一種促進重組蛋白胞外分泌的發(fā)酵工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進重組蛋白胞外分泌的發(fā)酵工藝，屬于發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明以含有重組蛋白基因的大腸桿菌為生產(chǎn)菌株，在工業(yè)級發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)流加甘油進行分批補料發(fā)酵，對數(shù)生長期開始流加乳糖進行誘導產(chǎn)酶，在發(fā)酵過程中流加甘氨酸促進重組蛋白的胞外分泌。采取本策略進行發(fā)酵實現(xiàn)了重組蛋白的高效胞外表達，大幅提高了重組蛋白的生產(chǎn)強度。本工藝采用工業(yè)上常用的甘油、蛋白胨、酵母粉、無機鹽等原料進行生產(chǎn)，簡單易行，適于大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種促進重組蛋白胞外分泌的發(fā)酵工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明涉及一種促進重組蛋白高效胞外表達的發(fā)酵生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌作為一種的宿主菌，憑借遺傳背景清晰，培養(yǎng)條件簡單，生長周期短，表達效率高等優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于重組蛋白的高效制備。根據(jù)最終定位方式，采用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達外源蛋白有三種形式:胞內(nèi)表達、周質(zhì)表達以及胞外基質(zhì)表達。相比胞內(nèi)和周質(zhì)有限的空間，胞外空間更廣闊，更有利于重組蛋白的大量積累。此外，將重組蛋白分泌至胞外，無需破碎細胞或周質(zhì)釋放即可收集產(chǎn)品，而且不會因為細胞破碎引入大量雜蛋白，極大地簡化了下游純化步驟。由于大腸桿菌特殊的雙層細胞膜結(jié)構(gòu)嚴重阻礙重組蛋白的胞外分泌，導致其在工業(yè)上的應(yīng)用受到限制，并且大大增加生產(chǎn)成本。因此，促進重組蛋白的胞外分泌具有很重要的工業(yè)意義。
[0003]本發(fā)明選取三種重要的工業(yè)用酶普魯蘭酶，α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(簡稱a-CGT酶)和角質(zhì)酶作為報告蛋白。普魯蘭酶是一種能夠水解普魯蘭多糖、支鏈淀粉、α-極限糊精等分子中的α-1，6葡萄糖苷鍵的淀粉脫支酶。由于普魯蘭酶可以切斷淀粉中的分支點，縮短反應(yīng)時間，提高淀粉的轉(zhuǎn)化率，廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)葡萄糖、果糖、麥芽糖、麥芽糊精、低聚糖等產(chǎn)品。a-CGT酶是糖基水解酶α-淀粉酶家族的重要成員，它能夠通過環(huán)化反應(yīng)將淀粉或淀粉類底物轉(zhuǎn)化為α-環(huán)糊精。α-環(huán)糊精在食品、分子識別和納米材料等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。角質(zhì)酶是一種多功能酶，能夠催化各類聚酯、不溶性的甘油三酯和小分子可溶性酯類物質(zhì)的水解反應(yīng)，多種酸和醇的酯化反應(yīng)以及酯和醇的酯交換反應(yīng)，在紡織、洗滌劑、酯合成以及環(huán)保等諸多領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種促進重組蛋白胞外分泌的發(fā)酵工藝，以解決現(xiàn)有發(fā)酵工藝中胞外酶活較低、生產(chǎn)成本高的問題。
[0005]為解決上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]一種促進重組蛋白胞外分泌的發(fā)酵工藝，以含有重組蛋白基因的E.coliBL21(DE3)為生產(chǎn)菌種，具體過程如下:
[0007](I)種子制備:將_80°C甘油管保存的菌株接入種子培養(yǎng)基中，使用回轉(zhuǎn)恒溫調(diào)速搖床進行培養(yǎng)，控制轉(zhuǎn)速200rpm/min，培養(yǎng)溫度37°C，初始pH值7.10，培養(yǎng)時間8_10小時。
[0008](2)發(fā)酵工藝:將種子培養(yǎng)液接種入發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風量使溶氧維持20-30 %，控制溫度為37 ± I °C，流加質(zhì)量濃度為25 %的氨水控制pH7.0 ±0.5，培養(yǎng)6-7小時，待溶氧快速上升至80-100%，以指數(shù)流加的方式補加補料液并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速及通風使溶氧維持在20-30%，發(fā)酵培養(yǎng)28-32小時。
