復(fù)蘇可培養(yǎng)化的vbnc節(jié)桿菌odslc13菌株及其復(fù)蘇方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC節(jié)桿菌ODSLC13菌株及其復(fù)蘇方法和應(yīng)用。所述復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC節(jié)桿菌ODSLC13(Arthrobacter?sp.ODSC13)菌株，該菌株的保藏編號為CCTCC?No：M2014074，保藏單位為：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為：中國武漢大學(xué)，保藏日期為：2014年03月05日。本發(fā)明的有益效果是：可使Giltay培養(yǎng)基反應(yīng)液開始由綠色轉(zhuǎn)為深藍(lán)色并見產(chǎn)氣現(xiàn)象，說明該菌種能利用硝酸鹽還原形成堿性物質(zhì)，并產(chǎn)氣使指示劑顏色變化。同時(shí)測得硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化率為63.7％，總氮減少率為57.9％，未檢測到氨態(tài)氮與亞硝態(tài)氮的殘存，具有明顯的反硝化脫氮效果。
【專利說明】復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC節(jié)桿菌0DSLC13菌株及其復(fù)蘇方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種菌株及其復(fù)蘇方法和應(yīng)用，更具體說，它涉及一種復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC節(jié)桿菌0DSLC13菌株及其復(fù)蘇方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]含氨氮污水的生物處理是當(dāng)今農(nóng)業(yè)、環(huán)保行業(yè)極為重要的一項(xiàng)技術(shù)措施，其中氨態(tài)氮的氧化，亞硝態(tài)氮的氧化，硝態(tài)氮的還原以及脫氮等關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)中需要有多種微生物的參與，降解轉(zhuǎn)化無機(jī)與有機(jī)態(tài)氮素。一般傳統(tǒng)可分離的單一功能的亞硝化細(xì)菌如Nitrosomonas、Nitrosococcus 屬中的菌種，硝化菌如 Nitrobacter、Nitrococcus 屬的菌種，反硝化脫氮菌如Micrococcus denitrificans等為自養(yǎng)細(xì)菌,硝化反硝化作用所需時(shí)間長、效率低。篩選具備硝化反硝化功能的異養(yǎng)硝化細(xì)菌菌種與量化功能是目前研究的熱門。
[0003]自然界生態(tài)環(huán)境中的細(xì)菌能夠經(jīng)傳統(tǒng)分離法獲取的僅有0.01-4%，絕大部分處于活的非可培養(yǎng)(VBNC)、類似于休眠狀態(tài)。就環(huán)境微生物資源而言，獲取自然界中90-99.99%的資源菌種包括上述氨氮污水處理環(huán)節(jié)中的自養(yǎng)與異養(yǎng)硝化菌群需要有新思路新方法的創(chuàng)新，才能挖掘、開發(fā)、利用這些未知的微生物資源。
[0004]VBNC狀態(tài)細(xì)菌的分離 與篩選可以利用一些特殊信號分子復(fù)蘇促進(jìn)其處于休眠狀態(tài)細(xì)菌的可培養(yǎng)化。(丁林賢，蘇曉梅，橫田明.活的但非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)菌的研究進(jìn)展及應(yīng)用展望.《微生物學(xué)報(bào)》.2011, 51 (7):858-862.)闡述了 VBNC狀態(tài)菌的形成機(jī)理、轉(zhuǎn)變與種類、復(fù)蘇、研究意義及其應(yīng)用展望。并報(bào)道了丁林賢等在十余年間針對生態(tài)環(huán)境中處于VBNC狀態(tài)菌的復(fù)蘇、可培養(yǎng)化、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及潛在功能等方面的一些研究成果，擬為微生物資源的開發(fā)與應(yīng)用提供新的科學(xué)依據(jù)。并公開了復(fù)活促進(jìn)因子(Rpf，reSUSCitationpromotingfactor)是由藤黃球菌(M.1uteus)分泌的一種能使處于VBNC狀態(tài)的該菌重新恢復(fù)其生長繁殖能力的蛋白質(zhì)，分子量約為16-17kDa。Mukamolova報(bào)道了 Rpf可以復(fù)蘇處于VBNC時(shí)期的革蘭氏陽性菌Mycobacterium屬的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、
