專利名稱：miRNA-320在制備促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，是一種小RNA分子miRNA-320在制備促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡制劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小RNA (miRNA)是一種長(zhǎng)度大約為18 25個(gè)核苷酸的RNA小分子，自參與調(diào)控線蟲時(shí)序發(fā)育的miRNA分子lin-4與let_7被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，至2004年初已有700多個(gè)線蟲、果蠅、人、擬南芥等真核生物miRNA被報(bào)道。目前根據(jù)國(guó)際權(quán)威miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)，人體中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)695個(gè)miRNA分子(Sanger Institute, Release 12.0)。 miRNA的特點(diǎn)主要表現(xiàn)為它的保守性、基因簇集現(xiàn)象和特異性表達(dá)。 miRNA通過(guò)與耙mRNA的3' -UTR堿基不完全互補(bǔ)配對(duì)的方式來(lái)執(zhí)行對(duì)耙mRNA的翻譯抑制功能。有報(bào)道指出，Lin-4和let-7在線蟲發(fā)育中起著時(shí)序調(diào)控的作用。這兩個(gè)基因或它們的靶基因發(fā)生突變會(huì)造成線蟲發(fā)育的形態(tài)突變。近來(lái)，在篩選果蠅生長(zhǎng)缺陷突變株的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了 bantam基因座，該基因座編碼了果蠅幼蟲抑制程序性死亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖的miRNA。 Bantam miRNA的大量表達(dá)會(huì)抑制Hid mRNA的翻譯。Hid是程序性死亡的主要啟動(dòng)因子。另外有人報(bào)導(dǎo)，小鼠miRNA-375的表達(dá)會(huì)抑制葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌，但是并不改變葡萄糖代謝或細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)強(qiáng)度。通過(guò)RNA干擾技術(shù)將miRNA_375的靶分子Mtpn沉默，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的效應(yīng)與miRNA-375的作用效果一致。 同時(shí)，小RNA與癌癥之間的關(guān)系也是目前的研究熱點(diǎn)之一。有人通過(guò)使用Northern blot和芯片技術(shù)對(duì)基因組進(jìn)行大規(guī)模的篩查發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)與多種癌癥相關(guān)，并且這些miRNA可能起到抑制腫瘤或促進(jìn)腫瘤的作用。有研究發(fā)現(xiàn)肺癌病人的let-7表達(dá)顯著降低，導(dǎo)致這些病人更差的預(yù)后，非小細(xì)胞肺癌病人的let-7表達(dá)水平越低，其預(yù)后越差，術(shù)后生存期越短。體外組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，在人的肺癌細(xì)胞中瞬時(shí)的表達(dá)let-7可以抑制細(xì)胞的增殖，這也說(shuō)明let-7在肺組織中可能是一種具有抑癌作用的miRNA[TakamizawaJ， Konishi H， Yanagisawa K， Tomida S， 0sada H， Endoh H， Harano T， Yatabe Y， NaginoM， Nimura Y， Mitsudomi T， Takahashi T. Cancer Res. 2004 64(11) :3753—3756]。另夕卜，有報(bào)道m(xù)iRNA-21在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)增加。這個(gè)基因在腫瘤組織中表達(dá)量比正常組織高5-100倍。反義核酸的研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)miRNA通過(guò)抑制凋亡而并非影響細(xì)胞增殖控制細(xì)胞生長(zhǎng)，這預(yù)示著這個(gè)miRNA具有促癌功能[Chan， J. A. ， Krichevsky， A.M. ， and Kosik，K. S. MicroRNA—21 is an anti即optotic factor inhuman glioblastoma cells. CancerRes. 200565 :6029-6033]。由于miRNA_21不是一個(gè)大腦特異性的miRNA，它在乳腺癌樣品中表達(dá)也有增加，因此這個(gè)miRNA可能在腫瘤發(fā)生中起到廣泛的作用。
但至今未見(jiàn)關(guān)于miRNA-320應(yīng)用于制備促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡制劑的任何報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供mir-320促進(jìn)細(xì)胞凋亡的新用途。
3
本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，驗(yàn)證miRNA-320是否具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能。首先采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了 26例膽管癌樣本和9例正常膽管上皮細(xì)胞樣本中miRNA-320的表達(dá)豐度情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有26例膽管細(xì)胞癌樣本中miRNA-320的表達(dá)豐度值明顯低于9例正常膽管上皮細(xì)胞樣本。 在此工作的基礎(chǔ)上，本發(fā)明通過(guò)將miRNA-320轉(zhuǎn)入膽管癌細(xì)胞系(QBC-939和RBE)中，探討了過(guò)量表達(dá)miRNA-320對(duì)膽管癌細(xì)胞系(QBC-939和RBE)生物學(xué)特性的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-320在膽管癌細(xì)胞系QBC-939和RBE中的高表達(dá)能顯著促進(jìn)上述膽管癌細(xì)胞系發(fā)生凋亡。 為了探討過(guò)量表達(dá)miRNA-320促進(jìn)膽管癌細(xì)胞凋亡可能的分子機(jī)制，本發(fā)明結(jié)合國(guó)際上通用的3種miRNA靶基因預(yù)測(cè)分析軟件(Pictar， miRanda， Targetscan)對(duì)miRNA-320潛在的耙基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，從預(yù)測(cè)得到的潛在耙基因中篩選出了可能與miRNA-320促進(jìn)細(xì)胞凋亡功能相關(guān)的候選耙基因——髓細(xì)胞白血病基因-1 (Mcl-l)。之后本發(fā)明設(shè)計(jì)了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證Mcl-l是否是miRNA-320的靶基因。用表達(dá)miRNA-320的腺病毒感染QBC-939、RBE和HEK293細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)miRNA-320高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致上述細(xì)胞中Mcl-l蛋白水平顯著下降，說(shuō)明miRNA-320通過(guò)下調(diào)Mcl-1在上述細(xì)胞中的蛋白水平促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，為今后設(shè)計(jì)抑制Mcl-1表達(dá)的藥物提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。