[0009](3)甘油補料:發(fā)酵培養(yǎng)進行到6-8小時后,通過補加500g/L的甘油補料液,使發(fā)酵液中甘油濃度維持在l_5g/L ；
[0010](4)甘氨酸補料:發(fā)酵培養(yǎng)10-15小時(OD6tltl為10-20)后，以l_2g/L/h的流速加Λ 200g/L甘氨酸溶液。
[0011](6)乳糖誘導:發(fā)酵培養(yǎng)15-20小時，菌體吸光度0D_達到20-50時，降溫至25-30°C，以0.2-2g/L/h的流速加入200g/L乳糖溶液進行誘導產(chǎn)酶。誘導25-30小時左右。
[0012]所述種子培養(yǎng)基的組成為(g/L):工業(yè)級蛋白胨10，工業(yè)級酵母粉5，NaCllO,pH7.10。接種前添加100mg/L氨節(jié)青霉素。
[0013]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(g/L):甘油6，工業(yè)級蛋白胨12，工業(yè)級酵母粉24，KH2P042.31，K2HPO4.3H2016.43，微量元素液10mL/L。接種前添加100mg/L氨芐青霉素。
[0014]所述微量元素液為(g/L)=FeSO4.7H2010，ZnSO4.7Η202.25，CuSO4.5Η201.0，MnSO4.4Η200.5，Na2B4O7.IOH2O0.23，CaCl22.0, (NH4)6Mo7O240.1。
[0015]所述補料液為(g/L):甘油500，MgSO4.7H2020，蛋白胨15，酵母粉30。
[0016]所述甘油補料液質(zhì)量分數(shù)為50% (500g/L);甘油含量的測定方法采用HPLC:Zorbax Extend_C18 (4.6mmX 250mm, 5 μ m),柱溫 35°C，進樣量:10 μ L,不差折光檢測器溫度:35°C,流速:1.0mL/min，流動相:純水；發(fā)酵培養(yǎng)4小時后，每隔I小時,對發(fā)酵液中甘油濃度進行一次測定 ，根據(jù)測定結(jié)果加入一定體積的補料液，使發(fā)酵液中甘油濃度維持在
l-5g/L。
[0017]本發(fā)明采用流加甘氨酸工藝以及誘導控制工藝結(jié)合其它發(fā)酵控制工藝(如:分段控溫發(fā)酵工藝、恒定溶氧控制工 藝、PH控制工藝、補料分批發(fā)酵控制工藝)，使得大腸桿菌細胞膜通透性提高，促進目標蛋白的胞外基質(zhì)分泌。
【具體實施方式】
[0018]實施例1
[0019]以本實驗室構(gòu)建的重組大腸桿菌pulB/pET20b(+)/BL21 (DE3)為生產(chǎn)菌種(一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高淀粉脫支酶產(chǎn)量的方法.CN201210035298.0)。
[0020]1、種子培養(yǎng):將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養(yǎng)基(工業(yè)級蛋白胨10g/L，工業(yè)級酵母粉5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.10)中，使用恒溫搖床進行培養(yǎng):轉(zhuǎn)速200rpm/min，溫度37°C，培養(yǎng)8小時。
[0021]2、發(fā)酵產(chǎn)酶:
[0022]分批發(fā)酵階段:將種子液以8%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(甘油6g/L，工業(yè)級蛋白胨12g/L，工業(yè)級酵母粉 24g/L，KH2P042.31g/L，K2HPO4.3H2016.43g/L，微量元素液 10mL/L，氨芐青霉素100mg/L)，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風量使溶氧維持30%，控制溫度為37°C，流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制pH7.0，培養(yǎng)6-7小時；
[0023]補料發(fā)酵階段:待溶氧上升至80-100%，批式培養(yǎng)結(jié)束后，以指數(shù)流加的方式補加以甘油為碳源的補料液(甘油500g/L，MgSO4.7Η202(^/1，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌體以0.2h-1的比生長速率進行生長，控制溫度37 °C，溶氧維持在30%，通過質(zhì)量濃度為25%的氨水控制ρΗ7.0 ;
[0024]誘導培養(yǎng)階段:當菌體0D_達到50時，將溫度降為25 °C，溶氧維持在30%，以0.8g/L/h的流速連續(xù)補加200g/L乳糖溶液。同時溶氧控制在20-30%，控制pH7.0±0.5，誘導25小時左右，胞外普魯蘭酶活力為66U/mL。
[0025]實施例2
[0026]具體過程如下:本實驗室構(gòu)建的重組大腸桿菌pulB/pET20b (+) /BL21 (DE3)為生產(chǎn)菌種(一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高淀粉脫支酶產(chǎn)量的方法.CN201210035298.0)。
