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雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒、制備方法及應(yīng)用的制作方法

文檔序號:6172714閱讀:671來源:國知局
雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒、制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒、制備方法及應(yīng)用,特別是一種雞鼻氣管鳥桿菌(Ornithobacterium?rhinotracheale?YN12091,菌株保藏號是:CCTCC?No:M2013318,簡稱ORT),血凝抑制抗體檢測試劑盒、制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明通過篩選ORT高血凝活性菌株,培養(yǎng)、洗滌制備ORT血凝抗原;通過采集綿羊血液,洗滌和離心方法制備綿羊紅細(xì)胞,用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制備醛化綿羊紅細(xì)胞;通過ORT菌懸液?3次免疫雞,采血離心制備ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清;將制備的ORT血凝抗原、醛化綿羊紅細(xì)胞和ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清組裝建立雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒。該試劑盒不僅能對雞血清中的ORT抗體進(jìn)行檢測,而且能對雞卵黃中卵黃抗體進(jìn)行檢測。
【專利說明】雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒、制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明專利涉及一種雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒、制備方法及應(yīng)用,鼻氣管鳥桿菌 YN12091 (Ornithobacterium rhinotracheale YN12091,保藏單位:中國典型培養(yǎng)物保藏中心;保藏單位地址:中國武漢武漢大學(xué);保藏日期2013年7月6日;菌株保藏號是=CCTCC N0.:M2013318,簡稱0RT),血凝抑制抗體檢測試劑盒、制備方法及應(yīng)用,特別是檢測雞鼻氣管鳥桿菌血清抗體和卵黃抗體水平的半定量檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]鼻氣管鳥桿菌(Ornithobacteriumrhinotracheale YN12091,簡稱0RT)是新命名的一種以家禽和野禽呼吸道疾病相關(guān)的病原體,ORT感染的主要癥狀為生長遲緩、死亡率增高、產(chǎn)蛋減少。肺炎,胸膜炎和氣囊炎是本病的主要病理特征,該病呈世界分布,ORT可能引起原發(fā)性或繼發(fā)性感染,其死亡率通常為1%?15%,協(xié)同感染和繼發(fā)感染其它病菌時死亡率增加,在大部分嚴(yán)重感染的情況下,其死亡率高達(dá)50%,該病給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]ORT感染的血清學(xué)鑒定和免疫狀況的評估均需檢測血清或卵黃中的ORT抗體。
[0004]現(xiàn)有進(jìn)口的鼻氣管鳥疫桿菌間接ELISA抗體檢測試劑盒只能檢測雞和火雞血清中ORT抗體,在大規(guī)模檢測和免疫狀況監(jiān)測時需要進(jìn)行大批雞只進(jìn)行采血,容易造成應(yīng)激影響雞的生產(chǎn);另外,該進(jìn)口試劑盒不能檢測卵黃中的ORT抗體,且價格昂貴使其大規(guī)模應(yīng)用受到一定的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于克服上述現(xiàn)有進(jìn)口 ORT間接ELISA抗體檢測試劑盒不能檢測雞卵黃中ORT抗體的不足,發(fā)明一種鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒。該試劑盒不僅能對雞血清中的ORT抗體進(jìn)行檢測,而且能對雞卵黃中卵黃抗體進(jìn)行檢測。
[0006]本發(fā)明解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒包含有ORT血凝抗原、醛化綿羊紅細(xì)胞和ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,其中所述ORT血凝抗原是通過篩選ORT高血凝活性菌株,培養(yǎng)、洗滌制備;所述醛化綿羊紅細(xì)胞是通過采集綿羊血液,洗滌和離心方法制備綿羊紅細(xì)胞,用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制備;所述ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清是通過ORT菌懸液3次免疫健康雞,第3次免疫后采集血液,離心制備。
