?？刹《?型vp1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備、應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明?？刹《?型VP1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備、應(yīng)用涉及的 是篩選出含強抗原表位的埃可病毒6型的表面VP1蛋白片段，利用基因工程技術(shù)，制備?？?病毒6型的VP1蛋白抗原表位的融合蛋白。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合 成全新的VP1蛋白抗原表位融合蛋白的基因序列，利用基因工程技術(shù)表達融合蛋白，表達 的融合蛋白可用于埃可病毒疫苗及抗體檢測試劑的研制等，本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)、疫 苗和診斷試劑領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 人腸道致細胞病變孤兒病毒（EntericCytopathogenichumanOrphanVirus， ECHO)，簡稱?？刹《荆且活悊喂烧淩NA的腸道病毒，有34個血清型。最初對其致病性并 不清楚，后來證明?？刹《九c無菌腦膜炎、嬰兒腹瀉、手足口病等多種疾病有關(guān)。大量研究 和數(shù)據(jù)分析最終顯示，本病遍布世界各地，在人群中引起廣泛傳播或流行，其感染可引起無 菌性腦膜炎、發(fā)疹、胃腸道疾病、肝炎和肺炎等多種人類疾病，其中無菌性腦膜炎最為常見， 可通過呼吸道和消化道傳播。孕婦感染后可通過胎盤傳播給胎兒，可引起胎兒畸形甚至死 胎。?？刹《?型（E6)是一種具有強感染性的血清型，2006-2008年，在美國腸道病毒感染 中占10. 7%，居第二位，自2009年起，更是躍居為第一位，這種上升趨勢和嚴重程度使其受 到越來越多的關(guān)注。
[0003] 埃可病毒VP1與決定血清型的抗原決定因子密切相關(guān)，由于VP1區(qū)序列分型結(jié)果 與中和試驗鑒定結(jié)果具有一致性，而VP1蛋白是病毒中和的主要決定因子，其保守性有利 于疫苗開發(fā)，也使其作為檢測試劑提供可行性和可能性。目前對其全基因序列已經(jīng)測定，為 利用基因工程技術(shù)研究診斷試劑、疫苗及篩選抗病毒藥物奠定了基礎(chǔ)。
[0004]目前，對?？刹《镜臋z測方法主要包括平板分離培養(yǎng)法、酶聯(lián)免疫吸附試驗、分子 生物學(xué)方法。但是，這些方法所需成本較高、需要特定設(shè)備、耗時且需要對樣品進行復(fù)雜的 處理，限制其在生活中的廣泛應(yīng)用。建立一種簡單、快速、適合現(xiàn)場應(yīng)用的?？刹《镜臋z測 方法有重要意義。而研制特異的基因重組抗原是建立?？刹《咎禺惪贵w檢測試劑的發(fā)展方 向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是針對上述不足之處提供一種埃可病毒6型VP1蛋白特異性抗原表位 及其融合蛋白的制備、應(yīng)用，本發(fā)明是篩選出含強抗原表位的埃可病毒6型的表面VP1蛋白 片段，利用基因工程技術(shù)，制備?？刹《?型的表面VP1蛋白片段的融合蛋白。通過計算機 分析，從?？刹《?型表面蛋白VP1中篩選出4個含強抗原表位的蛋白片段，分別為第75 個氨基酸至第101個氨基酸，第127個氨基酸至第141個氨基酸，第204個氨基酸至第237 個氨基酸，第257個氨基酸至第289個氨基酸，選擇原核生物偏愛的密碼子，四段蛋白片段 之間通過兩個甘氨酸和一個絲氨酸連接，構(gòu)成總長度為117個氨基酸的序列，化學(xué)合成全 新的基因序列，利用基因工程技術(shù)在大腸桿菌BL21 (DE3)中表達該基因。表達的蛋白可用 于疫苗研制，亦可用于單克隆抗體和多克隆抗體的制備，為?？刹《緳z測方法的建立奠定 了基礎(chǔ)。