[0005]牛分枝桿菌(M.bovis)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii),恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)和鳥分枝桿菌(M.avium)等。并且同Rpf相似的基因也在鏈霉菌、結(jié)核菌、棒狀桿菌等高GC的革蘭氏陽性菌中被發(fā)現(xiàn)。另外，Mukamolova等人還報(bào)道了 Rpf采用自分泌或旁分泌的方式分泌信號，不但能使休眠的微生物復(fù)活，還可以刺激正常菌的生長，并能調(diào)控細(xì)胞的繁殖過程。
[0006]目前國內(nèi)對于在污水處理系統(tǒng)中分離VBNC狀態(tài)硝化菌群的技術(shù)以及復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC狀態(tài)的硝化細(xì)菌尚未見有公開報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]根據(jù)VBNC微生物資源的挖掘利用以及針對氨氮污水生物處理亟需高效率硝化反硝化細(xì)菌資源的社會(huì)需求，本發(fā)明目的之一是提供一種復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC節(jié)桿菌0DSLC13菌株，本發(fā)明目的之二是提供上述的節(jié)桿菌0DSLC13菌株的活化培養(yǎng)基，本發(fā)明目的之三是提供上述的VBNC節(jié)桿菌0DSLC13菌株應(yīng)用于含硝酸鹽基質(zhì)的反硝化脫氮。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
[0009]復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC節(jié)桿菌0DSLC13 (Arthrobacter sp.0DSLC13)菌株，該菌株的保藏編號為CCTCC NO:M2014074，保藏單位為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為:中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期為:2014年03月05日。分類命名為:節(jié)桿菌0DSLC13 Arthrobactersp.0DSLCl3ο上述的菌株以污水生物處理系統(tǒng)中的VBNC狀態(tài)菌群作為分離源，利用復(fù)蘇可培養(yǎng)化技術(shù)取得的VBNC資源細(xì)菌。該菌株在活化培養(yǎng)基上(本專利活化培養(yǎng)基配方)，30°C培養(yǎng)2d，菌落直徑2-3_，淺灰色或淡黃色，有光澤；細(xì)胞無鞭毛、不運(yùn)動(dòng)；革蘭氏陽性細(xì)菌，屬于放線菌。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
[0011]一種用于上述的節(jié)桿菌0DSLC13菌株的活 化培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)有以下的組分構(gòu)成:
[0012]營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基1.0~3.0g;酵母膏0.2~0.5g;
[0013]葡萄糖1.5 ~5.0g ; NaCI 0.5 ~5.0g ;
[0014]瓊脂1.0 ~4.0%;
[0015]含復(fù)活促進(jìn)因子Rpf的復(fù)蘇培養(yǎng)液0.1~20%，去離子水1000ml ；
[0016]上述的百分比為占培養(yǎng)基總量的體積百分比。