[0007]—種雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒的制備方法,其特征在于工藝步驟為:
[0008]制作ORT血凝抗原:篩選ORT高血凝活性菌株,通過培養(yǎng)、洗滌制備ORT血凝抗原;
[0009]制作醛化綿羊紅細(xì)胞:采集綿羊血液,通過洗滌和離心方法制備綿羊紅細(xì)胞,用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制備醛化綿羊紅細(xì)胞;
[0010]制作ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清:通過ORT菌懸液三次免疫健康雞,第三次免疫后采集血液,離心制備ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清;[0011]將上述制備的ORT血凝抗原、醛化綿羊紅細(xì)胞和ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清組裝建立雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒。
[0012]所述雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒的操作步驟即血凝抑制試驗(yàn)方法步驟為:
[0013](I)根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4單位抗原:
[0014]以能引起100%血凝的ORT血凝抗原最高稀釋倍數(shù)代表1個血凝單位,4單位抗原的的配制方法如下:試劑盒提供的ORT血凝效價為1:1024,則4單位抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:256,其中1024/4=256,稀釋時,將20 μ L抗原加入到5 mL PBS中即為4單位抗原。但是,該4單位抗原必須經(jīng)過驗(yàn)證后才可確定其實(shí)際稀釋倍數(shù),用于血凝抑制效價的測定;
[0015]4單位抗原的驗(yàn)證方法即血凝試驗(yàn)方法:取96孔V形微量反應(yīng)板(為了便于以下描述96孔板中每個孔的具體位置,將96孔V形微量反應(yīng)板的8行分別命名為A~H行,12列分別命名為I~12列。如:第I行的第5列孔,則表示為A5孔;第2行的第6列孔,則表示為B6孔。);
[0016]A.用移液器在Al~A6孔各加入25 μ L PBS ;
[0017]B.吸取25 μ L ORT血凝抗原加入到Al孔中,吹打3~5次充分混勻;
[0018]C.從Al孔中吸取25 μ L混勻后的抗原液加到Α2孔中,混勻后吸取25μ L加入到A3孔中,依次進(jìn)行系列倍比稀釋至Α4孔,`最后從Α4孔各吸取25 μ L棄之,Α5和Α6孔為紅細(xì)胞對照;
[0019]D.自右向左依次向Α6~Al孔中加入25 μ L 1%(ν/ν)醛化綿羊紅細(xì)胞懸液;
[0020]Ε.將反應(yīng)板置于微量振蕩器上振蕩I min,室溫(20~25°C )靜置60 min后觀察結(jié)果,在醛化紅細(xì)胞對照孔即A5和A6孔出現(xiàn)完全沉淀的情況下,其I X單位抗原孔(A2孔)的紅血球必須達(dá)到100%凝集,同時0.5 X單位抗原孔(A3孔)醛化紅細(xì)胞達(dá)到50%凝集50%下沉孔底才符合要求,否則重新調(diào)配;
[0021](2)取96孔V形微量反應(yīng)板,用移液器在Al~All孔各加入25 μ L PBS,A12?L加入 50 μ L PBS ;
[0022](3)在Al孔加入25 μ L被檢血清或1/2倍稀釋的卵黃液(取雞蛋,將蛋殼敲出I小孔暴露卵黃,用不帶針頭的注射器吸取卵黃2 mL于玻璃瓶中,再加入2mL生理鹽水,混勻即為1/2倍稀釋的卵黃液),充分混勻后吸取25 μ L加至A2孔,依次類推,倍比稀釋至AlO孔,最后從AlO孔各吸取25 μ L棄之,設(shè)All孔為ORT抗原對照,Α12孔為醛化紅細(xì)胞對照;
[0023](4)在第Al~All孔各加入25 μ L 4單位抗原,置微量振蕩器上160轉(zhuǎn)/分鐘震蕩I分鐘,使反應(yīng)物混合均勻,室溫靜置30 min ;
[0024](5)自右向左依次向A12~Al孔加入25 μ L 1%(ν/ν)醛化綿羊紅細(xì)胞懸液;
[0025](6)將反應(yīng)板置于微量振蕩器上振蕩I min,室溫靜置60 min后觀察結(jié)果,在醛化紅細(xì)胞對照出現(xiàn)完全沉淀、ORT抗原對照出現(xiàn)完全凝集的情況下,以完全抑制醛化紅細(xì)胞凝集的血清或卵黃最大稀釋倍數(shù)判為該血清或卵黃的血凝抑制效價,當(dāng)被檢血清或卵黃抗體效價大于等于16即41og2,判為ORT抗體陽性。
