Cik三維環(huán)境下的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種CIK三維環(huán)境下的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] CIK (cytokine-induced killer，中文名：[自體細胞免疫療法]多種細胞因子誘 導(dǎo)的殺傷細胞）是單個核細胞在抗CD3單克隆抗體和多種細胞因子的作用下培養(yǎng)獲得的一 群異質(zhì)細胞群，其中CD3+CD56+淋巴細胞是主要效應(yīng)細胞。CIK可直接殺傷腫瘤細胞和病毒 感染細胞；誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡；通過釋放大量炎性細胞因子抑制或殺傷腫瘤細胞。CIK具有 殺瘤活性高、殺瘤譜廣、對正常組織毒性低、體外可高度擴增等特點，在臨床細胞免疫療法 中是常用的細胞。
[0003] 然而，現(xiàn)有的CIK制備方法是在培養(yǎng)瓶等2D環(huán)境下聯(lián)合使用多種細胞因子誘導(dǎo)培 養(yǎng)，該培養(yǎng)方法存在細胞增殖效果不佳、細胞活性不足的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決現(xiàn)有CIK制備方法存在細胞增殖效果不佳、細胞活性不足的缺陷，本發(fā)明 提供一種顯著增加細胞的擴增倍數(shù)，細胞活性更強的CIK的制備方法。
[0005] 實現(xiàn)上述目的技術(shù)方案是，本發(fā)明提供的一種CIK三維環(huán)境下的制備方法，
[0006] 該方法包括如下步驟，
[0007] 取抑肽酶溶解纖維蛋白原，獲得溶液A ;
[0008] 配制含有凝血酶的溶液B;
[0009] 獲取單個核細胞，并將所述單個核細胞與溶液A和溶液B三者混合，獲得預(yù)誘導(dǎo)混 合物；
[0010] 再對所述預(yù)誘導(dǎo)混合物中的單個核細胞進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，生成CIK。
[0011] 在本發(fā)明提供的CIK三維環(huán)境下的制備方法中，所述單個核細胞的濃度為 1*102-106個/ml，所述抑肽酶的濃度為1000-3000KIU/ml ;所述溶液A中，纖維蛋白原的濃 度為1. 5~3. 5g/L ;所述溶液B中凝血酶的濃度為250-400U/ml。
[0012] 在本發(fā)明提供的CIK三維環(huán)境下的制備方法中，所述單個核細胞的濃度為1*104個/ml，所述抑肽酶的濃度為2000KIU/ml ;所述溶液A中，纖維蛋白原的濃度為2. Og/L ;所 述溶液B中凝血酶的濃度為300U/ml。
[0013] 在本發(fā)明提供的CIK三維環(huán)境下的制備方法中，所述單個核細胞的濃度為1*102個/ml，所述抑肽酶的濃度為1000KIU/ml ;所述溶液A中，纖維蛋白原的濃度為1. 5g/L ;所 述溶液B中凝血酶的濃度為250U/ml。
[0014] 在本發(fā)明提供的CIK三維環(huán)境下的制備方法中，所述單個核細胞的濃度為1*106個/ml，所述抑肽酶的濃度為3000KIU/ml ;所述溶液A中，纖維蛋白原的濃度為3. 5g/L ;所 述溶液B中凝血酶的濃度為400U/ml。
[0015] 在本發(fā)明提供的CIK三維環(huán)境下的制備方法中，所述溶液B由凝血酶和可溶性鈣 鹽溶液共同配制而成。
[0016] 在本發(fā)明提供的CIK三維環(huán)境下的制備方法中，所述可溶性鈣鹽為CaCl2，且CaCl 2溶液的濃度為30-50mmol/L。
[0017] 在本發(fā)明提供的CIK三維環(huán)境下的制備方法中，單個核細胞與溶液A和溶液B混 合后置于10-40 °C至凝固。
[0018] 在本發(fā)明提供的CIK三維環(huán)境下的制備方法中，所述預(yù)誘導(dǎo)混合物中的單個核細 胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)過程為：
[0019] 將預(yù)誘導(dǎo)混合物置于含有抗⑶3單克隆抗體和RetroNectin預(yù)包被的培養(yǎng)器皿 中，并加入含PPP和IFN- γ的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；
[0020] 再添加生長因子IL-1 α和IL-2繼續(xù)培養(yǎng)至單個核細胞轉(zhuǎn)化成CIK。