[0006] ?？刹《就鈱拥腣P1蛋白，是介導(dǎo)病毒和宿主細胞結(jié)合的主要蛋白，同時其又具 有較高的保守性，在各型的?？刹《局凶儺惡苄?，所以是用作抗原研制?？刹《究贵w檢測 試劑的理想蛋白。通過計算機分析?？刹《?型VP1蛋白的氨基酸序列，我們篩選出抗原 表位的富集區(qū)，選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子優(yōu)化基因序列，化學(xué)合成全新的基因 序列，利用基因工程技術(shù)表達融合蛋白，表達的融合蛋白具有較好的抗原性和特異性，可用 于單克隆抗體和多克隆抗體的制備，組裝膠體金試劑條，為?？刹《究焖贆z測方法的建立 奠定基礎(chǔ)。
[0007] ?？刹《?型VP1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備、應(yīng)用是采取以下步 驟實施的： 一種?？刹《?型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，由4段含強特異性抗原表位的VP1蛋白片段組成，4段蛋白片段之間由甘氨酸和絲氨酸連接，整合為全長117個氨基酸的融合 蛋白，氨基酸序列如下：
所述的?？刹《?型VP1蛋白抗原表位的融合蛋白，其中4段含強特異性抗原表位的VP1蛋白片段具體為第75個氨基酸至第101個氨基酸、第127個氨基酸至第141個氨基酸、 第204個氨基酸至第237個氨基酸、第257個氨基酸至第289個氨基酸，各段氨基酸序列如 下： Seqencel:第75個aa-第101個aa: TyrlieValGluTyrLysThrArgAspSerThrProAspLysMetTyr15 10 15 Thr〇
[0008] 所述的?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白中，4段含強特異性抗原表位的表面 VP1蛋白片段，這4段VP1蛋白片段的單個或任意組合的融合蛋白。
[0009] 所述的埃可病毒6型表面蛋白VP1的融合蛋白，通過基因重組技術(shù)，利用細菌、酵 母細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞及轉(zhuǎn)基因動植物進行重組表達、制備。
[0010] 所述的埃可病毒6型4個VP1蛋白片段的單個或任意組合的融合蛋白用于?？刹?毒抗體檢測試劑的制備及用于免疫制備抗埃可病毒單抗和多抗制備。
[0011] 埃可病毒6型VP1蛋白特異性抗原表位及其融合蛋白的制備方法如下： 1.?？刹《?型VP1蛋白抗原表位的篩選及其基因片段的化學(xué)合成： 利用ANTHEWIN、DNAStar等軟件，通過計算機分析埃可病毒6型VP1蛋白的全氨基酸序 列，篩選出4個含強抗原表位的蛋白片段，分別為第75個氨基酸至第101個氨基酸，第127 個氨基酸至第141個氨基酸，第204個氨基酸至第237個氨基酸，第257個氨基酸至第289 個氨基酸含有較強的抗原表位。4段蛋白片段之間通過兩個甘氨酸和一個絲氨酸連接，構(gòu) 成總長度為117個融合蛋白。選擇真核和原核生物均偏愛的密碼子，化學(xué)合成該融合蛋白 的全新基因序列。在合成的基因片段的5'端增加了 的酶切位點（下畫線部分)，在3' 端增加了終止密碼子TAA和及〇I酶切位點（下畫線部分)，使合成的基因片段易于克隆至 質(zhì)粒PGEX-4T-2內(nèi)的及mHI和肋〇I酶切位點內(nèi)。
[0012] 篩選的?？刹《?型VP1蛋白內(nèi)4個含強抗原表位的蛋白片段： Seqencel:第75個aa- 第101個aa: TyrlieValGluTyrLysThrArgAspSerThrProAspLysMetTyr15 10 15 AspSerTrpVallieAsnThrArgGinValAla20 25