[0026]所述96孔V型微量反應(yīng)板中每個孔的具體位置是,將96孔V形微量反應(yīng)板的8行分別命名為A~H行,12列分別命名為I~12列,如:第I行的第5列孔,則表示為A5孔,第2行的第6列孔,則表示為B6孔。[0027]在臨床樣品即雞血清或卵黃檢測中,當(dāng)檢測樣品即雞血清或卵黃中無ORT特異性抗體即ORT血清抗體或卵黃抗體時,ORT血凝抗原與醛化紅細(xì)胞發(fā)生凝集,即血凝(hemagglutination, HA);當(dāng)檢測樣品中有ORT特異性抗體時,血凝抗原與抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng),血凝被不同程度地抑制,即產(chǎn)生不同程度的血凝抑制(hemagglutinationinhibition, HI)。
[0028]本發(fā)明通過篩選ORT高血凝活性菌株,培養(yǎng)、洗滌制備ORT血凝抗原;通過采集綿羊血液,通過洗滌和離心方法制備綿羊紅細(xì)胞,用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制備醛化綿羊紅細(xì)胞。通過ORT菌懸液3次免疫健康雞,第3次免疫后采集血液,離心制備ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清。將制備的ORT血凝抗原、醛化綿羊紅細(xì)胞和ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清組裝建立雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒。
[0029]在臨床樣品(雞血清或卵黃)檢測中,當(dāng)檢測樣品中無ORT特異性抗體(0RT血清抗體或卵黃抗體)時,ORT血凝抗原與醒化紅細(xì)胞發(fā)生凝集,即血凝(hemagglutination, HA);當(dāng)檢測樣品中有ORT特異性抗體時,血凝抗原與抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng),血凝被不同程度地抑制,即產(chǎn)生不同程度的血凝抑制(hemagglutination inhibition, HI),抗體效價越高則血凝抑制效價越高,從而達(dá)到對樣品中的ORT特異性抗體進(jìn)行半定量檢測的目的。
[0030]本發(fā)明不僅能對雞ORT血清抗體進(jìn)行半定量檢測,而且能對雞ORT卵黃抗體進(jìn)行半定量檢測,同時具有經(jīng)濟(jì)、簡便、靈敏、快速,適于大批量樣品檢測等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]下面結(jié)合附圖所示實(shí)施例,對結(jié)構(gòu)作進(jìn)一步說明,但本發(fā)明保護(hù)范圍不限于此實(shí)施例。
[0032]圖1本發(fā)明實(shí)施例血凝抗原血凝效價測定。
[0033]圖2本發(fā)明實(shí)施例4單位抗原的驗(yàn)證。
[0034]圖3本發(fā)明實(shí)施例1?4號被檢血清樣品的血凝抑制抗體效價檢測。
【具體實(shí)施方式】
[0035]實(shí)施例
[0036](1)0RT血凝抗原的制備:將雞鼻氣管鳥桿菌(Ornithobacterium rhinotrachealeYN12091,菌株保藏號是:CCTCC N0.:M2013318,簡稱0RT)云南分離株YN12091 (菌株保藏號是:CCTCC No:M2013318),菌種接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,放置于5% CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)24h,用PBS (0.1M, Ph6.3)將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落洗下來,4000rpm離心IOmin棄上清,再用PBS將菌泥重懸,再離心。重復(fù)離心和重懸步驟將ORT菌體洗3次,第3次離心后棄上清,菌泥用PBS重懸,調(diào)整其濃度為15mg/mL (蛋白濃度用超微量紫外分光光度計(jì)測定),加入終濃度為0.01%(m/v)的硫柳汞,4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0037](2)醛化綿羊紅細(xì)胞的制備:采集綿羊血(20mL)與3倍體積(60mL)的阿氏液混合,4000rpm離心IOmin棄上清,沉淀用滅菌PBS (0.15M, pH7.2) ( 500mL)重懸再離心,重復(fù)離心和重懸步驟將ORT菌體洗3次,第3次離心后棄上清,紅細(xì)胞泥用PBS(23mL)重懸使其濃度達(dá)到30%(v/v),在4°C條件下緩緩滴加等體積(33mL)的2%(v/v)戊二醛,邊滴加邊震蕩(IOOrpm)醒化50min后,4000rpm離心IOmin棄上清,沉淀用PBS(500mL)重懸后再離心,重復(fù)離心和重懸步驟將醛化紅細(xì)胞洗3次,第3次離心后棄上清,紅細(xì)胞泥用PBS (23mL)重懸并調(diào)整其濃度制成30%(v/v)醛化紅細(xì)胞,加入等體積(33mL)的1/20000鞣酸,37°C鞣化15min后,4000rpm離心IOmin棄上清,沉淀用PBS(500mL)重懸后再離心,重復(fù)離心和重懸步驟將醛化紅細(xì)胞洗3次,第3次離心后棄上清,紅細(xì)胞泥用PBS (IOOOmL)重懸并調(diào)整其濃度制成1% (v/v)醛化紅細(xì)胞,加入l%(m/v)硫柳汞(IOmL)使其終濃度為0.01%(m/v),4 °C保存?zhèn)溆谩?br> [0038](3) ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清的制備:將ORT云南分離株YN13091菌種接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,放置于5% CO2培養(yǎng)箱37 °C培養(yǎng)24h,用生理鹽水(0.9% (m/v) NaCl溶液)將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落洗下來,4000rpm離心IOmin棄上清,再用生理鹽水將菌泥重懸,再離心。重復(fù)離心和重懸步驟將ORT菌體洗3次,第3次離心后棄上清,菌泥用生理鹽水重懸,調(diào)整其濃度為lOmg/mL (蛋白濃度用超微量紫外分光光度計(jì)測定),加入終濃度為0.05% (v/v)甲醛溶液,4°C放置24小時,使細(xì)菌滅活,即為免疫抗原,4°C保存?zhèn)溆?。?.5mL免疫抗原頸部皮下注射免疫I只健康成年雞(第一次免疫),一免后15天后再取0.5mL免疫抗原對該雞進(jìn)行頸部皮下注射二次免疫,二免后8天后再取0.5mL免疫抗原對該雞進(jìn)行頸部皮下注射三次免疫。第三次免疫后第7天對該雞進(jìn)行翅膀下靜脈采血,所采血液放置于50mL離心管中,放置于37°C溫箱中5小時后,4000rpm離心30min后取上清,即為ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0039](4)血凝抑制試驗(yàn)檢測雞血清和卵黃中ORT抗體的具體步驟:
[0040]①血凝試驗(yàn)確定ORT血凝抗原的血凝效價(血凝試驗(yàn)方法):A.取96孔V形微量反應(yīng)板,用微量移液器在Al?A12孔每孔加25 μ L PBS0 B.吸取25 μ L ORT血凝抗原加入到Al孔中,吹打3?5次充分混勻。C.從Al孔中吸取25 μ L混勻后的抗原液加到Α2孔中,混勻后吸取25 μ L加入到A3孔中,依次進(jìn)行系列倍比稀釋至All孔,最后從Al I孔各吸取25 μ L棄之,Α12孔為醛化紅細(xì)胞對照。D.自右向左依次向Α12?Al孔中加入25UL 1%(ν/ν)醛化綿羊紅細(xì)胞懸液。Ε.將反應(yīng)板置于微量振蕩器上振蕩I min,室溫(20?25°C)靜置60 min后觀察結(jié)果:醛化紅細(xì)胞對照孔(A12孔)出現(xiàn)完全沉淀,該次試驗(yàn)有效,能使醛化紅細(xì)胞完全凝集的ORT抗原最大稀釋倍數(shù)為1:1024 (見圖1),因此將該ORT血凝抗原的血凝效價判定為1:1024。
[0041]②根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4單位血凝抗原。將上述血凝效價為1:1024的血凝抗原稀釋1:256倍(即血凝效價1024/4=256)即為4單位血凝抗原。稀釋時,將20 μ L抗原加入到5 mL PBS中即為4單位抗原。但是該4單位抗原必須經(jīng)過驗(yàn)證后才可確定其實(shí)際稀釋倍數(shù),用于血凝抑制效價的測定。
[0042]4單位抗原的驗(yàn)證步驟:取96孔V形微量反應(yīng)板,Α.用移液器在Al?Α6孔各加入25 μ L PBS ;Β.吸取25 μ L ORT血凝抗原加入到Al孔中,吹打3?5次充分混勻;C.從Al孔中吸取25 μ L混勻后的抗原液加到Α2孔中,混勻后吸取25 μ L加入到A3孔中,依次進(jìn)行系列倍比稀釋至Α4孔,最后從Α4孔各吸取25 μ L棄之,Α5、Α6孔為醛化紅細(xì)胞對照;D.自右向左依次向A6?Al孔中加入25 μ L 1%(ν/ν)醛化綿羊紅細(xì)胞懸液。Ε.將反應(yīng)板置于微量振蕩器上振蕩I min,室溫靜置60 min后觀察結(jié)果:醛化紅細(xì)胞對照孔(A5、A6孔)出現(xiàn)完全沉淀,IX單位抗原孔(A2孔)的醛化紅細(xì)胞100%凝集,同時0.5X單位抗原孔(A3孔)醛化紅細(xì)胞達(dá)到50%凝集50%下沉(見圖2),所以經(jīng)驗(yàn)本次試驗(yàn)所配制的4單位抗原可作為本次血凝抑制試驗(yàn)中的“4單位血凝抗原”,即試劑盒中的ORT血凝抗原稀釋1:256倍即為本次血凝抑制試驗(yàn)中的4單位血凝抗原。
[0043]③取96孔V形微量反應(yīng)板,用移液器在Al~Ell孔各加入25 μ L PBS,A12~Ε12 孔加入 50 μ L PBS.
