硫酸化轉(zhuǎn)移酶sult1a3的特異性黃酮類化合物探針底物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】硫酸化轉(zhuǎn)移酶SULT1A3的特異性黃酮類化合物探針底物及其應(yīng)用，其中酶活性測定的具體操作流程為：選擇黃酮類化合物作為高特異性探針底物，建立酶活性研究的反應(yīng)體系包括酶、底物、啟動子及其他輔助成分等，通過調(diào)控體系中酶的用量、底物濃度、反應(yīng)溫度、體系的pH、反應(yīng)時間等條件，定量檢測單位時間內(nèi)的底物消除量或其硫酸化產(chǎn)物的生成量來考察各評價模型中SULT1A3的活性。本發(fā)明提供的高效低毒的硫酸化轉(zhuǎn)移酶SULT1A3的特異性探針底物，用于不同種屬、不同來源的體內(nèi)/外生物樣本及生物模型中SULT1A3酶活性的定量評估，以期表征該類探針?biāo)幬镌隗w內(nèi)的代謝過程，為其在臨床的合理、有效、安全的應(yīng)用提供科學(xué)指導(dǎo)。
【專利說明】硫酸化轉(zhuǎn)移酶SULT1 A3的特異性黃酮類化合物探針底物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及硫酸化轉(zhuǎn)移酶SULT1A3的特異性黃酮類化合物探針底物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]由硫酸化轉(zhuǎn)移酶(Sulfotransferases, SULTs)催化的II相代謝硫酸化結(jié)合反應(yīng)是許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化的重要途徑。SULTs從其輔因子3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)轉(zhuǎn)移親電子硫基部分至其底物的相應(yīng)基團(tuán)上，生成親電子的硫酸酯類復(fù)合物，增加底物水溶性并降低細(xì)胞膜的通透性，有利于其隨尿和膽汁排除體外。人類SULT基因家族主要有:SULTI, SULT2，SULT4和SULT6。其中SULTU SULT2兩個家族在內(nèi)外源性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化中充當(dāng)重要角色。人類SULTl家族中有4個亞家族，8個成員:SULT1A1，SULTIA2, SULTI A3, SULTIA4, SULT1B1, SULT1C2, SULTIC4, SULT IE 10 其中，SULT1A3 是 SULTl家族中的一個重要成員，其在人的胃腸道中有較高的表達(dá)，并在腎、肺、腦中也有一定的表達(dá)。由于SULT1A3在人的小腸中有較高的表達(dá)，而在肝臟中沒有表達(dá)，說明SULT1A3可能在口服藥物硫酸化代謝中發(fā)揮重要的作用。通過SULT1A3特異性探針底物探測其在人體主要代謝和排泄器官的代謝活性，有助于解析藥物的生物利用度、解毒途徑以及藥物相互作用等機(jī)制，為藥物在臨床上安全、合理、有效地應(yīng)用提供理論依據(jù)和科學(xué)指導(dǎo)，為新藥的開發(fā)提供有力支持。隨著研究的深入，SULT1A3還有可能與某些疾病的發(fā)生和發(fā)展有一定的關(guān)聯(lián)，并可能成為某些疾病的治療靶點，將在臨床疾病治療中發(fā)揮重要作用。因此SULT1A3特異性底物探針的研究和 開發(fā)具有重要的意義。
[0003]目前SULT1A3的底物以內(nèi)源性底物即兒茶酚胺類為主，如多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素、酪胺等。其中多巴胺是SULT1A3良好的特異性底物。但由于多巴胺屬于內(nèi)源性物質(zhì)，不能作為體內(nèi)探針應(yīng)用。因此迫切需要研究和開發(fā)SULT1A3外源性特異性探針底物以滿足基礎(chǔ)研究和臨床的需求。有研究顯示SULTl家族優(yōu)選外源性多酚類化合物作為其底物，尤其是SULT1A3在多酚類化合物的代謝和解毒過程中發(fā)揮一定的作用。
[0004]本發(fā)明以多酚類化合物中的黃酮類化合物作為體內(nèi)SULT1A3的特異性底物。黃酮類化合物廣泛存在于植物中，富含于與人類日常生活密切相關(guān)的食物、蔬菜及水果中，毒性低，是天然藥物中重要的活性組成部分。以它們?yōu)镾ULT1A3的特異性探針底物具有良好的安全性和較高檢測靈敏性。