[0021] 在本發(fā)明提供的CIK三維環(huán)境下的制備方法中，所述抗CD3單克隆抗體的濃度為 10_150ng/ml，RetroNectin 的濃度為 10_50g/ml〇
[0022] 在本發(fā)明提供的CIK三維環(huán)境下的制備方法中，所述培養(yǎng)基中PPP的體積分數(shù)為 0· 5-2%，IFN-γ 的濃度為 500-1500IU/ml。
[0023] 在本發(fā)明提供的CIK三維環(huán)境下的制備方法中，所述IL-la在培養(yǎng)基中的濃度為 50-150IU/ml，IL-2 在培養(yǎng)基中的濃度為 100-500IU/ml。
[0024] 本發(fā)明的有益效果是：將所述單個核細胞與溶液A和溶液B三者混合，得到一個纖 維蛋白凝膠狀態(tài)環(huán)境，纖維蛋白凝膠能夠模擬體內(nèi)細胞的三維生長環(huán)境，為單個核細胞提 供充足的生長空間和支持細胞間聯(lián)系的空間結(jié)構(gòu)，從而更有利于單個核細胞轉(zhuǎn)化為CIK并 能夠促進CIK的生長，可顯著增加 CIK的擴增倍數(shù)，獲得的細胞活性也更強。
【附圖說明】
[0025] 下面將結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明，附圖中：
[0026] 圖1為通過本發(fā)明提供的CIK制備方法實施例1所獲得細胞分布圖；
[0027] 圖2為通過現(xiàn)有的CIK制備方法所獲得的細胞分布圖。
【具體實施方式】
[0028] 為解決現(xiàn)有CIK制備方法存在細胞增殖效果不佳、細胞活性不足的現(xiàn)象，本發(fā)明 在制備纖維蛋白凝膠的過程中加入單個核細胞，將單個核細胞裹覆于纖維蛋白凝膠中，再 進行誘導(dǎo)成CIK，而纖維蛋白凝膠特殊的立體結(jié)構(gòu)，可以更好地模擬體內(nèi)細胞的生長微環(huán) 境，從而為細胞提供充足的生長空間和支持細胞間聯(lián)系的空間結(jié)構(gòu)，經(jīng)該方法制備CIK，可 顯著增加 CIK的擴增倍數(shù)，獲得的細胞活性更強。
[0029] 具體地，本發(fā)明提供的CIK三維環(huán)境下的制備方法，包括如下步驟：
[0030] 1、取抑肽酶溶解凍干纖維蛋白原，獲得溶液A ;
[0031] 2、將凝血酶加入可溶性鈣鹽溶液中，獲得溶液B ;
[0032] 3、獲取單個核細胞，并將單個核細胞與溶液A和溶液B三者混合置于10_40°C至凝 固狀，獲得預(yù)誘導(dǎo)混合物；
[0033] 4、再對預(yù)誘導(dǎo)混合物中的單個核細胞進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，生成CIK。
[0034] 其中，凝血酶能夠酶切纖維蛋白原，釋放出纖維蛋白A肽及B肽，使之形成了纖維 蛋白單體，纖維蛋白單體可由氫鍵及靜電引力作用聚合成不穩(wěn)定的可溶性纖維蛋白纖維； 凝血酶同時還能夠激活因子，在鈣離子存在下參與纖維蛋白多肽的交聯(lián)，使纖維蛋白纖維 和多肽形成堅固不易降解的凝塊，使之結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，即形成纖維蛋白凝膠；而抑肽酶又能 夠防止纖維蛋白凝膠中的蛋白酶解，使得附著在纖維蛋白凝膠上的細胞不易脫落。
[0035] 而本發(fā)明將上述溶液A和溶液B混合的同時加入單個核細胞，即在纖維蛋白凝膠 的形成的同時，將單個核細胞均勻裹覆于纖維蛋白凝膠中，而由于纖維蛋白凝膠呈立體狀 的固化物，且具有良好的生物相容性，是一種高分子網(wǎng)絡(luò)體系，具有三維的孔隙結(jié)構(gòu)，這些 孔隙不僅使細胞能自由的迀移、增殖，還為細胞所需營養(yǎng)的滲透提供了基礎(chǔ)；細胞在纖維蛋 白凝膠內(nèi)均勻分布，不易被體液沖走、降解，并能有效地黏附多種生長因子，利于細胞的再 生；除此之外，由于未凝固的纖維蛋白凝膠有流動改變形態(tài)的趨勢，不利于細胞均勻的接觸 到氧氣和細胞因子，同時流動的纖維蛋白凝膠對細胞會產(chǎn)生剪切力，造成細胞的損傷；因 此，本發(fā)明在將單個核細胞與溶液A和溶液B混合后置于10-40°C下使纖維蛋白凝膠完全凝 固；利用纖維蛋白凝膠的立體結(jié)構(gòu)模擬體內(nèi)細胞的生長微環(huán)境，從而增大了單個核細胞與 細胞生長因子和氧氣的接觸面積，為單個核細胞提供充足的生長空間和支持細胞間聯(lián)系的 空間結(jié)構(gòu)，提高單個核細胞的轉(zhuǎn)化率，從而提高CIK的數(shù)量，增強CIK的活性。因此，本發(fā)明 采用的纖維蛋白凝膠能夠為單個核細胞提供一個適宜生長轉(zhuǎn)化的立體環(huán)境。