[0027]1、種子培養(yǎng):將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養(yǎng)基(工業(yè)級蛋白胨10g/L，工業(yè)級酵母粉5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.10)中，使用恒溫搖床進行培養(yǎng):轉(zhuǎn)速200rpm/min，溫度37°C，培養(yǎng)8小時。
[0028]2、發(fā)酵產(chǎn)酶:
[0029]分批發(fā)酵階段:將種子液以8%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(甘油6g/L，工業(yè)級蛋白胨12g/L，工業(yè)級酵母粉 24g/L，KH2P042.31g/L，K2HPO4.3H2016.43g/L，微量元素液 10mL/L，氨芐青霉素100mg/L)，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風量使溶氧維持30%，控制溫度為37°C，流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制pH7.0，培養(yǎng)6-7小時；
[0030]補料發(fā)酵階 段:待溶氧上升至80-100%，批式培養(yǎng)結(jié)束后，以指數(shù)流加的方式補加以甘油為碳源的補料液(甘油500g/L，MgSO4.7Η202(^/1，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌體以0.2h-1的比生長速率進行生長，控制溫度37 °C，溶氧維持在30%，通過質(zhì)量濃度為25%的氨水控制pH7.0，當菌體0D_達到10時，以l_2g/L/h的流速連續(xù)補加200g/L甘氨酸溶液；
[0031]誘導培養(yǎng)階段:當菌體0D_達到20時，將溫度降為25°C，溶氧維持在30%，以0.4g/L/h的流速連續(xù)補加200g/L乳糖溶液。同時溶氧控制在20-30%，控制pH7.0±0.5，誘導25小時左右，胞外普魯蘭酶活力為1568U/mL。
[0032]實施例3
[0033]以本實驗室構(gòu)建的重組大腸桿菌a -cgt/pET20b (+)/BL21 (DE3)為生產(chǎn)菌種(一種α -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與表達.CN200810024162.3)。
[0034]1、種子培養(yǎng):將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養(yǎng)基(工業(yè)級蛋白胨10g/L，工業(yè)級酵母粉5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.10)中，使用恒溫搖床進行培養(yǎng):轉(zhuǎn)速200rpm/min，溫度37°C，培養(yǎng)8小時。
[0035]2、發(fā)酵產(chǎn)酶:
[0036]分批發(fā)酵階段:將種子液以8%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(甘油6g/L，工業(yè)級蛋白胨12g/L，工業(yè)級酵母粉 24g/L，KH2P042.31g/L，K2HPO4.3H2016.43g/L，微量元素液 10mL/L，氨芐青霉素100mg/L)，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風量使溶氧維持30%，控制溫度為37°C，流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制pH7.0，培養(yǎng)6-7小時；
[0037]補料發(fā)酵階段:待溶氧上升至80-100%，批式培養(yǎng)結(jié)束后，以指數(shù)流加的方式補加以甘油為碳源的補料液(甘油500g/L，MgSO4.7Η202(^/1，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌體以0.2h-1的比生長速率進行生長，控制溫度37 °C，溶氧維持在30%，通過質(zhì)量濃度為25%的氨水控制ρΗ7.0 ;
[0038]誘導培養(yǎng)階段:當菌體0D_達到50時，將溫度降為25°C，溶氧維持在30%，以0.8g/L/h的流速連續(xù)補加200g/L乳糖溶液。同時溶氧控制在20-30%，控制pH7.0±0.5，誘導25小時左右，胞外a -CGT酶活力為23U/mL。[0039]實施例4
[0040]以本實驗室構(gòu)建的重組大腸桿菌a -cgt/pET20b (+) /BL21 (DE3)為生產(chǎn)菌種(一種α -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆與表達.CN200810024162.3)。