圖l.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA-320在膽管癌樣本和正常膽管上皮細(xì)胞中的表達(dá)豐度圖。 圖2.高表達(dá)miRNA-320顯著促進(jìn)RBE細(xì)胞凋亡圖。
具體實(shí)施例方式
1.制備總RNA : 將正常肝上皮細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞樣本，每lOOmg樣本加入lml RNA抽提液TriZol，根據(jù)Invitrogen公司提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程抽提總的RNA，并測(cè)定相應(yīng)的總RNA的濃度。 2. miRNA-320表達(dá)豐度的測(cè)定 使用Applied Biosyste公司的小RNA檢測(cè)試劑盒(TaqMan MicroRNAAssay HumanPanel-Early Access Kit, P/N :4365409)，根據(jù)試劑盒操作手冊(cè)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)26例膽管細(xì)胞癌樣本和9例正常膽管上皮細(xì)胞樣本中miRNA-320的表達(dá)豐度值(Ct)，用miRNA-320的表達(dá)豐度值(Ct)減去18sRNA( —種作為內(nèi)參照的RNA)的表達(dá)豐度值得到標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)豐度值(ACt)，之后使用Excel電子表格軟件繪制如圖1所示的miRNA-320在膽管癌樣本和正常膽管上皮細(xì)胞中的表達(dá)豐度圖。
3.小RNA靶序列的預(yù)測(cè) 結(jié)合目前國(guó)際上通用的3種生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)軟件(miRanda、 PicTar、TargetScan)對(duì)miRNA-320的潛在耙基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，綜合三種軟件預(yù)測(cè)得到的多種潛在耙基因，以3種軟件均預(yù)測(cè)得到的共同的潛在靶基因作為候選基因，結(jié)合上述候選基因已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的功能從中進(jìn)一步篩選出與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因作為下一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)。本發(fā)明中篩選得到Mcl-l作為下一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的候選基因。
4. miRNA-320表達(dá)載體構(gòu)建 使用下述弓l物，上游5， -ggactagttggccgacaaaacccgggaccctgatcttg-3，，下游5' _cgcaagcttacaacctcacctgcaacgcgaccagccgcc_3';以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增得到長(zhǎng)度大約為331bp的片段，將片斷回收后用限制性內(nèi)切酶SpeI和Hindlll雙酶切片斷，分別以順向(forward)和反向(reverse)兩種方式將酶切片斷連接到pCDNA3. O(Invitrogen公司)載體中構(gòu)建出能表達(dá)具有生物學(xué)活性的miRNA-320真核表達(dá)質(zhì)粒miRNA-320 (forward)和不具有生物學(xué)活性的miRNA-320真核表達(dá)質(zhì)粒miRNA-320 (reverse)。另外將酶切片斷連接到pEZ-AV載體中構(gòu)建出能表達(dá)具有生物學(xué)活性的miRNA-320腺病毒包裝質(zhì)粒(Ad-miRNA_320)。
5.細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)用表達(dá)miRNA-320的腺病毒(Ad-miRNA_320)感染人膽管癌細(xì)胞系RBE，6小時(shí)后，加入濃度為25ng/ml的5-FU處理24小時(shí)后，使用Promega公司的TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，根據(jù)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程，制備樣品，于熒光顯微鏡下觀察。發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miRNA-320能顯著促進(jìn)細(xì)胞的凋亡(見(jiàn)圖2)
6.Mcl-l蛋白水平的檢測(cè) 使用Invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑PEI，根據(jù)試劑使用說(shuō)明書的流程，分別將表達(dá)miRNA-320的質(zhì)粒miRNA-320 (forward)和miRNA-320 (reverse)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入QBC939、 RBE、HEK293細(xì)胞中，48小時(shí)后收集樣品。變性樣品進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，通過(guò)電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Schleicherand Schcell公司)，5%脫脂奶粉封閉lh，TBST洗三次，每次5min ;5% BSA稀釋抗Mcl-l的一抗，孵育2h， TBST洗三次，每次5min ;5 %脫脂奶粉稀釋二抗，孵育lh， TBST洗三次，每次5-10min ;化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影檢測(cè)Mcl-l的蛋白水平。發(fā)現(xiàn)高表達(dá)具有生物學(xué)活性的miRNA-320真核表達(dá)質(zhì)粒miRNA-320 (forward)能顯著下調(diào)細(xì)胞中Mcl-l的蛋白水平，而高表達(dá)不具有生物學(xué)活性的miRNA-320真核表達(dá)質(zhì)粒miRNA-320 (reverse)不能下調(diào)細(xì)胞中Mcl-l的蛋白水平，進(jìn)一步證明miRNA-320能夠特異的下調(diào)Mcl-l的蛋白水平(見(jiàn)圖3)。
權(quán)利要求
miRNA-320在制備促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，是一種小RNA分子miRNA-320在制備促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡制劑中的應(yīng)用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)miRNA-320通過(guò)作用于靶基因髓細(xì)胞白血病基因-1(Mcl-1)，使該基因不能夠表達(dá)相應(yīng)的蛋白，從而抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，使腫瘤細(xì)胞凋亡。因此可將miRNA-320用于制備促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的制劑。
文檔編號(hào)A61K48/00GK101745120SQ20081020361
公開(kāi)日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2008年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月28日
發(fā)明者李亮, 楊文 , 王紅陽(yáng), 胡良, 陳磊 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)