[0005]目前硫酸化轉(zhuǎn)移酶功能活性的體外評價模型包括不同來源的重組單酶、哺乳動物多種代謝器官的亞細(xì)胞組分(主要為S9成分)、新鮮代謝組織細(xì)胞、經(jīng)典的細(xì)胞模型(如Caco-2細(xì)胞等)及其細(xì)胞裂解液等體系。其中已商品化的重組SULT1A3單酶主要來自細(xì)菌，昆蟲細(xì)胞，哺乳動物細(xì)胞以及酵母菌建立的克隆表達(dá)體系。借助上述評價模型，并結(jié)合硫酸化反應(yīng)的啟動子(PAPS)，在一定的孵育條件下即可獲得優(yōu)化的反應(yīng)體系，可通過檢測探針底物的代謝產(chǎn)物的形成和分泌速率，對上述各種模型中表達(dá)的SULT1A3酶反應(yīng)活性進(jìn)行表征。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一類硫酸化轉(zhuǎn)移酶SULT1A3的特異性黃酮類化合物探針底物及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供了一類硫酸化轉(zhuǎn)移酶SULT1A3的特異性探針底物及其應(yīng)用，該特異性底物是多酚類化合物中的黃酮類化合物。黃酮類化合物，又稱生物類黃酮，廣泛存在于植物的各個部位。黃酮類化合物是一類以C6-C3-C6為母核的天然化合物，且常有羥基、甲氧基等取代。黃酮類化合物的化學(xué)母核結(jié)構(gòu)，為兩個具有取代基團(tuán)的苯環(huán)通過中間三個碳原子連接而成，分為A、B、C三個部分，環(huán)上不同的取代基導(dǎo)致了不同的藥理與藥物代謝的活性。根據(jù)其C區(qū)的不同，可分為以下幾類:黃酮類(flavones)、二氫黃酮類(flavonones)、黃麗醇類(flavonol)、二氧黃麗醇類(flavanonol)、異黃麗類(Isoflavones)和查爾麗類(chalcones)等。具體結(jié)構(gòu)見圖1所示:其中A、B環(huán)上數(shù)字標(biāo)示的位置可為_Η、_0Η或-0CH3中的一種或多種。
[0008]本發(fā)明還提供所述特異性探針底物在各種評價模型中SULT1A3酶反應(yīng)活性的研究方法，并通過相應(yīng)的技術(shù)方案實現(xiàn):建立酶反應(yīng)活性研究的反應(yīng)體系包括酶、底物、啟動子及其他輔助成分等。通過調(diào)控體系中酶的用量、底物的濃度、反應(yīng)溫度、體系的pH、反應(yīng)時間等條件，定量檢測單位時間內(nèi)的底物消除量或其硫酸化產(chǎn)物的生成量來考察各評價模型中SULT1A3酶反應(yīng)活性。具體步驟如下:
[0009](I)選擇SULT1A3酶反應(yīng)活性研究的評價模型，建立相應(yīng)的反應(yīng)體系，根據(jù)特異性底物的性質(zhì)確定反應(yīng)體系中酶及PAPS的用量。 [0010](2)采用所選的黃酮類化合物作為底物，并根據(jù)反應(yīng)體系的不同類型選用不同的底物濃度。
[0011](3)嚴(yán)格控制反應(yīng)體系的反應(yīng)溫度、孵育體系的pH及反應(yīng)時間，確保上述底物的硫酸化結(jié)合產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率不超過30%。
[0012](4)根據(jù)底物性質(zhì)和檢測方法選擇適宜的有機(jī)溶媒終止反應(yīng)。
[0013](5)采用適宜的檢測方法，測定體系中單位時間內(nèi)硫酸化結(jié)合產(chǎn)物的生成量和底物原形的剩余量，計算特異性底物硫酸化結(jié)合反應(yīng)的反應(yīng)速率并以此作為評價硫酸化轉(zhuǎn)移酶酶活性評價指標(biāo)。
[0014]步驟(1)中的評價模型包括重組單酶SULT1A3以及與SULT1A3代謝功能活性有關(guān)的哺乳動物多種代謝器官的亞細(xì)胞組分(主要為S9成分)、新鮮代謝組織細(xì)胞、經(jīng)典的細(xì)胞模型(如Caco-2細(xì)胞等)及其細(xì)胞裂解液等。
[0015]步驟(4)、(5)的檢測方法包括紫外吸收光譜、質(zhì)譜、放射性同位素示蹤技術(shù)、薄層色譜、熒光激發(fā)光譜、蒸發(fā)光散射光譜及電化學(xué)光譜等。具體檢測過程可以單一方法或多種方法聯(lián)合應(yīng)用。
