專(zhuān)利名稱(chēng)：用作amp特異性磷酸二酯酶抑制劑的吡咯烷的腙衍生物和肟衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一系列為有效的選擇性環(huán)腺苷3’，5’-一磷酸特異性磷酸二酯酶(cAMP特異性PDE)抑制劑的化合物。本發(fā)明尤其涉及一系列可用于抑制cAMP特異性PDE功能、尤其是PDE4功能的新型肟化合物和腙化合物以及制備它們的方法、含有它們的藥用組合物和它們用作例如治療炎性疾病和其它涉及細(xì)胞因子和促炎介質(zhì)水平升高的疾病的治療藥物的用途。
背景技術(shù)：
慢性炎癥為一種多因素病癥，其特征為激活多種類(lèi)型的炎性細(xì)胞，尤其是淋巴系細(xì)胞(包括T淋巴細(xì)胞)和骨髓系細(xì)胞(包括粒性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞)。包括細(xì)胞因子例如腫瘤壞死因子(TNF)和白介素-1(IL-1)在內(nèi)的促炎介質(zhì)由這些活化細(xì)胞產(chǎn)生。因此，抑制這些細(xì)胞的激活或抑制它們產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子的藥物可用于治療性治療炎性疾病和其它涉及細(xì)胞因子水平升高的疾病。
環(huán)腺苷酸(cAMP)為一種介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)于廣泛的胞外刺激的生物反應(yīng)的第二信使。當(dāng)合適的激動(dòng)劑與特異性細(xì)胞表面受體結(jié)合時(shí)，激活腺苷酸環(huán)化酶，使腺苷三磷酸(ATP)轉(zhuǎn)化為cAMP。理論上在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)cAMP作用的激動(dòng)劑主要由cAMP-依賴(lài)性蛋白激酶作用介導(dǎo)。cAMP的細(xì)胞內(nèi)作用因?yàn)閏AMP轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外或環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(PDE)酶促裂解作用而中止，PDE水解3’-磷酸二酯鍵以形成5’-腺苷酸(5’-AMP)。5’-AMP為一種無(wú)活性代謝物。以下圖示說(shuō)明cAMP和5’-AMP的結(jié)構(gòu)。 在人骨髓系細(xì)胞和淋巴系細(xì)胞中cAMP水平升高與抑制細(xì)胞激活有關(guān)。因此，細(xì)胞內(nèi)PDE酶家族調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平。PDE4為這些細(xì)胞中的主要PDE同種型并且主要影響cAMP降解。因此，抑制PDE功能可防止cAMP轉(zhuǎn)化為無(wú)活性代謝物5’-AMP，從而維持較高的cAMP水平，因而抑制細(xì)胞激活(參見(jiàn)Beavo等，“CyclicNucleotide PhosphodiesterasesStructure，Regulation and Drug Action，”Wiley and Sons，Chichester，第3-14頁(yè)(1990))；Torphy等，Drug Newsand Perspectives，6，第203-214頁(yè)(1993)；Giembycz等，Clin.Exp.Allergy，22，第337-344頁(yè)(1992))。
具體來(lái)說(shuō)，已證明PDE4抑制劑例如咯利普蘭抑制TNFα的產(chǎn)生并且部分抑制單核細(xì)胞釋放IL-1β(參見(jiàn)Semmler等，Int.J.Immuopharmacol.，15，第409-413頁(yè)，(1993)；Molnar-Kimber等，Mediators of Inflammation，1，第411-417頁(yè)，(1992))。還證明了PDE4抑制劑抑制人多形核白細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物自由基(參見(jiàn)Verghese等，J.Mol.Cell.Cardiol.，21(增刊2)，S61(1989)；Nielson等，J.AllergyImmunol.，86，第801-808頁(yè)(1990))；抑制人嗜堿性粒細(xì)胞釋放血管活性胺和前列腺素類(lèi)(參見(jiàn)Peachell等，J.Immunol.，148，第2503-2510頁(yè)(1992))；抑制嗜酸性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)(參見(jiàn)Dent等，J.Pharmacol.，103，第1339-1346頁(yè)(1991))；以及抑制人T-淋巴細(xì)胞的激活(參見(jiàn)Robicsek等，Biochem.Pharmacol.，42，第869-877頁(yè)(1991))。
炎性細(xì)胞的激活和過(guò)量或非調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子(例如TNFα和IL-1β)產(chǎn)生參與變應(yīng)性疾病、自身免疫病和炎性疾病，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、甲狀腺相關(guān)性眼病、貝切特氏病、膿毒病、敗血癥性休克、內(nèi)毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒病、革蘭氏陽(yáng)性膿毒病、中毒性休克綜合征、哮喘、慢性支氣管炎、成人呼吸窘迫綜合征、慢性肺部炎性疾病例如慢性阻塞性肺炎、硅肺、肺結(jié)節(jié)病、心肌、腦和肢端再灌注損傷、纖維變性、囊性纖維變性、瘢痕疙瘩形成、疤痕形成、動(dòng)脈粥樣硬化、移植排斥病例如移植物抗宿主反應(yīng)和同種異體移植排斥、慢性腎小球腎炎、狼瘡、炎性腸病例如節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎、增生性淋巴細(xì)胞疾病例如白血病以及炎性皮膚病例如特應(yīng)性皮炎、牛皮癬和蕁麻疹。