[0017]作為優(yōu)選，上述的含復(fù)活促進(jìn)因子Rpf的復(fù)蘇培養(yǎng)液由培養(yǎng)基基液、細(xì)菌液和土壤液構(gòu)成；所述的細(xì)菌液由藤黃微球菌菌種在菌種液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對數(shù)期后期，經(jīng)離心去除菌種液體培養(yǎng)基提取獲得蛋白質(zhì)，含有復(fù)活促進(jìn)因子Rpf，細(xì)菌液按體積比為培養(yǎng)基基液的1-10% ;所述的土壤液由經(jīng)風(fēng)干、過篩、去除雜質(zhì)的園土，加自來水，多次滅菌，過濾取濾液或離心取上清液，土壤液按體積比為培養(yǎng)基基液的1-5%。
[0018]上述的節(jié)桿菌0DSLC13菌株的活化培養(yǎng)基配制方法，該方法包括以下的步驟:稱取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基1.0~3.0g,酵母膏0.2~0.5g，葡萄糖1.5~5.0g, NaCI 0.5~5.0g,去離子水1000ml,pH調(diào)至7.0,加1.0~4.0%瓊脂，經(jīng)110~130°C> 10~30min高壓滅菌后冷卻至室溫；另在無菌條件下加入0.1~20% (v/v)經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾滅菌、pH7.0的復(fù)蘇培養(yǎng)液，攪拌混勻，分注干固，倒置4-10°C保藏待用。
[0019]作為優(yōu)選，上述的復(fù)蘇培養(yǎng)液的制備方法如下:
[0020]I)取少量藤黃球菌菌種接種于菌種液體培養(yǎng)基，25~35°C、100~150rpm振動(dòng)培養(yǎng)；細(xì)菌生長至對數(shù)期后期，培養(yǎng)液用3000~8000rpm，10~30min離心抽提去除菌體；經(jīng)
0.20~0.25 μ m膜過濾滅菌后，-30~_10°C保存?zhèn)溆茫?br> [0021]2)取經(jīng)風(fēng)干、過篩、去除雜質(zhì)的園土 1kg，加自來水I~2L，110~130°C、10~40min高壓滅菌鍋滅菌；室溫待一晚后，再度用同法滅菌；1500~2500r/min低速離心取上清液或用濾紙過濾棄渣獲得濾液，經(jīng)110~130°C、10~30min高壓滅菌鍋滅菌后冷卻，-30~-10°C保存?zhèn)溆茫?br> [0022]3)準(zhǔn)確稱取培養(yǎng)基基液的各組分，pH調(diào)至7.0，110~130°C、10~30min高壓滅菌鍋滅菌后冷卻至室溫待用；培養(yǎng)基基液適宜多數(shù)細(xì)菌的分離，對于有特殊要求以及有選擇性的細(xì)菌可以相應(yīng)加減營養(yǎng)組分；[0023]4)使用前，在無菌條件下，培養(yǎng)基基液中加1-10%細(xì)菌液，再加1-5%土壤液，混勻后使用。
[0024]為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案:
[0025]上述的復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC節(jié)桿菌0DSLC13菌株應(yīng)用于含硝酸鹽基質(zhì)的反硝化脫氮。具體的方法是:將所述的復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC節(jié)桿菌0DSLC13菌株經(jīng)活化培養(yǎng)、前培養(yǎng)后加入污水生物處理系統(tǒng)中。
[0026]作為優(yōu)選，所述的活化培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)由以下的組分構(gòu)成:
[0027]營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基1.0~3.0g;酵母膏0.2~0.5g;
[0028]葡萄糖1.5 ~5.0g ; NaCI 0.5 ~5.0g ;
[0029]瓊脂1.0 ~4.0%;
[0030]含復(fù)活促進(jìn)因子Rpf的復(fù)蘇培養(yǎng)液1.0%，去離子水1000ml ；
[0031]上述的百分比為 占培養(yǎng)基總量的體積百分比。
[0032]作為優(yōu)選，所述的前培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)由以下的組分構(gòu)成:
[0033]蛋白胨3.0~8.0g，酵母膏0.2~0.8g，
[0034]葡萄糖3.0 ~8.0g, NaCll.5 ~5.5g,
