小鼠抗人ck8單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及以原核表達(dá)的CK8蛋白免疫小鼠獲得的分泌CK8單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株8G8,屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]CK即細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin),是細(xì)胞骨架蛋白之一——中間絲的多基因家族中的一員,為上皮細(xì)胞主要的結(jié)構(gòu)蛋白和分化的早期標(biāo)志物。細(xì)胞角蛋白由30種不同的基因編碼,這些基因可以轉(zhuǎn)錄成分子量不同的20種多肽,分別命名為CKl?CK20。細(xì)胞角蛋白又可根據(jù)等電點(diǎn)的不同分為酸性(I類)蛋白,包括CK9?CK20,其基因被定位在染色體17q;及堿性(Π類)蛋白,包括CKl?CK8,其基因被定位在染色體12q。一般而言,相對分子質(zhì)量小的細(xì)胞角蛋白總是與相對分子質(zhì)量大的細(xì)胞角蛋白配對,而酸性細(xì)胞角蛋白總是與堿性細(xì)胞角蛋白配對。每種細(xì)胞角蛋白的表達(dá)與其所在組織器官的分化有密切的關(guān)系,細(xì)胞角蛋白的基因表達(dá)有很高的規(guī)律性,每種上皮組織至少表達(dá)一種I型及一種Π型細(xì)胞角蛋白,細(xì)胞分化的不同階段及不同類型上皮細(xì)胞表達(dá)不同的細(xì)胞角蛋白。CK8屬于堿性(Π類)細(xì)胞角蛋白,分子量為521^&。0(8定位于細(xì)胞質(zhì)中,由483個(gè)氨基酸組成,分為3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,SP頭部結(jié)構(gòu)域(N端)、桿狀結(jié)構(gòu)域和尾部結(jié)構(gòu)域(C端)。桿狀結(jié)構(gòu)域的起始端和末端氨基酸序列高度保守,這部分區(qū)域的點(diǎn)突變會(huì)導(dǎo)致異常的中間絲結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué),引起細(xì)胞完整性的喪失并導(dǎo)致嚴(yán)重的病征。頭和尾端包含多個(gè)生理上必需的翻譯后修飾位點(diǎn),這些位點(diǎn)與中間絲蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有關(guān)。正常情況下,CK8與相應(yīng)的酸性細(xì)胞角蛋白以1:1的比例形成異二聚體,主要表達(dá)于單層上皮細(xì)胞。CK8和CK18形成的異聚物中間絲具有獨(dú)特的黏彈性,在細(xì)胞變形和其它機(jī)械應(yīng)激時(shí),會(huì)表現(xiàn)出比微管和肌動(dòng)蛋白微絲更強(qiáng)的抵抗能力,維持細(xì)胞的機(jī)械完整性。作為細(xì)胞骨架的重要組成成分,除參與維持細(xì)胞的機(jī)械完整性外,CK8?CK18還可以調(diào)節(jié)蛋白激酶C介導(dǎo)的肝上皮細(xì)胞的黏附與迀移以及與網(wǎng)格蛋白共同調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、細(xì)胞大小、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)變。CK8主要表達(dá)于所有的單層上皮組織中,存在于某些正常上皮和腫瘤上皮,包括許多導(dǎo)管上皮和腺上皮:如結(jié)腸、胃、小腸、氣管的上皮和移行上皮,鱗狀上皮一般不表達(dá)CK8。因此CK8可作為腺上皮及其來源的腫瘤的首選標(biāo)記物。研究表明,CK8表達(dá)或翻譯后修飾異常將影響其活性,是相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。對CK8在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的深入研究,可以為腫瘤的預(yù)防及治療提供幫助。目前,國內(nèi)外已經(jīng)獲得了多種CK8的單克隆抗體,但一直以來都需要表達(dá)量更多,親和性更好,稀釋度更高,具有更多優(yōu)良特性的單克隆抗體。獲得活性高的CK8的單克隆抗體對于臨床診斷和科學(xué)研究具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的目的是提供一種高親和性的、可用于科研或臨床免疫組化檢測CK8表達(dá)的小鼠抗人CK8單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0004]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的,本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案:
(I )根據(jù)CK8的基因序列(ΝΜ_001256282.I)的編碼框,設(shè)計(jì)I對特異引物,Tr izo IReagent試劑提取人脂肪組織總RNA,將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴(kuò)增CK8基因,構(gòu)建重組表達(dá)載體PET28a- CK8,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài),IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并親和純化蛋白作為抗原。
[0005](2)采用經(jīng)典的細(xì)胞融合技術(shù)制備CK8單克隆抗體。親和層析純化抗體蛋白,SDS-PAGE測定抗體純度,直接ELISA法測定純化抗體的滴度。
[0006](3)采用免疫印跡法(Western blot)檢測CK8單抗的效價(jià)及特異性,通過免疫組織化學(xué)分析CK8單克隆抗體染色人乳腺癌和結(jié)腸腺癌石蠟切片。
[0007](4)根據(jù)抗體基因的恒定區(qū)序列合成特異性引物,PCR擴(kuò)增單克隆抗體CK8重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū),回收目的片段,克隆到PGEM-T載體中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細(xì)胞后篩選陽性克隆,抽提質(zhì)粒后測序確定了單克隆抗體CK8的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。