[0041]1、種子培養(yǎng):將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養(yǎng)基(工業(yè)級蛋白胨10g/L，工業(yè)級酵母粉5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.10)中，使用恒溫搖床進行培養(yǎng):轉(zhuǎn)速200rpm/min，溫度37°C，培養(yǎng)8小時。
[0042]2、發(fā)酵產(chǎn)酶:
[0043]分批發(fā)酵階段:將種子液以8%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(甘油6g/L，工業(yè)級蛋白胨12g/L，工業(yè)級酵母粉 24g/L，KH2P042.31g/L，K2HPO4.3H2016.43g/L，微量元素液 10mL/L，氨芐青霉素100mg/L)，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風量使溶氧維持30%，控制溫度為37°C，流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制pH7.0，培養(yǎng)6-7小時；
[0044]補料發(fā)酵階段:待溶氧上升至80-100%，批式培養(yǎng)結(jié)束后，以指數(shù)流加的方式補加以甘油為碳源的補料液(甘油500g/L，MgSO4.7Η202(^/1，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌體以0.2h-1的比生長速率進行生長，控制溫度37 °C，溶氧維持在30%，通過質(zhì)量濃度為25%的氨水控制pH7.0，當菌體0D_達到10時，以l_2g/L/h的流速連續(xù)補加200g/L甘氨酸溶液；
[0045]誘導培養(yǎng)階段:當菌體0D_達到20時，將溫度降為25°C，溶氧維持在30%，以0.4g/L/h的流速連續(xù) 補加200g/L乳糖溶液。同時溶氧控制在20-30%，控制pH7.0±0.5，誘導25小時左右，胞外a -CGT酶活力為128U/mL。
[0046]實施例5
[0047]以本實驗室構(gòu)建的重組大腸桿菌Tfu_0883/pET20b(+)/BL21(DE3)為生產(chǎn)菌種(The journal of biological chemistry.2008,283(38):25854-25862)。
[0048]1、種子培養(yǎng):將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養(yǎng)基(工業(yè)級蛋白胨10g/L，工業(yè)級酵母粉5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.10)中，使用恒溫搖床進行培養(yǎng):轉(zhuǎn)速200rpm/min，溫度37°C，培養(yǎng)8小時。
[0049]2、發(fā)酵產(chǎn)酶:
[0050]分批發(fā)酵階段:將種子液以8%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(甘油6g/L，工業(yè)級蛋白胨12g/L，工業(yè)級酵母粉 24g/L，KH2P042.31g/L，K2HPO4.3H2016.43g/L，微量元素液 10mL/L，氨芐青霉素100mg/L)，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風量使溶氧維持30%，控制溫度為37°C，流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制pH7.0，培養(yǎng)6-7小時；
[0051]補料發(fā)酵階段:待溶氧上升至80-100%，批式培養(yǎng)結(jié)束后，以指數(shù)流加的方式補加以甘油為碳源的補料液(甘油500g/L，MgSO4.7Η202(^/1，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌體以0.2h-1的比生長速率進行生長，控制溫度37 °C，溶氧維持在30%，通過質(zhì)量濃度為25%的氨水控制ρΗ7.0 ;
[0052]誘導培養(yǎng)階段:當菌體0D_達到50時，將溫度降為25°C，溶氧維持在30%，以
0.8g/L/h的流速連續(xù)補加200g/L乳糖溶液。同時溶氧控制在20-30%，控制pH7.0±0.5，誘導25小時左右，胞外角質(zhì)酶活力為31U/mL。
[0053]實施例6
[0054]以本實驗室構(gòu)建的重組大腸桿菌Tfu_0883/pET20b(+)/BL21(DE3)為生產(chǎn)菌種(The journal of biological chemistry.2008,283(38):25854-25862)。
[0055]1、種子培養(yǎng):將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養(yǎng)基(工業(yè)級蛋白胨10g/L，工業(yè)級酵母粉5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.10)中，使用恒溫搖床進行培養(yǎng):轉(zhuǎn)速200rpm/min，溫度37°C，培養(yǎng)8小時。