[0036] 進一步地，步驟1中抑肽酶的濃度為1000-3000KIU/ml，取1ml抑肽酶溶解凍干纖 維蛋白原，并使纖維蛋白原在溶液A中的終濃度為1. 5~3. 5g/L即可；
[0037] 步驟2中凝血酶的濃度為100_500U/ml ;優(yōu)選地，可溶性鈣鹽溶液為CaCl2溶液，其 濃度為30-50mmol/L ;溶液B中，凝血酶的濃度為250-400U/ml ;
[0038] 需要特別注意的是，溶液A和溶液B的制備過程必須要使用不同的器皿，以防止共 用同一器皿，提前形成纖維蛋白凝膠，影響單個核細胞的附著。
[0039] 步驟3中，本發(fā)明優(yōu)先采用從血液中分離獲取單個核細胞，具體過程為：
[0040] A.取100ml抗凝處理后的血液，將血液分別加入到4個50ml的無菌離心管中， 300g離心10min，將所有的上層血漿轉(zhuǎn)移到2個新的無菌離心管中，56°C水浴滅活30min，再 于400g離心10min后，收集上層黃色液體即低血小板血衆(zhòng)（Poor Platelet Plasma，PPP)， 4 °C儲存?zhèn)溆茫?br>[0041] B.向該4個下層含血細胞的離心管中加入注射用生理鹽水，直到每管30ml混合 液，用移液器混勻，再取4支含15ml淋巴細胞分離液的50ml離心管，緩慢的將血細胞混合 液用移液器轉(zhuǎn)移到淋巴細胞分離液的上層，400g離心20min ;
[0042] C.吸取中間白膜層至新的50ml離心管中，用生理鹽水補液到45ml后，離心洗滌單 個核細胞2次，獲取單個核細胞液，優(yōu)選地，單個核細胞的濃度為1*102-106個/ml。
[0043] 步驟4中，對預(yù)誘導(dǎo)混合物中的單個核細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)過程為：
[0044] 1)將帶有單個核細胞的預(yù)誘導(dǎo)混合物置于⑶3McAb(抗⑶3單克隆抗體）和 RetroNectin(重組人纖維蛋白片段）預(yù)包被的培養(yǎng)器皿中，并加入含PPP和IFN-γ (γ干 擾素）的培養(yǎng)基；
[0045] 2)第2天，添加 Ε-1 α (白介素 1 α )和幾 -2培養(yǎng)，即可收獲CIK ;
[0046] 步驟1)中，采用濃度為10_150ng/ml的CD3McAb和濃度為10-50g/ml的 RetroNectin預(yù)包被培養(yǎng)器皿，具體預(yù)包被過程為現(xiàn)有技術(shù)，在此不再贅述。優(yōu)選地，培養(yǎng) 基為GTT551培養(yǎng)基，且GTT551培養(yǎng)基中PPP的體積分數(shù)為1 %，IFN- γ的濃度為1000IU/ ml。CD3McAb和RetroNectin均可刺激單個核細胞生長，與PPP和IFN- γ細胞生長因子配 合可促進單個核細胞轉(zhuǎn)化為CIK。
[0047] 步驟2)中，添加細胞生長因子IL-1 α和IL-2,并使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別 為：50-150IU/ml、100-500IU/ml。IL-la 與 IFN-γ 和 CD3McAb 合用時，可以明顯提高 CIK 的 細胞毒活性；而IL-2用于促進CIK的增殖。
[0048] 進一步地，在步驟2)之后，還可以繼續(xù)對CIK進行培養(yǎng)增殖，以達到臨床回輸治療 病人的需求，具體步驟為：
[0049] 3)第3天，補充步驟1)中的培養(yǎng)基，同時添加 IL-2,維持IL-2在培養(yǎng)基中濃度不 變，對CIK進行擴增；
[0050] 4)每隔2-3天重復(fù)步驟3);
[0051] 5)第14-21天，收獲增殖后的CIK。
[0052] 可以理解的是，以上對帶有單個核細胞的預(yù)誘導(dǎo)混合物的培養(yǎng)方法，僅為本發(fā)明 提供的其中一種培養(yǎng)方法，現(xiàn)有技術(shù)中，CIK的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法均可適用于本發(fā)明。
[0053] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不 用于限定本發(fā)明。
[0054] 實施例1
[0055] 本發(fā)明提供的一種CIK三維環(huán)境下的制備方法，包括以下步驟：
[0056] (1)配制2000KIU/m