化學(xué)合成的埃可病毒6型表面蛋白VP1抗原表位融合蛋白的DNA序列（366bp) GGATCCTATATCGTTGAATACAAAACCCGTGACTCTACGCCGGACAAAATGTACGAC TCATGGGTGATTAATACGCGCCAAGTTGCAGGTGGTTCAGTTCAGGATGACTCGACCCGT CAAAACACCGATACGCCGGCACTGGGTGGTAGCTCTCAGACCGGCGTCTATGGTTTTAAC ACGCTGAACAATATGGGCAAACTGTACTTCAAACATGTCAACGATAAAACCATCAGTCCG CGCACGTCCAAAGTGGGCGGTTCCGACTATACCCACAAAGATAACGTGGACTTTGAACCG CGTGGTGTTACCACGAGCCGCACCCAAATTACCATCACCAACAGCACCCACATGGAAACG mCTCGAG 2.表達?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建： 提取質(zhì)粒PGEX-4T-2,用及ZAoI雙酶切，電泳后回收酶切的質(zhì)粒大片段，溶 于去離子水內(nèi)；同時用及mHI和ΧΑοI雙酶切化學(xué)合成埃可病毒6型VP1抗原表位融合蛋 白的基因片段，電泳回收后，溶于去離子水內(nèi)。
[0013] 取等摩爾濃度的上述酶切后DNA片段，在同一離心管內(nèi)用Τ4DNA連接酶連接，使 化學(xué)合成?？刹《?型VP1蛋白基因片段插入到載體pGEX-4T-2內(nèi)的及μΗΙ#/7及〇I位點 之間，與載體上的起始密碼子翻譯框架一致，表達一個?？刹《?型VP1抗原表位融合蛋 白。
[0014] 3.重組質(zhì)粒的篩選與鑒定： 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，涂布含100μg/ml氨芐霉素的LB平板，置37°C過夜，次日隨機挑取轉(zhuǎn)化菌落和含PGEX-4T-2質(zhì)粒的對照菌，接種至含4mlLB培養(yǎng)基(含氨 芐霉素100μg/ml)的試管內(nèi)振搖，分別提取質(zhì)粒，用及減1廣及〇I雙酶切驗證，1. 0% 的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，切下約400bp的目的片段。同時，將含有外源基因的質(zhì)粒進行 DNA測序分析，測序結(jié)果證實重組質(zhì)粒含有埃可病毒6型表面蛋白VP1基因片段，序列完全 正確： TATATCGTTGAATACAAAACCCGTGACTCTACGCCGGACAAAATGTACGACTCATGG GTGATTAATACGCGCCAAGTTGCAGGTGGTTCAGTTCAGGATGACTCGACCCGTCAAAAC ACCGATACGCCGGCACTGGGTGGTAGCTCTCAGACCGGCGTCTATGGTTTTAACACGCTG AACAATATGGGCAAACTGTACTTCAAACATGTCAACGATAAAACCATCAGTCCGCGCACG TCCAAAGTGGGCGGTTCCGACTATACCCACAAAGATAACGTGGACTTTGAACCGCGTGGT GTTACCACGAGCCGCACCCAAATTACCATCACCAACAGCACCCACATGGAAACGTAA構(gòu)建的重組質(zhì)粒表達埃可病毒6型VP1抗原表位融合蛋白基因片段（117個氨基酸)， 在其N端融合了載體上的226個氨基酸，全長343個氨基酸，其氨基酸序列如下： TyrlieValGluTyrLysThrArgAspSerThrProAspLysMetTyrAspSerTrp VallieAsnThrArgGinValAlaGlyGlySerValGinAspAspSerThrArgGinAsn ThrAspThrProAlaLeuGlyGlySerSerGinThrGlyValTyrGlyPheAsnThrLeu AsnAsnMetGlyLysLeuTyrPheLysHisValAsnAspLy