[0035]1000ml 去離子水，pH 調(diào)至 7.0。
[0036]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明由于采用了以上的技術(shù)方案，獲得的可培養(yǎng)化VBNC節(jié)桿菌0DSLC13菌株，可使Giltay培養(yǎng)基反應(yīng)液開始由綠色轉(zhuǎn)為深藍(lán)色并見產(chǎn)氣現(xiàn)象，說明該菌種能利用硝酸鹽還原形成堿性物質(zhì)，并產(chǎn)氣使指示劑顏色變化。同時(shí)測得硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化率為63.7%，總氮減少率為57.9%，未檢測到氨態(tài)氮與亞硝態(tài)氮的殘存，具有明顯的反硝化脫氮效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為本發(fā)明節(jié)桿菌0DSLC13菌株的反硝化脫氮效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述。雖然本發(fā)明將結(jié)合較佳實(shí)施例進(jìn)行描述，但應(yīng)知道，并不表示本發(fā)明限制在所述實(shí)施例中。相反，本發(fā)明將涵蓋可包含在有附后權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)的替換物、改進(jìn)型和等同物。
[0039]本發(fā)明實(shí)施例所述的培養(yǎng)基制備方法如下:
[0040]1、NYGR 培養(yǎng)基:稱取 Nutrient broth 1.6g, Yeast extract 0.5g, Glucose 2.5 g,去離子水1000ml，pH調(diào)至7.0，加2%瓊脂，經(jīng)121°C、15min高壓滅菌后冷卻至室溫；另在無菌條件下加入10% (v/v)經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾滅菌、pH7.0的復(fù)蘇培養(yǎng)液，攪拌混勻，分注干固；
[0041]2、PYGN 培養(yǎng)基:Peptone5.0g, Yeast extract。.5g, Glucose5.0g, NaC12.5g,1000ml去離子水，pH調(diào)至7.0 ；
[0042]3、Giltay 培養(yǎng)基:A 液:KN03 1.0g,天冬酰胺 1.0g, I % BTB 酒精溶液 5.0mL,蒸餾水 500mL ;B 液:檸檬酸鈉 8.5g, MgS04.7H201.0g, FeC13.6H200.05g, KH2P04 1.0g,CaCl2.2H200.2g，蒸餾水500mL。混合A、B兩溶液，調(diào)節(jié)pH值O~2，經(jīng)滅菌備用。[0043]4、復(fù)蘇培養(yǎng)液培養(yǎng)基組成由A、B、與C成分構(gòu)成(簡稱:ABC復(fù)蘇培養(yǎng)基)。
[0044]A 成分:
[0045]細(xì)菌液:藤黃球菌菌種在LMMD培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對數(shù)期后期，經(jīng)離心培養(yǎng)基提取獲得蛋白質(zhì)，含有復(fù)活促進(jìn)因子Rpf，用量為C成分體積的0.5%。
[0046]B 成分:
[0047]土壤液:取經(jīng)風(fēng)干、過篩、去除石塊草根等雜質(zhì)的園土 1kg，加自來水1L，121°C、30min高壓滅菌鍋滅菌；室溫待一晚后，再度滅菌、重復(fù)三次；2000r/min低速離心取上清液(或用濾紙過濾獲得濾液)，用量為C成分體積的2%。
[0048]C 成分:
[0049]細(xì)菌用胰蛋白胨(Difco公司)(Bactopeptone(Difco))10.0g,
[0050]酵母抽提液(Yeastextract (Difco)) 5.0g,
[0051]麥芽提取物(Maltextract (Difco)) 5.0g,
[0052](水解)酪蛋白氨基酸(Casaminoacids (Difco)) 5.0g,
[0053]牛肉膏(Beefextract (Difco)) 2.0g,
[0054]甘油(Glycerol) 2.0g,
[0055]吐溫80 (Tween80) 0.05g,
[0056]七水硫酸鎂(MgS04.7H20) 1.0g,
[0057]加去離子水1000mL, ρΗ7.0。
