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幽門(mén)螺桿菌多重基因檢測(cè)體系及其試劑盒和應(yīng)用

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幽門(mén)螺桿菌多重基因檢測(cè)體系及其試劑盒和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多重基因檢測(cè)產(chǎn)品以及該產(chǎn)品所用到的檢測(cè)體系,屬于生物技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 幽門(mén)螺桿菌(H.pylori)是一種革蘭陰性、微需氧、彎曲狀桿菌,主要寄居在人體胃 部。幽門(mén)螺桿菌感染與慢性萎縮性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤和胃癌等 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),因此引起臨床的廣泛關(guān)注。1994年,國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)IARC已將其列為 人類(lèi)I類(lèi)致癌因子,是目前為止唯一被列為明確對(duì)人類(lèi)致癌的細(xì)菌性病原微生物。很多報(bào)告 認(rèn)為幽門(mén)螺桿菌感染與冠心病、類(lèi)風(fēng)濕、肝膽病、肺結(jié)核、妊娠嘔吐、直結(jié)腸癌及多種皮膚病 等疾病有關(guān)。流行病學(xué)顯示,全球幾乎有一半的人口感染此菌,發(fā)展中國(guó)家甚至高達(dá)60%~ 70%。因此,幽門(mén)螺桿菌感染是世界各國(guó)需要面對(duì)的公共衛(wèi)生問(wèn)題。
[0003] 目前幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)和鑒定方法均有其局限性。例如:1)分離培養(yǎng)鑒定:幽門(mén)螺桿 菌培養(yǎng)成菌落后,經(jīng)生化反應(yīng)鑒定。由于幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)需要微需氧條件,對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求 苛刻,因此檢出率極低,作為常規(guī)診斷手段不易推廣,且幽門(mén)螺桿菌培養(yǎng)需要一定的時(shí)間, 不利于快速診斷。2)組織病理切片染色法:該方法是把患者胃鏡檢查活檢組織切片,染色 后可觀察到組織中的幽門(mén)螺桿菌。該方法受幽門(mén)螺桿菌載量影響明顯,且操作繁瑣、費(fèi)時(shí), 不適于大通量樣本的檢測(cè)。3)尿素酶依賴(lài)性試驗(yàn)(尿素呼氣試驗(yàn)):根據(jù)標(biāo)志物不同分為 13C 呼吸試驗(yàn)及14C呼吸試驗(yàn),臨床應(yīng)用廣泛。缺點(diǎn)是費(fèi)用高、易受抑菌藥物和抑酸藥物的影響、 敏感度低。4)免疫學(xué)檢查:檢測(cè)血清中或唾液和尿液中抗體(IgG)或直接檢測(cè)糞便中幽門(mén)螺 桿菌的抗原成分。其缺點(diǎn)是不能反映現(xiàn)癥感染。5)定量分析:常用的是real-time PCR,但 該方法檢測(cè)單一,通量小,對(duì)多個(gè)基因分析時(shí)成本高。6)藥敏試驗(yàn):該方法耗時(shí)長(zhǎng),操作繁 瑣,且依賴(lài)于分離培養(yǎng)菌株。
[0004] 幽門(mén)螺桿菌致病性與其感染量、耐藥性和產(chǎn)生的多種毒力因子密切相關(guān)。但是目 前常規(guī)的檢測(cè)方法均存在時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低、費(fèi)用高、通量低、尤其不能同時(shí)進(jìn)行多種相關(guān) 因素檢測(cè)等缺點(diǎn)。
[0005] 綜上所述,如何快速、準(zhǔn)確、全面地對(duì)幽門(mén)螺桿菌進(jìn)行鑒定、定量以及耐藥性和毒 力分析是本領(lǐng)域的技術(shù)人員迫切亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可以快速、全面、準(zhǔn)確、低成本的幽門(mén)螺桿菌 多重基因檢測(cè)體系及其試劑盒,以及采用該檢測(cè)體系在制備診斷產(chǎn)品方面的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是:一種幽門(mén)螺桿菌多重基因檢 測(cè)體系,可在同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行其菌種鑒定、定量、毒力和耐藥性分析。包括對(duì)菌種鑒 定基因16S rRNA進(jìn)行檢測(cè)的引物,分別對(duì)毒 1]12、;^6六1、;[06六2、(1卯六、01口六和11^3進(jìn)行檢測(cè)的引物,分別對(duì)耐藥基因233 11?祖的2143位 點(diǎn)、rdxA的148位點(diǎn)、pbp 1A的1777位點(diǎn)和gyrA的261位點(diǎn)的進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)的引物,以及分 別對(duì)幽門(mén)螺桿菌的拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析的基因 ureC和β-globin進(jìn)行檢測(cè)的引物;所述各引 物的正向引物的5'端均設(shè)有正向通用引物序列,所述各引物的反向引物的5'端均設(shè)有反向 通用引物序列。所述檢測(cè)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)后進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析。
[0008] 針對(duì)16S rRNA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示,針對(duì)16S rRNA 基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示; 針對(duì)cagA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示,針對(duì)cagA基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示; 針對(duì)vacA-sl或vacA-s2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示,針對(duì)vacA- sl或VacA-s2基因的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示; 針對(duì)vacA-ml基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID如.7所示,針對(duì)¥&〇六-!111基因的 反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示; 針對(duì)vacA-m2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID如.9所示,針對(duì)¥&〇六-!112基因的 反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示; 針對(duì)iceAl基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示,針對(duì)iceAl基因的反向 引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示; 針對(duì)iceA2基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 13所示,針對(duì)iceA2基因的反向 