一種菌影載體的構(gòu)建方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種菌影載體，所述菌影載體包含錨定基因E’、巴氏桿菌OmpH基因、裂解盒（pBV220-E從阻遏蛋白到終止子的全部序列）和質(zhì)粒載體pET28a。所述菌影載體中的裂解盒（ci857-E-T1T2）獨(dú)立存在于pET28a的非多克隆位點(diǎn)區(qū)，與pET28a原有的表達(dá)系統(tǒng)形成兩個(gè)獨(dú)立的表達(dá)系統(tǒng)，且方向相反，便于在pET28a的多克隆位點(diǎn)區(qū)插入目的蛋白基因，蛋白表達(dá)時(shí)不會(huì)影響目的蛋白的構(gòu)象，且不易發(fā)生通譯現(xiàn)象。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種菌影載體的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種菌影載體的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]菌影是由于噬菌體裂解基因E在革蘭氏陰性菌中表達(dá)的裂解蛋白使菌體的內(nèi)外膜出現(xiàn)40nm-200nm的小孔，因滲透壓的作用使菌體的內(nèi)容物溢出而成的細(xì)菌空殼。菌影疫苗在制作過(guò)程中，受物理和化學(xué)因素的破壞因素小，基本保持了免疫原的天然結(jié)構(gòu)，能夠作為良好的免疫原對(duì)動(dòng)物起到免疫保護(hù)作用。在國(guó)外菌影疫苗作為多聯(lián)苗、多價(jià)苗即將進(jìn)入市場(chǎng)，但在國(guó)內(nèi)，對(duì)于菌蛻的研究尤其是作為運(yùn)輸載體的研究還剛剛起步，其中還有很多問(wèn)題需要我們?nèi)パ芯亢吞接憽?br> [0003]菌影作為免疫原直接作用機(jī)體，也可作為載體向機(jī)體遞送蛋白質(zhì)、核酸以及其他藥物，均獲得了一定的進(jìn)展。菌影作為載體遞送蛋白質(zhì)，主要用兩種途徑實(shí)現(xiàn):(一)將純化好的蛋白直接浸泡裝載到菌影中，添加鈣黃綠素可以使膜囊與菌影內(nèi)膜相融合將菌影縫合起來(lái)；(二)利用錨定蛋白將目的蛋白固定靶向細(xì)菌內(nèi)膜上。在現(xiàn)有的重組菌影疫苗中，用于傳輸外源亞單位蛋白的膜錨定序列主要有:外膜錨定蛋白OmpA (在細(xì)胞膜外表達(dá))、胞漿周隙錨定蛋白SbsA (在細(xì)胞周質(zhì)中表達(dá))、內(nèi)膜錨定蛋白E’(噬菌體PhiX174裂解蛋白E上的第1-54位氨基酸)和L’(在細(xì)胞內(nèi)膜中表達(dá))。
[0004]目前研究者利用錨定蛋白將目的蛋白固定靶向細(xì)菌內(nèi)膜上制備菌影的方法均是將裂解基因E、錨定序列以及目的蛋白串聯(lián)表達(dá)，這對(duì)目的蛋白的大小以及空間結(jié)構(gòu)均有要求，且目的蛋白與錨 定序列串聯(lián)后的空間結(jié)構(gòu)可能會(huì)干擾裂解基因E的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建菌影載體的新方法。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種菌影載體，所述菌影載體包含錨定基因E’、巴氏桿菌OmpH基因、pBV220-E載體的表達(dá)原件ci857_E_TlT2和質(zhì)粒載體pET28a。
[0007]進(jìn)一步地，所述菌影載體為雙向表達(dá)載體，且兩表達(dá)系統(tǒng)的方向相反。一種表達(dá)系統(tǒng)為pET28a原有的表達(dá)系統(tǒng)，可用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，用來(lái)表達(dá)錨定基因與巴氏桿菌OmpH串聯(lián)基因；另一種表達(dá)系統(tǒng)ci857-E-TlT2方向與之相反，通過(guò)升溫誘導(dǎo)表達(dá)裂解基因E，用于制造菌影，兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)獨(dú)立存在，互不干擾。
[0008]其中，所述巴氏桿菌OmpH基因來(lái)自牛巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC393。
[0009]其中，所述pBV220-E載體的表達(dá)原件ci857-E-TlT2為pBV220_E載體基因序列中從阻遏蛋白到終止子的全部基因序列，此序列構(gòu)成了裂解盒。