[0058]以上培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基成分，如配制固體培養(yǎng)基時(shí)，需加瓊脂15_20g，經(jīng)121°C，15min高壓滅菌后冷卻使用。
[0059]A成分中LMMD培養(yǎng)基組成:
[0060]氯化銨(NH4C1)4.0g，
[0061]磷酸二氫鉀(KH2P04)1.4g，
[0062]生物素(Biotin)0.005g，
[0063]L-蛋氨酸(L-Methionine) 0.02g,
[0064]硫胺素(Thiamine)0.04g,
[0065]肌苷(Inosine)1.0g,
[0066]七水硫酸鎂(MgS04.7H20) 0.07g，
[0067]礦物質(zhì)溶液(Mineralsolution) 1.0ml,
[0068]L-乳酸鋰(Lithium L-lactate) 10.0g,
[0069]蒸懼水(Distilledwater) 1000ml, pH7.5。
[0070]其中，上述的礦物質(zhì)溶液(Mineral solution):
[0071]硫酸銅(CuS04)0.24g，
[0072]氯化錳(MnC12)0.50g，
[0073]硫酸亞鐵(FeS04)0.1Og,
[0074]鑰酸鈉(Na2Mo04)0.025g，
[0075]硫酸鋅(ZnS04)0.05g，
[0076]蒸懼水(distilledwater) 1000ml。
[0077]以上為一般細(xì)菌復(fù)蘇培養(yǎng)使用的配方。根據(jù)不同生態(tài)環(huán)境的要求，C成分可以作相應(yīng)的調(diào)整。
[0078]復(fù)蘇培養(yǎng)基的配制方法:
[0079]1.取少量藤黃球菌菌種接種于LMMD液體培養(yǎng)基，30°C、120rpm振動(dòng)培養(yǎng)；細(xì)菌生長至對數(shù)期后期，培養(yǎng)液用5000rpm，20min離心抽提去除菌體；經(jīng)0.22 μ m膜過濾滅菌后，_20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0080]2.取經(jīng)風(fēng)干、過篩、去除石塊草根等雜質(zhì)的園土 lkg，加自來水lL，121°C、30min高壓滅菌鍋滅菌；室溫待一晚后，再度用同法滅菌；2000r/min低速離心取上清液(或用濾紙過濾棄渣獲得濾液)，經(jīng)121°C、15min高壓滅菌鍋滅菌后冷卻，_20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0081]3.準(zhǔn)確稱取C成分的各組分，pH調(diào)至7.0，121 °C、15min高壓滅菌鍋滅菌后冷卻至室溫待用。C組分適宜多數(shù)細(xì)菌的分離，對于有特殊要求以及有選擇性的細(xì)菌可以相應(yīng)加減營養(yǎng)組分；
[0082]4.使用前，應(yīng)在無菌條件下，C成分中加5% (A/C)A成分，再加3% (B/C)B成分，混勻后使用。
[0083]實(shí)施例1
[0084]從污水生物處理系統(tǒng)中，利用復(fù)蘇可培養(yǎng)化技術(shù)篩選獲得VBNC節(jié)桿菌0DSLC13菌株保藏菌種，可培養(yǎng)化VBNC節(jié)桿菌0DSLC13菌株分離自某污水生物處理系統(tǒng)，系統(tǒng)中存在有90%以上一般傳統(tǒng)分離方法難以獲得、處于活的非可培養(yǎng)(VBNC)類似于休眠狀態(tài)的細(xì)菌，經(jīng)利用復(fù)蘇可培 養(yǎng)化技術(shù)篩選獲得處于VBNC狀態(tài)的節(jié)桿菌0DSLC13菌株。該菌株的保藏編號為CCTCC No:M2014074，保藏單位為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為:中國武漢武漢大學(xué)，保藏日期為:2014年03月05日。分類命名為:節(jié)桿菌0DSLC13Arthrobactersp.0DSC13,該菌株一般需保存于超低溫冷凍(零下80度)。經(jīng)超低溫冷凍保藏的0DSLC13菌株須經(jīng)NYGR固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，即接種在NYGR固體培養(yǎng)基上30°C倒置活化培養(yǎng)2_4d后，可臨時(shí)保存于4°C冰箱備用。
[0085]ODSLC13菌株在NYGR固體培養(yǎng)基上，30°C倒置活化培養(yǎng)2_7d后，可見直徑2_4mm，淺灰色或淡黃色，有光澤菌落。
