甲酰胺)的LB固體平板。重組成功的噬菌體在平板上生長后呈藍(lán)色噬菌斑。采用分子克隆標(biāo)準(zhǔn)方法提取卩遼菌體DNA (Sambrook J等，MolecularCloning:A Laboratorymanual, Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press.1989),測序驗證了 SEQ ID N0:1在pVIII蛋白末端的正確插入。獲得了 pVIII蛋白N-末端為SCPICPG的鎘吸附特異性基因工程M13噬菌體M13 (Cd-s)。
[0038]采用上述基因工程實驗的操作，獲得pVIII蛋白N-末端為SEQ ID NO:2,CLDPVCA以及SEQ ID N0:3-N0:9的鎘吸附特異性基因工程M13噬菌體。其中，相應(yīng)的引物2序列分別為:
[0039]SEQ ID NO: 2 ( C L D P V CA )，A C T A C A A G G A T C C G C A C A A A C C G G A T CCAGACATGCAGCGAAAGACAGCAT ；
[0040]SEQ ID NO: 3 (YVDRSEH) , ACT ACAAGG AT CGTG T T CAGAT CGGT CT ACGTATGCAGCGAAAGACAGCAT ；
[0041]SEQ ID NO: 4 ( MP H Q L I C )，A C T A C A A G G A T C G C A G A T G A G T T G G T GCGGCATTGCAGCGAAAGACAGCAT ；
[0042]SEQ ID NO: 5 ( EAHTQPA) , ACTACAAGGATCTGCCGGTTGTGTGTGTGCTTCTGCAGCGAAAGACAGCAT ；
[0043]SEQ ID NO: 6 ( D T Y F V Y C )，A C T A C A A G G A T C G C A G T A T A C G A A G T ATGTGTCTGCAGCGAAAGACAGCAT ；
[0044]SEQ ID NO: 7 (PIRPRPL) , A CTACAAGGATCGAGCGGT CGCGGT CGGATCGGTGCAGCGAAAGACAGCAT ；
[0045]SEQ ID NO: 8 (CPTASRP ) , ACT ACAAGG AT CCGG T CGAGAT GCTGT CGGGCATGCAGCGAAAGACAGCAT ；
[0046]SEQ ID NO: 9 ( QD VPHI G )，ACT ACAAGG AT CGCCGATGTGCGGT ACG T CTTCTGCAGCGAAAGACAGCAT。
[0047]鎘吸附特異性重組M13噬菌體對鎘離子的吸附效果:將滴度為IO11Pfu的鎘吸附特異性基因工程噬菌體M13 (Cd-s) (pVIII蛋白N-末端肽段為SEQ ID N0:1)溶于200mlof Tris-HCl (ρΗ7.5),再與 200ml 濃度為 2mM 的氯化鎘(Xilong Chemical EngineeringCompany, Ltd.，China)溶液均勻混合 5min。米用 0.22μηι 無菌濾膜(Sartorius StedimBiotech)分離噬菌體，采用等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測定溶液中的殘余鎘離子濃度僅為10%，即90%的二價鎘離子都吸附在了 M13 (Cd-s)表面。對原始噬菌體和吸附了鎘離子的噬菌體進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果如圖3A和3B所示。吸附了二價鎘離子的M13 (Cd-sp)在電子顯微鏡下的襯度顯著增強(qiáng)。[0048]重復(fù)上述方法進(jìn)行實驗，將鎘吸附特異性基因工程噬菌體M13 (Cd-s) (pVIII蛋白N-末端肽段分別為SEQ ID N0:2-N0:9)對鎘離子的吸附效果進(jìn)行檢測，結(jié)果為，pVIII蛋白N-末端肽段為SEQ ID N0:2-N0:9肽段的基因工程噬菌體具有同pVIII蛋白N-末端肽段為SEQ ID NO:1的鎘吸附特異性基因工程噬菌體M13 (Cd-s)相同的鎘特異性吸附能力。
[0049]實施例3M13 (Fe-sp)介導(dǎo)合成的零價納米鐵高效還原M13 (Cd-s)分散的二價鎘離子