[0010]本發(fā)明還提供了前述菌影載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0011]I)以噬菌體PhiX174RFl質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增裂解基因E，將裂解基因E與T載體連接，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒；[0012]2)將步驟I)得到的陽(yáng)性質(zhì)粒，亞克隆到質(zhì)粒pBV220中，得到重組質(zhì)粒pBV220_E ；
[0013]3)以步驟2)得到的重組質(zhì)粒pBV220-E的DNA為模板，PCR擴(kuò)增E’基因；
[0014]4)以巴氏桿菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增OmpH基因，用柔性肽Gly4Ser經(jīng)overlapPCR將步驟3)得到的E’基因與OmpH基因連接在一起，形成融合片段E’ -OmpH ；
[0015]5)將融合片段E’ -OmpH其插入到質(zhì)粒載體pET28a多克隆位點(diǎn)區(qū)的EcoR1、Sal I位點(diǎn)上，經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)或Rossta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，酶切鑒定陽(yáng)性克隆，得到重組表達(dá)載體E’ -0mpH-pET28a ；
[0016]6)將步驟2)得到的重組質(zhì)粒pBV220-E的ci857_E_TlT2基因序列(從阻遏蛋白到終止子的全部基因序列)亞克隆到重組表達(dá)載體E’ -0mpH-pET28a的SgrAI和SphI酶切位點(diǎn)上，構(gòu)建雙向表達(dá)載體E’ -0mpH-pET28a-ci857-E-TlT2。
[0017]構(gòu)建得到的雙向表達(dá)載體，通過(guò)熱激，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)或Rossta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，酶切鑒定證明雙向表達(dá)載體E’ -0mpH-pET28a-ci857-E-TIT2構(gòu)建成功。經(jīng)IPTG、42°C迅速升溫誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE, westernblot、菌影28°C培養(yǎng)等鑒定，證明成功制備了錨定牛巴氏桿菌OmpH的大腸桿菌菌影。
[0018]本發(fā)明還提供了前述菌影載體在大腸桿菌菌影中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明的有益效果在于:
[0020]本發(fā)明所述菌影載體E’ -0mpH-pET28a-ci857-E-TlT2,能夠使目的蛋白與菌影獨(dú)立表達(dá)。所述菌影載體中的裂解盒(PBV220-E從阻遏蛋白到終止子的全部序列)獨(dú)立存在于pET28a的非多克隆位點(diǎn)區(qū)，與pET28a原有的表達(dá)系統(tǒng)形成2個(gè)獨(dú)立的表達(dá)系統(tǒng)，且方向相反，便于在pET28a的多 克隆位點(diǎn)區(qū)插入目的蛋白基因，避免了目的蛋白基因?qū)α呀饣駿的干擾，蛋白表達(dá)時(shí)不會(huì)影響目的蛋白的構(gòu)象，且不易發(fā)生通譯現(xiàn)象。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為菌影載體E’ -0mpH-pET28a-ci857-E-TlT2的構(gòu)建流程圖；
[0022]圖2為pBV220-E/DH5 α菌影電鏡投射圖；
[0023]圖3為DH5 α正常大腸桿菌電鏡投射圖；
[0024]圖4為重組融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果；
[0025]其中:
[0026]M 為蛋白質(zhì) Marker ；
[0027]I 為誘導(dǎo)前的重組表達(dá)載體 E’ -0mph-pET28a-ci857-E-TlT2/B121 (DE3)；
[0028]2 為重組表達(dá)載體 E’ -0mph-pET28a-ci857-E-TlT2/B121 (DE3)先 28°C IPTG 誘導(dǎo)12h 后42°C誘導(dǎo) 2h ；