[0086]0DSLC13菌株經(jīng)染色為革蘭氏陽性細(xì)菌，光學(xué)顯微鏡下可見細(xì)胞無鞭毛、不運(yùn)動(dòng)、無孢子形成、無熒光色素、形態(tài)為短桿至球形的細(xì)胞。
[0087]在Nutrient Broth培養(yǎng)基上的生長溫度為5_40°C，最適溫度30°C;耐鹽范圍3-7%(w/v) ;pH 范圍 6-11,最適 ρΗ7.5。
[0088]實(shí)施例2
[0089]可培養(yǎng)化VBNC節(jié)桿菌0DSLC13菌株對硝酸鹽基質(zhì)的反硝化脫氮效果的培養(yǎng)鑒定方法，包括以下的步驟:
[0090]①取可培養(yǎng)化VBNC節(jié)桿菌0DSLC13菌株保藏菌種，在無菌條件下，挑取少量菌種轉(zhuǎn)接到NYGR培養(yǎng)基上，30°C活化培養(yǎng)2-4d ；
[0091]②挑取少量經(jīng)活化培養(yǎng)的菌種①接種到PYGN液體培養(yǎng)基中進(jìn)行30°C、2d前培養(yǎng);
[0092]③在Giltay培養(yǎng)基中分別接入2 %的前培養(yǎng)菌液，30°C、每分鐘120轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)2d后，觀察培養(yǎng)基產(chǎn)氣與顏色變化情況以及測定培養(yǎng)液中氨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮與總氮。[0093]氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮與總氮分別采用奈氏比色法、紫外分光光度法、國標(biāo)水質(zhì)總氮測定法(GB11894-89水質(zhì)總氮的測定堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法)測定。結(jié)果見圖1。觀測到接種可培養(yǎng)化VBNC節(jié)桿菌0DSLC13菌株可使Giltay培養(yǎng)基反應(yīng)液開始由綠色轉(zhuǎn)為深藍(lán)色并見產(chǎn)氣現(xiàn)象，說明該菌種能利用硝酸鹽還原形成堿性物質(zhì)，并產(chǎn)氣使指示劑顏色變化。同時(shí)測得硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化率為71.6%，總氮減少率為89.6%，未檢測到氨態(tài)氮與亞硝態(tài)氮的殘 存。
【權(quán)利要求】
1.一種復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC節(jié)桿菌0DSLC13菌株，該菌株的保藏編號為CCTCC No:M2014074，保減單位為:中國典型培養(yǎng)物保減中心，保減地址為:中國武漢大學(xué)，保減日期為:2014年03月05日。
2.一種用于權(quán)利要求1所述的節(jié)桿菌ODSLC13菌株的活化培養(yǎng)基，其特征在于:該培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)有以下的組分構(gòu)成: 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基1.0~3.0g;酵母膏0.2~0.5g;
葡萄糖 1.5 ~5.0g ; NaCI 0.5 ~5.0g ; 瓊脂1.0~4.0% ; 含復(fù)活促進(jìn)因子Rpf的復(fù)蘇培養(yǎng)液0.2~20%，去離子水1000ml ； 上述的百分比為占培養(yǎng)基總量的體積百分比。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的節(jié)桿菌ODSLC13菌株的活化培養(yǎng)基，其特征在于含復(fù)活促進(jìn)因子Rpf的復(fù)蘇培養(yǎng)液由培養(yǎng)基基液、細(xì)菌液和土壤液構(gòu)成；所述的細(xì)菌液由藤黃微球菌菌種在菌種液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)至對數(shù)期后期，經(jīng)離心去除菌種液體培養(yǎng)基提取獲得蛋白質(zhì)，含有復(fù)活促進(jìn)因子Rpf，細(xì)菌液按體積比為培養(yǎng)基基液的1-10% ;所述的土壤液由經(jīng)風(fēng)干、過篩、去除雜質(zhì)的園土，加自來水，多次滅菌，過濾取濾液或離心取上清液，土壤液按體積比為培養(yǎng)基基液的1_5%。