[0016]本發(fā)明提供的硫酸化轉(zhuǎn)移酶SULT1A3的特異性黃酮類探針底物，所述探針底物用于評價模型中SULT1A3酶反應(yīng)活性的反應(yīng)條件為:底物濃度介于1/5~5Km之間；孵育體系pH介于5~8.5之間；反應(yīng)溫度為25 V~55°C之間；底物的硫酸化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率不超過30%。[0017]本發(fā)明提供的硫酸化轉(zhuǎn)移酶SULT1A3的特異性黃酮類探針底物的應(yīng)用，該特異性探針底物用于不同來源的重組單酶、哺乳動物多種代謝器官的亞細(xì)胞組分、新鮮代謝組織細(xì)胞、各類經(jīng)典的細(xì)胞模型及其細(xì)胞裂解液中SULT1A3酶反應(yīng)活性的定量測定。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)勢及效果:本發(fā)明所提供的硫酸化轉(zhuǎn)移酶SULT1A3的特異性底物與目前報道的兒茶酚胺類相比，黃酮類化合物來源廣泛，易于獲得，可直接從植物提取，亦可化學(xué)合成。由于硫酸化轉(zhuǎn)移酶在不同生物體的代謝組織和器官均有不同程度表達(dá)，因此，SULT1A3的特異性底物的應(yīng)用范圍相對廣泛。而且這類化合物在不同來源的硫酸化轉(zhuǎn)移酶體內(nèi)外評價模型中的SULT1A3功能活性考察研究中，在方法和結(jié)果等方面均體現(xiàn)較高的穩(wěn)定性、良好的特異性及安全性，是一類高效低毒的SULT1A3特異性底物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1.黃酮類化合物的基本結(jié)構(gòu)，其中數(shù)字標(biāo)示的位置為-H、-OH或-OCH3中的一種或多種；
[0020]圖2.芹菜素(API)及其硫酸化結(jié)合產(chǎn)物(AP1-O-S) ( λ = 340nm)、內(nèi)標(biāo)(IS) ( λ=254nm)在重組單酶SULT1A3中的HPLC-UV圖；
[0021]圖3.芹菜素的硫酸化結(jié)合產(chǎn)物在重組單酶SULT1A3中的UPLC-MS/MS圖； [0022]圖4.不同濃度芹菜素在重組單酶SULT1A3中的硫酸化反應(yīng)速率概況；
[0023]圖5.白楊素(5，7DHF)及其硫酸化結(jié)合產(chǎn)物(5，7DHF-0-S)、內(nèi)標(biāo)(IS) ( λ =268nm)在人腸S9中的HPLC-UV圖；
[0024]圖6.白楊素的硫酸化結(jié)合產(chǎn)物在人腸S9中的UPLC-MS/MS圖；
[0025]圖7.不同濃度白楊素在人腸S9中的硫酸化反應(yīng)速率概況；
[0026]圖8.由SULT1A3介導(dǎo)的黃酮類化合物硫酸化結(jié)合的代謝通路；A為黃酮類化合物，B為黃酮類化合物硫酸化結(jié)合產(chǎn)物。
【具體實施方式】
[0027]下面的實施例將對本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。
[0028]實施例1.芹菜素用于定量測定重組單酶SULT1A3的酶活性
[0029](I)預(yù)先準(zhǔn)備190 μ I硫酸化代謝反應(yīng)體系，包括ρΗ7.4的KPI緩沖液(50mM)，人重組單酶SULTI A3 (0.00267~0.0053mg/ml)，芹菜素終濃度分別為2.5，10，30 μ Μ，于冰浴
上操作。
[0030](2)向上述反應(yīng)體系中加入10 μ I終濃度為2mM PAPS,迅速放入37°C的恒溫水浴
搖床中孵育并起始反應(yīng)。
[0031](3)反應(yīng)3~15分鐘后,加入50μ L冰的甲醇終止反應(yīng)。渦旋,用高速冷凍離心機(jī)，4°C條件下，17000Xg離心20分鐘后，取上清液進(jìn)行HPLC-UV/UPLC-MS/MS分析測定。
[0032](4)利用HPLC-UV在340nm下對芹菜素及其硫酸化結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行定量測定。計算重組人SULT1A3酶對上述三個濃度芹菜素的催化速率依次為12.26nmol/min/mg, 17.05nmol/min/mg, 9.29nmol/min/mg ;代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率依次為 10.32%，8.45%，3.55%。