[0029]3 為 37°C IPTG 誘導(dǎo) 5h 的 E’ -0mph-pET28a-ci857-E_TlT2/B121 (DE3)重組菌；
[0030]4 為 28°C IPTG 誘導(dǎo) 12h 的 E’ -0mph-pET28a-ci857-E_TlT2/B121 (DE3)重組菌；
[0031]5 為 28°C IPTG 誘導(dǎo) 5h 的 E’ -0mph-pET28a-ci857-E_TlT2/B121 (DE3)重組菌。
[0032]6 為 37°C IPTG 誘導(dǎo) 5h E’ -0mph-pET28a-ci857-E_TlT2/Rossta (DE3)重組菌；
[0033]7 為 28°C IPTG 誘導(dǎo) 12h E’ -0mph-pET28a-ci857-E_TlT2/Rossta (DE3)重組菌；
[0034]8 為 28°C IPTG 誘導(dǎo) 5h 的 E’ -0mph-pET28a-ci857-E_TlT2/Rossta (DE3)重組菌；
[0035]圖5為重組蛋白E’ -OmpH的Western blot分析；[0036]其中:
[0037]M為蛋白預(yù)染marker ；
[0038]I為陰性對(duì)照；
[0039]2為重組蛋白E’ -OmpH ；
[0040]圖6 (a)為 E’ -0mPH-PET28a-ci857-E_TlT2/BL21IPTG 誘導(dǎo)后四小時(shí)切片圖；
[0041]圖6 (b)為 E’ -0mPH-PET28a-ci857-E-TlT2/BL21IPTG 誘導(dǎo)四小時(shí)后升溫誘導(dǎo) 2h制成的菌影切片圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0043]實(shí)驗(yàn)材料:pBV220 (含有λ pL/pR啟動(dòng)子、阻遏蛋白cI857)本實(shí)驗(yàn)室保存。噬菌體PhiX174質(zhì)粒RFl和pMD18-T:購(gòu)自大連TAKALA生物公司。E.coli宿主菌BL21 (DE3)、宿主菌Rossta (DE3)、原核表達(dá)載體pET28a均為本實(shí)驗(yàn)室保存。巴氏桿菌CVCC393購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)fermentas公司。
[0044]實(shí)施例1以PBV220為載體制備大腸桿菌菌影
[0045]1、E基因的設(shè)計(jì)與合成
[0046]應(yīng)用01igo6 .0及primer5.0軟件，根據(jù)GenBank中登錄的噬菌體PhiX174裂解基因E的編碼序列(NC-001422)設(shè)計(jì)引物。在上游引物5'末端引入限制性酶切位點(diǎn)EcoRI，下游5'末端引入限制性酶切位點(diǎn)Sal I限制性酶切位點(diǎn)，兩端分別隨意加入幾個(gè)保護(hù)性堿基。引物由上海生工合成部門(mén)進(jìn)行合成。
[0047]E 上游引物 El:5’ -CGCGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGT G-3’，下劃線內(nèi)序列為限制性酶切位點(diǎn)EcoRI酶切位點(diǎn)。
[0048]E 下游引物 E2:5' -ACGCGTCGACTCACTCCTTCCGCACG TAAT-3 ’，下劃線內(nèi)序列為限制性酶切位點(diǎn)Sal I酶切位點(diǎn)。
[0049]2、E基因的PCR擴(kuò)增
[0050]將TAKARA 公司編號(hào)為 D3040 噬菌體 PhiX174RF15000r/min 離心 5min ；加入500 μ LddH2O懸浮沉淀；取5 μ L作為PCR擴(kuò)增模板。
[0051]PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1:
[0052]表150 μ L PCR反應(yīng)體系
[0053]
__體積(μΡ_
dNTP ( IOmM)5
上游引物ElUO μΜ)2.5
下游引物Ε2(10μΜ)2.5
PHiX 174 RF 丨質(zhì)檢5
Ex Taq ( 5 u/pL )I
[0054]
【權(quán)利要求】
1.一種菌影載體，其特征在于，所述菌影載體包含錨定基因E’、巴氏桿菌OmpH基因、PBV220-E載體的表達(dá)原件ci857-E-TlT2和質(zhì)粒載體pET28a。
2.如權(quán)利要求1所述的菌影載體，其特征在于，所述菌影載體為雙向表達(dá)載體。
3.如權(quán)利要求1所述的菌影載體，其特征在于，所述巴氏桿菌OmpH基因來(lái)自牛巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC393。