[0056]2、發(fā)酵產(chǎn)酶:
[0057]分批發(fā)酵階段:將種子液以8%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(甘油6g/L，工業(yè)級蛋白胨12g/L，工業(yè)級酵母粉 24g/L，KH2P042.31g/L，K2HPO4.3H2016.43g/L，微量元素液 10mL/L，氨芐青霉素100mg/L)，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風量使溶氧維持30%，控制溫度為37°C，流加質(zhì)量濃度為25%的氨水控制pH7.0，培養(yǎng)6-7小時；
[0058]補料發(fā)酵階段:待溶氧上升至80-100%，批式培養(yǎng)結(jié)束后，以指數(shù)流加的方式補加以甘油為碳源的補料液(甘油500g/L，MgSO4.7Η202(^/1，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌體以0.2H-1的比生長速率進行生長，控制溫度37 °C，溶氧維持在30%，通過質(zhì)量濃度為25%的氨水控制pH7.0，當菌體0D _達到10時，以l_2g/L/h的流速連續(xù)補加200g/L甘氨酸溶液；
[0059]誘導培養(yǎng)階段:當菌體0D_達到20時，將溫度降為25°C，溶氧維持在30%，以
0.4g/L/h的流速連續(xù)補加200g/L乳糖溶液。同時溶氧控制在20-30%，控制pH7.0±0.5，誘導25小時左右，胞外角質(zhì)酶活力為185U/mL。
【權(quán)利要求】
1.一種提高重組蛋白的胞外生產(chǎn)方法，其特征在于以含有目標蛋白基因的大腸桿菌為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵工藝如下: 將活化后的種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，通過控制攪拌轉(zhuǎn)速和通風量使溶氧維持20-30%，控制溫度為25-37°C，流加氨水控制pH7.0±0.5，培養(yǎng)6_7小時； 當溶氧快速上升至80-100%，以指數(shù)流加的方式補加補料液使溶氧維持在20-30%，溫度維持在25-37°C，流加氨水控制pH7.0±0.5。當菌體生長到一定OD6tltl時，添加適量的甘氨酸溶液；繼續(xù)培養(yǎng)至菌體達到一定OD6tltl時，添加適量的乳糖溶液進行誘導；同時溶氧控制在20-30%，控制ρΗ7.0±0.5，誘導20-30小時。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主大腸桿菌為Ε.coli BL21(DE3)、E.coli W3110.E.coli JM109、E.coli JM109 (DE3)、E.coli DH5 α 中任意一種。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述宿主大腸桿菌為E.coliBL21(DE3)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述甘氨酸的添加方式為一次性添加，分批添加或者連續(xù)添加。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述甘氨酸的添加方式為連續(xù)添加，添加速度為 0.01-10g/L/h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的方法，其特征在于所述開始添加甘氨酸的時機為0D_達到0-50。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述乳糖的添加方式為一次性添加，分批添加或者連續(xù)添加。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述乳糖的添加方式為連續(xù)添加，添加速度為 0.01-10g/L/h。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述開始流加乳糖的時機為0D_達到10-50。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于種子活化用培養(yǎng)基的組成為(g/L):工業(yè)級蛋白胨10，工業(yè)級酵母粉5，NaCllO, pH7.10。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(g/L):甘油6，工業(yè)級蛋白胨12，工業(yè)級酵母粉24，KH2P042.31，K2HPO4.3H2016.43，微量元素液10mL/L。
【文檔編號】C12R1/19GK103981163SQ201410208207
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月13日
【發(fā)明者】吳敬, 鄒純, 段緒果 申請人:江南大學