引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示; 針對(duì)dupA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示,針對(duì)dupA基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No. 16所示; 針對(duì)oipA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示,針對(duì)oipA基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示; 針對(duì)luxS基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示,針對(duì)luxS基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示; 針對(duì)23S rRNA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示,對(duì)應(yīng)23S rRNA基因 2143位點(diǎn)為堿基A的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示,對(duì)應(yīng)23S rRNA基因2143 位點(diǎn)為堿基G的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 23所示; 針對(duì)rdxA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示,對(duì)應(yīng)rdxA基因148位點(diǎn) 為堿基C的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示,對(duì)應(yīng)rdxA基因148位點(diǎn)為堿基T的 反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 26所示; 針對(duì)pbplA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.27所示,對(duì)應(yīng)pbplA基因1777位 點(diǎn)為堿基A的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 28所示,對(duì)應(yīng)pbplA基因1777位點(diǎn)為堿基 G的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 29所示; 針對(duì)gyrA基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.30所示,對(duì)應(yīng)gyrA基因261位點(diǎn) 為堿基C或T的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 31所示,對(duì)應(yīng)gyrA基因261位點(diǎn)為堿基G 或A的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 32所示; 針對(duì)ureC基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.33所示,針對(duì)ureC基因的反向引 物的核苷酸序列如SEQ ID No.34所示; 針對(duì)β-globin基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID如.35所示,以及針對(duì)6-81〇1^11 基因的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 36所示; 所述正向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.37所示; 所述反向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.38所示。
[0009]針對(duì)16S rRNA、ureC、cagA、vacA-sl、vacA-ml、vacA_m2、iceAl、iceA2、dupA、oipA 和luxS基因的正向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為200nM;針對(duì)16S rRNA、ureC、cagA、 vacA-sl、vacA_ml、vacA_m2、iceAl、iceA2、oipA、luxS、和β-globin基因的反向引物在檢測(cè) 體系中的終濃度均為ΙΟΟηΜ;針對(duì)dupA和β-globin基因的正向引物在檢測(cè)體系中的終濃度 均為ΙΟΟηΜ; 針對(duì)23S rRNA基因的2143位點(diǎn)、rdxA基因的148位點(diǎn)、pbp 1A基因的1777位點(diǎn)和gyrA基 因的261位點(diǎn)的正向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為1 OOnM;對(duì)應(yīng)23S rRNA基因2143位點(diǎn)為 堿基A的反向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為300nM;對(duì)應(yīng)23S rRNA基因2143位點(diǎn)為堿基G 的反向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為350nM;對(duì)應(yīng)rdxA基因148位點(diǎn)為堿基C、對(duì)應(yīng)pbplA 基因1777位點(diǎn)為堿基A、對(duì)應(yīng)gyrA基因261位點(diǎn)為堿基C或T的反向引物、對(duì)應(yīng)rdxA基因148位 點(diǎn)為堿基T、對(duì)應(yīng)pbplA基因1777位點(diǎn)為堿基G的反向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為 400nM;對(duì)應(yīng)gyrA基因261位點(diǎn)為堿基G或A的反向引物在檢測(cè)體系中的終濃度均為450nM。 [00 10]上述幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)體系還包括PCR緩沖液、MgCl2溶液、dNTPs、熱啟動(dòng)DNA聚合 酶、帶熒光的通用標(biāo)簽混合物和DNA模板;所述帶熒光的通用標(biāo)簽混合物中包括反向通用引 物和帶有熒光標(biāo)記的正向通用引物。
[0011] 上述熒光標(biāo)記為CY5、CY3或FAM等。
[0012] 上述幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)體系還包括陽(yáng)性對(duì)照液和陰性對(duì)照液;所述陽(yáng)性對(duì)照物是包 括所有目的基因靶點(diǎn)的質(zhì)?;旌衔?所述陰性對(duì)照液是無(wú)核酸酶超純水。
[0013] 上述幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)體系反應(yīng)時(shí)體系中的組分用量為1〇 X的PCR緩沖液1體積,帶 熒光的通用標(biāo)簽混合物和2mmol/L的dNTPs共1體積,25mmol/L的MgCl2溶液2體積,引物混合 物1體積,5U/yL的熱啟動(dòng)DNA聚合酶1體積,DNA模板2體積,純水2體積。
[0014] 上述DNA模板的使用量為5~50ng/體系。
[0015] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的另一種技術(shù)方案是:一種采用上述檢測(cè)體系制 備幽門(mén)螺桿菌檢測(cè)和診斷產(chǎn)品的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明為解
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