[0033](5)通過UPLC-MS/MS方法對芹菜素在SULT1A3中硫酸化代謝產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證，結(jié)果顯示所有代謝物均為硫酸化單結(jié)合物，無兩個或兩個以上的羥基結(jié)合硫酸化產(chǎn)物。[0034]實施例2.白楊素用于定量測定人腸S9中的SULT1A3的酶活性
[0035](I)預(yù)先準(zhǔn)備190 μ I硫酸化代謝反應(yīng)體系，包括ρΗ7.4的KPI緩沖液(50mM)，人腸S9的蛋白濃度為0.0625mg/ml,白楊素終濃度為2.5，10，30 μ M，于冰浴上操作。
[0036](2)向上述反應(yīng)體系中加入10 μ I終濃度為2mM PAPS,迅速放入37°C的恒溫水浴
搖床中孵育并起始反應(yīng)。
[0037](3)反應(yīng)5~20分鐘后，加入50 μ L冰的甲醇終止反應(yīng)，渦旋，用高速冷凍離心機(jī)，4°C條件下，17000Xg離心20分鐘后，取上清液進(jìn)行HPLC-UV/UPLC-MS/MS分析測定。
[0038](4)利用HPLC-UV在268nm下對白楊素及其硫酸化結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行定量測定。計算人腸S9對上述三個濃度的白楊素的催化速率分別為0.66nmol/min/mg, 1.43nmol/min/mg,
1.37nmol/min/mg，代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率依次為 8.47%，7.18%，3.72%。
[0039](5)通過UPLC-MS/MS方法對白楊素在人腸S9中硫酸化代謝產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證，結(jié)果顯示所有代謝物均為硫酸化單結(jié)合物，無兩個或兩個以上的羥基結(jié)合硫酸化產(chǎn)物。 [0040]實施例3UPLC-MS/MS法測定芹菜素/白楊素代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)
[0041]如實施例1和2中操作，將所得上清液，進(jìn)行UPLC-ES1-MS/MS法分析鑒定，分析條件如下:負(fù)離子方式檢測；儀器參數(shù)為:離子噴霧電壓:-4.0kV ;源溫度:40(TC ;噴霧氣(gasl),氮氣，40psi,潤輪氣(gas2),氫氣,20psi ;保護(hù)氣,氮氣,20psi。采用一級全掃描質(zhì)譜及選擇離子全掃描二級質(zhì)譜(MS2full scan modes)兩種方式同時測定。如圖3所示，m/z349.2為芹菜素代謝產(chǎn)物[M-Η] —峰，其主要碎片離子為芹菜素離子峰m/z268.6 ;圖6中，白楊素代謝產(chǎn)物[M-Η] —峰為m/z333.4，其主要碎片離子為白楊素離子峰m/z253.4，芹菜素與白楊素二者的代謝產(chǎn)物[M-Η] —峰均與其主要碎片尚子峰相差80,與磺基的分子量相同，因此我們初步確定代謝產(chǎn)物為芹菜素/白楊素硫酸化結(jié)合產(chǎn)物。
【權(quán)利要求】
1.硫酸化轉(zhuǎn)移酶SULT1A3的特異性探針底物，其特征在于:該探針底物為黃酮類化合物，其化學(xué)母核結(jié)構(gòu)為兩個具有取代基團(tuán)的苯環(huán)通過中間三個碳原子連接而成，分為A、B、C三個部分，具體結(jié)構(gòu)見式(1)-(6)所示:其中A、B環(huán)上數(shù)字標(biāo)示的位置為-H、-OH或-OCH3中的一種或多種；
2.按照權(quán)利要求1所述硫酸化轉(zhuǎn)移酶SULT1A3的特異性探針底物，其特征在于:所述探針底物用于評價模型中SULT1A3酶反應(yīng)活性的反應(yīng)條件為:底物濃度介于1/5~5&之間；孵育體系pH介于5~8.5之間；反應(yīng)溫度為25°C~55°C之間；底物的硫酸化產(chǎn)物的生成率不超過30%。
3.權(quán)利要求1所述硫酸化轉(zhuǎn)移酶SULT1A3的特異性探針底物的應(yīng)用，其特征在于:該特異性探針底物用于不同來源的重組單酶、哺乳動物多種代謝器官的亞細(xì)胞組分、新鮮代謝組織細(xì)胞、各類經(jīng)典的細(xì)胞模型及其細(xì)胞裂解液中SULT1A3酶反應(yīng)活性的定量測定。
【文檔編號】C12Q1/48GK104031977SQ201410169404
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】孟勝男, 蔣昆諭, 張懋璠, 韓龍, 呂曉玥, 王欣, 周昱, 馬穎琳 申請人:孟勝男