[0044]④在Al~El孔中分別加入25 μ L I~4號被檢血清和標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,用多道移液器將Al~El孔分別充分混勻后移出25 μ L分別加至Α2~Ε2孔,依次類推,倍比稀釋至AlO~ElO孔,第AlO~ElO孔分別棄去25 μ L,設(shè)All~Ell孔為ORT抗原對照,Α12~Ε12孔為醛化紅細(xì)胞對照。
[0045]⑤在Al~Ell孔中各加入25 μ L 4單位抗原,置微量振蕩器上160轉(zhuǎn)/分鐘震蕩I分鐘,使反應(yīng)物混合均勻,室溫靜置30 min。
[0046]⑥自右向左依次向E12~Al各孔中加入25 μ L 1%(v/v)醛化綿羊紅細(xì)胞懸液。
[0047]⑦將反應(yīng)板置于微量振蕩器上振蕩I min,室溫靜置60 min后觀察結(jié)果:醛化紅細(xì)胞對照(A12~E12孔)出現(xiàn)完全沉淀,且ORT抗原對照孔(All~Ell)出現(xiàn)完全凝集,陽性血清血凝抑制效價為1:128,該次試驗(yàn)有效。Al~El孔中的各血清樣品能完全抑制醛化紅細(xì)胞凝集的最大稀釋倍數(shù)為分別為1:128、1:32、1:128、1:128 (見圖3),因此I~4號被檢血清的血凝抑制效價分別判定為1:128、1:32、1:128、1:128。又因?yàn)镮~4號血清血凝抑制效價均大于16,所以I~4號被檢血清均判定為ORT抗體陽性。
[0048]試劑盒應(yīng)用的操作步驟(血凝抑制試驗(yàn)方法):
[0049](I)根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4單位抗原。以能引起100%血凝的ORT血凝抗原最高稀釋倍數(shù)代表1個血凝單位,4單位抗原的的配制方法如下:試劑盒提供的ORT血凝效價為1:1024,則4單位抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:256 (1024/4=256),稀釋時,將20 μ L抗原加入到5 mL PBS中即為4單位抗原。但是該4單位抗原必須經(jīng)過驗(yàn)證后才可確定其實(shí)際稀釋倍數(shù),用于血凝抑制效價的測定。
[0050]4單位抗原的驗(yàn)證方法(血凝試驗(yàn)方法):取96孔V形微量反應(yīng)板(為了便于以下描述96孔V形微量反應(yīng)板中每個孔的集體位置,將96孔V形微量反應(yīng)板的8行分別命名為A~H行,12列分別命名為I~12列。如--第I行的第5列孔,則表示為Α5孔,第2行的第6列孔,則表示為Β6孔。),Α.用移液器在Al~Α6孔各加入25 μ L PBS ;Β.吸取25μ L ORT血凝抗原加入到Al孔中,吹打3~5次充分混勻;C.從Al孔中吸取25 μ L混勻后的抗原液加到Α2孔中,混勻后吸取25 μ L加入到A3孔中,依次進(jìn)行系列倍比稀釋至Α4孔,最后從Α4孔中吸取25 μ L棄之,Α5和Α6孔為醛化紅細(xì)胞對照;D.自右向左依次向A6~Al孔中加入25 μ L 1%(ν/ν)醒化綿羊紅細(xì)胞懸液。Ε.將反應(yīng)板置于微量振蕩器上振蕩I min,室溫靜置60 min后觀察結(jié)果,在醛化紅細(xì)胞對照孔(A5和A6孔)出現(xiàn)完全沉淀的情況下,其IX單位抗原孔(A2孔)的醛化紅細(xì)胞必須達(dá)到100%凝集,同時0.5X單位抗原孔(A3孔)紅血球達(dá)到50%凝集50%下沉孔底才符合要求,否則重新調(diào)配。
[0051](2)取96孔V形微量反應(yīng)板,用移液器在Al~All孔各加入25 μ L PBS,A12?L加入 50 μ L PBS。
[0052](3)在Al孔加入25 μ L被檢血清或1/2倍稀釋的卵黃液(取雞蛋,將蛋殼敲出I小孔暴露卵黃,用不帶針頭的注射器吸取卵黃2 mL于玻璃瓶中,再加入2mL生理鹽水,混勻即為1/2倍稀釋的卵黃液),充分混勻后吸取25 UL加至A2孔,依次類推,倍比稀釋至AlO孔,最后從AlO孔各吸取25 μ L棄之,設(shè)All孔為ORT抗原對照,Α12孔為醛化紅細(xì)胞對照。