[0050]如實施例1所示，常溫常壓條件下合成M13 (Fe-s)介導(dǎo)的納米零價鐵。然后取100 μ L配制好的CdCl2 (500 μ Μ)水溶液，向其中加入IOOyL甲基二甲酚藍(lán)(0.125%)水溶液，待顏色穩(wěn)定后再加入如實施例2所述、約IO11Pfu的Μ13 (Cd-s)，混勻即得M13 (Cd-s)分散的二價鎘離子。將M13 (Fe-s)介導(dǎo)合成的零價納米鐵作為還原劑，常溫常壓下進(jìn)行M13 (Cd-s)分散的鎘離子的還原反應(yīng)。二者在分光光度計的比色皿中充分混合后，立即于605nm處測量吸光度。吸光度變化由甲基二甲酚藍(lán)的顏色變化產(chǎn)生，表征溶液中剩余的鎘離子的含量，結(jié)果如附圖4所示。反應(yīng)45s時，兩種M13噬菌體雙分散介導(dǎo)還原的反應(yīng)體系內(nèi)，鎘離子就已經(jīng)反應(yīng)完全，還原率達(dá)到100%。同樣條件下，進(jìn)行無噬菌體介導(dǎo)的零價納米鐵對二價鎘離子的還原反應(yīng)，測得還原率僅為57%。利用透射電子顯微鏡對還原后的產(chǎn)物進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，無噬菌體條件下，還原產(chǎn)物為不規(guī)則無定形結(jié)構(gòu)，如圖5所示。在M13(Fe-s)和M13 (Cd-s)兩種噬菌體介導(dǎo)的雙分散還原條件下，還原產(chǎn)物分別沉積在兩種噬菌體的表面，形成線狀的納米結(jié)構(gòu)，如附圖6所示。
[0051]重復(fù)上述方法進(jìn)行實驗，將鎘吸附特異性基因工程噬菌體(pVIII蛋白N-末端肽段分別為SEQ ID N0:2-N0:9)分別與鎘離子進(jìn)行吸附分散后，采用M13(Fe-s)介導(dǎo)合成的零價納米鐵對分散在上述噬菌體表面的二價鎘離子進(jìn)行還原，結(jié)果表明，在60s時，還原率均為100%。即pVIII蛋白N-末端肽段為SEQ ID N0:2-N0:9肽段的基因工程噬菌體在鎘離子的還原反應(yīng)中具有同pVIII蛋白N-末端肽段為SEQ ID NO:1的鎘吸附特異性基因工程噬菌體M13 (Cd-s)相同的均勻分散`及加速還原反應(yīng)的效果。
【權(quán)利要求】
1.一種M13噬菌體介導(dǎo)的納米鐵還原鎘離子的方法，其特征在于，于常溫常壓下，首先采用鐵吸附特異性M13噬菌體制備M13噬菌體表面分散的納米零價鐵，再采用鎘吸附特異性M13噬菌體制備M13噬菌體表面分散的二價鎘離子，最后將上述M13噬菌體表面分散的納米零價鐵作為還原劑，與M13噬菌體表面分散的二價鎘離子混合，實現(xiàn)鎘離子的還原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述M13噬菌體表面分散的納米零價鐵的制備方法為:是將溶解在PH7.5的Tris-HCl緩沖液中的鐵吸附特異性的M13噬菌體與氯化亞鐵溶液混合后，再經(jīng)硼氫化鈉還原得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述M13噬菌體表面分散的二價鎘離子的制備方法，是將溶解在PH7.5的Tris-HCl緩沖液中的鎘吸附特異性的M13噬菌體與二氯化鎘溶液均勻混合，得到M13噬菌體表面分散的二價鎘離子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述鐵吸附特異性M13噬菌體為PVIII衣殼蛋白未經(jīng)改造的M13噬菌體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述pVIII衣殼蛋白未經(jīng)改造的M13噬菌體為野生型M13噬菌體或者末端5個拷貝的PIII蛋白插入十二肽或七肽的重組M13噬菌體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述鎘吸附特異性M13噬菌體為PVIII衣殼蛋白N-末端具有鎘吸附特異性七肽的基因重組M13噬菌體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的鎘吸附特異性七肽的氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO:USEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO:8 或 SEQ ID NO:9 所示。
8.權(quán)利要求6所述的鎘吸附特異性M13噬菌體。
9.含有權(quán)利要求7所述的鎘吸附`特異性七肽的基因的M13噬菌體表達(dá)載體。
10.含有權(quán)利要求7所述的鎘吸附特異性七肽的基因的轉(zhuǎn)化體。
【文檔編號】C12P3/00GK103882064SQ201410090776
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】于慧敏, 張帥, 中野和彥, 沈忠耀 申請人:清華大學(xué)