[0008]本發(fā)明提供的以原核表達(dá)的CK8蛋白為抗原、免疫小鼠獲得的分泌CK8單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,名稱為8G8,分類命名為小鼠抗人CK8雜交瘤細(xì)胞系,該細(xì)胞株8G8已于2012年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào),中國科學(xué)院微生物研究所),保藏編號(hào)為CGMCC N0.6920。
[0009]本發(fā)明還提供了所述雜交瘤細(xì)胞株8G8,CGMCC N0.6920產(chǎn)生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū),重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:9,輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO: 10。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
本發(fā)明應(yīng)用重組人的CK8蛋白為免疫抗原,免疫BalbA^jnt,采用經(jīng)典的細(xì)胞融合技術(shù),通過ELISA篩選,獲得一株能穩(wěn)定分泌抗CK8抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為8G8,亞型鑒定為IgGl,將雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后收集上清,采用Protein A親和層析法對CK8單抗進(jìn)行純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示,純化后抗體純度在95%以上;ELISA滴度測定結(jié)果顯示,單抗的滴度均在1:10000以上。乳腺癌和結(jié)腸腺癌石蠟切片經(jīng)抗CK8抗體免疫組化染色,可于光鏡下觀察到胞漿內(nèi)有呈均勻著色的黃到棕黃色細(xì)小顆粒,背景清晰,無非特異性著色。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上來看,本發(fā)明制備了高效價(jià),高特異性的CK8單克隆抗體,用該抗體檢測證實(shí),其對細(xì)胞中的CK8蛋白具有高識(shí)別能力,可用于科研或臨床免疫組化檢測CK8表達(dá)。
【附圖說明】
[0011]圖1SDS-PAGE分析純化后的抗CK8單克隆抗體。
[0012]圖2 ELISA法測定CK8單克隆抗體滴度。
[0013]圖3是免疫印跡法(Western blot)檢測CK8單抗的純度及特異性。
[0014]圖4是免疫組織化學(xué)檢測分析CK8單克隆抗體染色人乳腺癌石蠟切片。
[0015]圖5是免疫組織化學(xué)檢測分析CK8單克隆抗體染色人結(jié)腸腺癌石蠟切片。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常施方法。
[0017]實(shí)施例1:雜交瘤細(xì)胞株8G8及其產(chǎn)生的單克隆抗體的獲得 1、抗原制備 (I)獲得目的基因
在該實(shí)施例中,根據(jù)CK8的基因序列(ΝΜ_001256282.1)的編碼框,設(shè)計(jì)I對特異引物: 引物1:5’_ AATGGATCCATGAATGGGGTGAGCTG -3’ (SEQ ID NO:1)
引物2:5’_ TTTCTCGAGTCACTTGGGCAGGACGTC -3’;(SEQ ID NO: 2)
Trizol Reagent試劑提取人脂肪組織總RNA,將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴(kuò)增CK8基因。
[0018](2)構(gòu)建重組表達(dá)載體
將步驟(I)獲得的PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,在T4DNA連接酶作用下連接入表達(dá)載體PET28a,構(gòu)建重組質(zhì)粒PET28a-CK8。
[0019](3)獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種
將步驟(2)獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài),用含有硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選,挑取單斑,堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,雙酶切初步鑒定。測序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。
[0020](4)誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白純化
將步驟(2)提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài),用含有硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選,挑選單克隆至1ml含有硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),37°C,220rpm培養(yǎng)10h,取5ml液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至250ml的大瓶中繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)至OD值為0.8,加入0.2mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá),16°C誘導(dǎo)過夜,收集菌液超聲,取上清用N1-NTA瓊脂糖親和層析法純化CK8蛋白。
[0021]2、單抗的制備和純化 (I)、免疫動(dòng)物
一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠,按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行三次免疫注射。
[0022]首次免疫。純化的重組蛋白CK8(用適量生理鹽水稀釋)+完全弗氏佐劑,10yg/只,頸背部皮下多點(diǎn)注射;
二次免疫(間隔兩周)。純化的重組蛋白CK8(用適量生理鹽水稀釋)+不完全弗氏佐劑,10yg/只,頸背部皮下多點(diǎn)注射;
三次免疫(間隔兩周)。純化的重組蛋白CK8(用適量生理鹽水稀釋),不完全弗氏佐劑,10yg/只,頸背部皮下多點(diǎn)注射;
三次免疫后7?10天采血,用建立的ELISA法檢測效價(jià),選擇效價(jià)最高者用于細(xì)胞融合; 加強(qiáng)免疫(融合前3天),用純化的重組蛋白50yg腹腔注射。3天后,取脾臟融合。
[0023]⑵、細(xì)胞融合
采用眼球摘除放血法處死小鼠,無菌操作取出脾臟,在平皿內(nèi)擠壓研磨,制備脾細(xì)胞懸液。將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與小鼠脾細(xì)胞按一