[0053](4)在第Al?All孔各加入25 μ L 4單位抗原,置微量振蕩器上160轉(zhuǎn)/分鐘震蕩I分鐘,使反應(yīng)物混合均勻,室溫靜置30 min。
[0054](5)自右向左依次向A12?Al孔加入25 μ L 1%(ν/ν)醛化綿羊紅細(xì)胞懸液。
[0055](6)將反應(yīng)板置于微量振蕩器上振蕩I min,室溫靜置60 min后觀察結(jié)果,在醛化紅細(xì)胞對照出現(xiàn)完全沉淀、ORT抗原對照出現(xiàn)完全凝集的情況下,以完全抑制醛化紅細(xì)胞凝集的血清或卵黃最大稀釋倍數(shù)判為該血清或卵黃的血凝抑制效價。當(dāng)被檢血清或卵黃抗體效價大于等于16 (41og2),判為ORT抗體陽性。
【權(quán)利要求】
1.雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒,其特征在于:所述雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒的雞鼻氣管鳥桿菌(Ornithobacterium rhinotracheale YN12091,菌株保藏號是=CCTCC No:M2013318,簡稱0RT),該試劑盒包含有ORT血凝抗原、醛化綿羊紅細(xì)胞和ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,其中所述ORT血凝抗原是通過篩選ORT高血凝活性菌株,培養(yǎng)、洗滌制備;所述醛化綿羊紅細(xì)胞是通過采集綿羊血液,洗滌和離心方法制備綿羊紅細(xì)胞,用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制備;所述ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清是通過ORT菌懸液三次免疫健康雞,第3次免疫后采集血液,離心制備。
2.一種雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒的制備方法,其特征在于工藝步驟為: 制作ORT血凝抗原:將雞鼻氣管鳥桿菌(Ornithobacterium rhinotrachealeYN12091,菌株保藏號是:CCTCC No:M2013318,簡稱0RT)云南分離株YN12091 (菌株保藏號是:CCTCC No:M2013318),菌種接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,篩選ORT高血凝活性菌株,通過培養(yǎng)、洗滌制備ORT血凝抗原; 制作醛化綿羊紅細(xì)胞:采集綿羊血液,通過洗滌和離心方法制備綿羊紅細(xì)胞,用戊二醛固定并用鞣酸鞣化制備醛化綿羊紅細(xì)胞; 制作ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清:通過ORT菌懸液三次免疫健康雞,第三次免疫后采集血液,離心制備ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清; 將上述制備的ORT血凝抗原、醛化綿羊紅細(xì)胞和ORT標(biāo)準(zhǔn)陽性血清組裝建立雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒的制備方法,其特征在于:所述雞鼻氣管鳥`桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒的操作步驟即血凝抑制試驗(yàn)方法步驟為: (I)根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果配制4單位抗原: 以能引起100%血凝的ORT血凝抗原最高稀釋倍數(shù)代表1個血凝單位,4單位抗原的的配制方法如下:試劑盒提供的ORT血凝效價為1:1024,則4單位抗原的稀釋倍數(shù)應(yīng)是1:256,其中1024/4=256,稀釋時,將20 μ L抗原加入到5 mL PBS中即為4單位抗原,但是,該4單位抗原必須經(jīng)過驗(yàn)證后才可確定其實(shí)際稀釋倍數(shù),用于血凝抑制效價的測定; 4單位抗原的驗(yàn)證方法即血凝試驗(yàn)方法:取96孔V形微量反應(yīng)板(為了便于以下描述96孔板中每個孔的具體位置,將96孔V形微量反應(yīng)板的8行分別命名為A~H行,12列分別命名為I~12列;如--第I行的第5列孔,則表示為A5孔;第2行的第6列孔,則表示為B6 孔); A.