4.一種節(jié)桿菌ODSLC13菌株的活化培養(yǎng)基配制方法，其特征在于該方法包括以下的步驟:稱取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基1.0~3.0g,酵母膏0.2~0.5g，葡萄糖1.5~5.0g, NaCI0.5~5.0g ;去離子水1000ml, pH調(diào)至7.0，加1.0~4.0%瓊脂，經(jīng)110~130。。、10~30min高壓滅菌后冷卻至室溫；另在無菌條件下加入2~20 (v/v)經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾滅菌、pH7.0的復(fù)蘇培養(yǎng)液，攪拌混勻，分注干固，倒置4-10°C保藏待用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的節(jié)桿菌ODSLC13菌株的活化培養(yǎng)基配制方法，其特征在于:復(fù)蘇培養(yǎng)液的制備方法如下: 1)取少量藤黃球菌菌種接種于菌種液體培養(yǎng)基，25~35°C、100~150rpm振動(dòng)培養(yǎng)；細(xì)菌生長至對數(shù)期后期，培養(yǎng)液用3000~8000rpm，10~30min離心抽提去除菌體；經(jīng)0.20~0.25 μ m膜過濾滅菌后，-30~_10°C保存?zhèn)溆茫? 2)取經(jīng)風(fēng)干、過篩、去除雜質(zhì)的園土1kg，加自來水I~2L，110~130°C、10~40min高壓滅菌鍋滅菌；室溫待一晚后，再度用同法滅菌；1500~2500r/min低速離心取上清液或用濾紙過濾棄渣獲得濾液，經(jīng)110~130°C、10~30min高壓滅菌鍋滅菌后冷卻，_30~-10°C保存?zhèn)溆茫? 3)準(zhǔn)確稱取培養(yǎng)基基液的各組分，pH調(diào)至7.0，110~130°C、10~30min高壓滅菌鍋滅菌后冷卻至室溫待用；培養(yǎng)基基液適宜多數(shù)細(xì)菌的分離，對于有特殊要求以及有選擇性的細(xì)菌可以相應(yīng)加減營養(yǎng)組分； 4)使用前，在無菌條件下，培養(yǎng)基基液中加1-10%細(xì)菌液，再加1-5%土壤液，混勻后使用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC節(jié)桿菌ODSLC13菌株應(yīng)用于含硝酸鹽基質(zhì)的反硝化脫氮。
7.一種含硝酸鹽基質(zhì)的反硝化脫氮方法，其特征在于:該方法將權(quán)利要求1所述的復(fù)蘇可培養(yǎng)化的VBNC節(jié)桿菌ODSLC13菌株經(jīng)活化培養(yǎng)、前培養(yǎng)后加入污水生物處理系統(tǒng)中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的含硝酸鹽基質(zhì)的反硝化脫氮方法，其特征在于:活化培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)由以下的組分構(gòu)成: 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基1.0~3.0g;酵母膏0.2~0.5g;
葡萄糖 1.5 ~5.0g ; NaCI 0.5 ~5.0g ; 瓊脂1.0~4.0% ; 含復(fù)活促進(jìn)因子Rpf的復(fù)蘇培養(yǎng)液10%，去離子水1000ml ； 上述的百分比為占培養(yǎng)基總量的體積百分比。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的含硝酸鹽基質(zhì)的反硝化脫氮方法，其特征在于:前培養(yǎng)采用的培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)由以下的組分構(gòu)成: 蛋白胨3.0~8.0g，酵母膏0.2~0.8g，
葡萄糖 3.0 ~8.0g, NaCl 1.5 ~5.5g, 1000ml去離子水，pH調(diào)至7.0。
【文檔編號】C12R1/06GK104017752SQ201410169547
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】丁林賢, 周黎宏 申請人:丁林賢, 東陽市歐德尚環(huán)保節(jié)能工程有限公司