4.如權(quán)利要求1所述的菌影載體，其特征在于，所述PBV220-E載體的表達(dá)原件ci857-E-TlT2為pBV220_E載體基因序列中從阻遏蛋白到終止子的全部基因序列。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的菌影載體，其特征在于，所述菌影載體的構(gòu)建方法包括如下步驟: 1)以噬菌體PhiX174RFl質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增裂解基因E，將裂解基因E與T載體連接，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒； 2)將步驟I)得到的陽(yáng)性質(zhì)粒，亞克隆到質(zhì)粒pBV220中，得到重組質(zhì)粒pBV220-E； 3)以步驟2)得到的重組質(zhì)粒pBV220-E的DNA為模板，PCR擴(kuò)增E’基因； 4)以巴氏桿菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增OmpH基因，用柔性肽Gly4Ser經(jīng)overlapPCR將步驟3)得到的E’基因與OmpH基因連接在一起，形成融合片段E’ -OmpH ； 5)將融合片段E’-OmpH其插入到質(zhì)粒載體pET28a多克隆位點(diǎn)區(qū)的EcoR1、Sal I位點(diǎn)上，經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21或Rossta感受態(tài)細(xì)胞中，酶切鑒定陽(yáng)性克隆，得到重組表達(dá)載體 E’ -0mpH-pET28a. ； 6)將步驟2)得到的重組質(zhì)粒pBV220-E的ci857_E_TlT2基因序列亞克隆到重組表達(dá)載體E’ -0mpH-pET28a的SgrAI和SphI酶切位點(diǎn)上，構(gòu)建雙向表達(dá)載體E， -0mpH-pET28a-ci857-E-TlT2。
6.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的菌影載體的構(gòu)建方法,其特征在于,所述構(gòu)建方法包括如下步驟: 1)以噬菌體PhiX174RFl質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增裂解基因E，將裂解基因E與T載體連接，篩選陽(yáng)性質(zhì)粒； 2)將步驟I)得到的陽(yáng)性質(zhì)粒，亞克隆到質(zhì)粒pBV220中，得到重組質(zhì)粒pBV220-E； 3)以步驟2)得到的重組質(zhì)粒pBV220-E的DNA為模板，PCR擴(kuò)增E’基因； 4)以巴氏桿菌基因組為模板，PCR擴(kuò)增OmpH基因，用柔性肽Gly4Ser經(jīng)overlapPCR將步驟3)得到的E’基因與OmpH基因連接在一起，形成融合片段E’ -OmpH ； 5)將融合片段E’-OmpH其插入到質(zhì)粒載體pET28a多克隆位點(diǎn)區(qū)的EcoR1、Sal I位點(diǎn)上，經(jīng)克隆轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21或Rossta感受態(tài)細(xì)胞中，酶切鑒定陽(yáng)性克隆，得到重組表達(dá)載體 E’ -0mpH-pET28a ； 6)將步驟2)得到的重組質(zhì)粒pBV220-E的ci857_E_TlT2基因序列亞克隆到重組表達(dá)載體E’ -0mpH-pET28a的SgrAI和SphI酶切位點(diǎn)上，構(gòu)建雙向表達(dá)載體E， -0mpH-pET28a-ci857-E-TlT2。
7.權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的菌影載體在大腸桿菌菌影中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103436550SQ201310319778
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月26日
【發(fā)明者】朱戰(zhàn)波, 姜東君, 于立權(quán), 崔玉東, 王鶴, 梁宏儒, 趙達(dá), 胡旭, 高佳濱, 陳為宏, 尹輝, 喬波, 陳楠楠 申請(qǐng)人:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)