用移液器在Al~A6孔各加入25μ L PBS ; B.吸取25μ L ORT血凝抗原加入到Al孔中,吹打3~5次充分混勻; C.從Al孔中吸取25μ L混勻后的抗原液加到Α2孔中,混勻后吸取25 μ L加入到A3孔中,依次進(jìn)行系列倍比稀釋至Α4孔,最后從Α4孔各吸取25 μ L棄之,Α5和Α6孔為紅細(xì)胞對照; D.自右向左依次向Α6~Al孔中加入25μ L 1%(ν/ν)醛化綿羊紅細(xì)胞懸液; Ε.將反應(yīng)板置于微量振蕩器上振蕩I min,室溫20~25°C靜置60 min后觀察結(jié)果,在醛化紅細(xì)胞對照孔即A5和A6孔出現(xiàn)完全沉淀的情況下,其IX單位抗原孔(A2孔)的紅血球必須達(dá)到100%凝集,同時0. 5X單位抗原孔(A3孔)醛化紅細(xì)胞達(dá)到50%凝集50% 下沉孔底才符合要求,否則重新調(diào)配;(2)取96孔V形微量反應(yīng)板,用移液器在A1?All孔各加入25uL PBS,A12孔加入 50 uL PBS ;(3)在A1孔加入25U L被檢血清或1/2倍稀釋的卵黃液(取雞蛋,將蛋殼敲出1小孔 暴露卵黃,用不帶針頭的注射器吸取卵黃2 mL于玻璃瓶中,再加入2mL生理鹽水,混勻即為 1/2倍稀釋的卵黃液),充分混勻后吸取25 y L加至A2孔,依次類推,倍比稀釋至A10孔,最 后從A10孔各吸取25 ii L棄之,設(shè)All孔為0RT抗原對照,A12孔為醛化紅細(xì)胞對照;(4)在第A1?All孔各加入25UL 4單位抗原,置微量振蕩器上160轉(zhuǎn)/分鐘震蕩 1分鐘,使反應(yīng)物混合均勻,室溫靜置30 min ;(5)自右向左依次向A12?A1孔加入25U L l%(v/v)醛化綿羊紅細(xì)胞懸液;(6)將反應(yīng)板置于微量振蕩器上振蕩1min,室溫靜置60 min后觀察結(jié)果,在醛化紅細(xì) 胞對照出現(xiàn)完全沉淀、0RT抗原對照出現(xiàn)完全凝集的情況下,以完全抑制醛化紅細(xì)胞凝集的 血清或卵黃最大稀釋倍數(shù)判為該血清或卵黃的血凝抑制效價,當(dāng)被檢血清或卵黃抗體效價 大于等于16即41og2,判為0RT抗體陽性。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒的制備方法, 其特征在于:所述96孔V型微量反應(yīng)板中每個孔的具體位置是,將96孔V形微量反應(yīng)板的 8行分別命名為A?H行,12列分別命名為1?12列,如:第1行的第5列孔,則表示為A5 孔,第2行的第6列孔,則表示為B6孔。
5.使用權(quán)利要求1所述的雞鼻氣管鳥桿菌血凝抑制抗體檢測試劑盒作為雞血清或 卵黃檢測的應(yīng)用,其特征在于:在臨床樣品即雞血清或卵黃檢測中,當(dāng)檢測樣品即雞血清 或卵黃中無0RT特異性抗體即0RT血清抗體或卵黃抗體時,0RT血凝抗原與醛化紅細(xì)胞 發(fā)生凝集,即血凝(hemagglutination, HA);當(dāng)檢測樣品中有0RT特異性抗體時,血凝 抗原與抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng),血凝被不同程度地抑制,即產(chǎn)生不同程度的血凝抑制 (hemagglutination inhibition,HI)。
【文檔編號】G01N33/569GK103513032SQ201310340100
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月6日
【發(fā)明者】李富祥, 李華春, 廖德芳 申請人:云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院
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