特征在于細(xì)胞因子水平升高的其它疾病包括由于中度外傷引起的腦損傷(參見(jiàn)Dhillon等，J Neurotrauma，12，第1035-1043頁(yè)(1995)；Suttorp等，J.Clin.Invest.，91，第1421-1428頁(yè)(1993))、心肌病例如充血性心力衰竭(參見(jiàn)Bristow等，Circulation，97，第1340-1341頁(yè)(1998))、惡病質(zhì)、感染或惡性腫瘤繼發(fā)性惡病質(zhì)、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)繼發(fā)性惡病質(zhì)、ARC(AIDS相關(guān)綜合征)繼發(fā)性惡病質(zhì)、由于感染引起的發(fā)燒和肌痛、腦型瘧、骨質(zhì)疏松和骨吸收疾病、瘢痕疙瘩形成、疤痕組織形成和發(fā)熱。
具體來(lái)說(shuō)，已經(jīng)證實(shí)TNFα對(duì)于人獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)具有作用。AIDS是由于人免疫缺陷病毒(HIV)感染T-淋巴細(xì)胞引起的。盡管HIV也感染并存在于骨髓系細(xì)胞中，已經(jīng)證實(shí)TNF上調(diào)T-淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞中的HIV感染(參見(jiàn)Poli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，第782-785頁(yè)(1990))。
TNFα的幾種性質(zhì)例如刺激膠原酶、刺激體內(nèi)血管生成、刺激骨吸收和能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的附著，與TNF對(duì)腫瘤在宿主體內(nèi)形成和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的作用是一致的。最近報(bào)道，TNFα直接參與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移(參見(jiàn)Orosz等，J Exp.Med.，177，第1391-1398(1993))。
PDE4具有廣泛的組織分布。對(duì)于PDE4具有至少4種基因，任一給定基因的PDE4多種轉(zhuǎn)錄物能夠產(chǎn)生共有相同催化部位的幾種不同的蛋白。4種可能催化部位之間的氨基酸同一性大于85％。它們對(duì)抑制劑的同樣敏感性及其動(dòng)力學(xué)相似性反映了這個(gè)水平氨基酸同一性的功能方面作用。推測(cè)這些可變表達(dá)的PDE4蛋白的作用在于細(xì)胞通過(guò)這種作用可以區(qū)別性細(xì)胞內(nèi)定位這些酶和/或通過(guò)翻譯后修飾調(diào)節(jié)催化效率。表達(dá)PDE4酶的任一給定細(xì)胞類(lèi)型通常表達(dá)編碼這些蛋白的4種可能基因中的一種以上基因。
研究者已經(jīng)表現(xiàn)出對(duì)使用PDE4抑制劑作為消炎藥的極大興趣。早期的證據(jù)顯示，抑制PDE4對(duì)于各種炎性細(xì)胞例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、Th-1系T-細(xì)胞和粒性白細(xì)胞具有有益的作用。許多促炎介質(zhì)例如細(xì)胞因子、脂質(zhì)介質(zhì)、超氧化物和生物胺例如組胺的合成和/或釋放通過(guò)PDE4抑制劑的作用在這些細(xì)胞中減少。PDE4抑制劑也影響其它細(xì)胞功能包括T-細(xì)胞增殖、粒性白細(xì)胞在化學(xué)毒性物質(zhì)作用下的移行和脈管系統(tǒng)內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞連接的完整性。
已經(jīng)報(bào)告了各種PDE4抑制劑的設(shè)計(jì)、合成和篩選。甲基黃嘌呤例如咖啡因和茶堿是最早被發(fā)現(xiàn)的PDE抑制劑，但是，這些化合物對(duì)于抑制PDE是非選擇性。藥物咯利普蘭(抗抑郁藥)是最早報(bào)道的特異性PDE4抑制劑之一。已經(jīng)報(bào)道，具有以下結(jié)構(gòu)式的咯利普蘭抑制重組人PDE4的50％抑制濃度(IC50)為約200nM(納摩爾)。 咯利普蘭研究者一直在尋找這樣的PDE4抑制劑抑制PDE4的選擇性更高，IC50比咯利普蘭更低，沒(méi)有使用咯利普蘭有關(guān)的不需要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)副作用，例如干嘔、嘔吐和鎮(zhèn)靜作用。在Feldman等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,665,754中公開(kāi)了一類(lèi)化合物。其中所公開(kāi)的化合物為具有與咯利普蘭結(jié)構(gòu)類(lèi)似的取代吡咯烷。一種具有結(jié)構(gòu)式(I)的具體化合物對(duì)人重組PDE4的IC50為約2nM。由于觀察到催吐副作用與效果明顯分離，所以這些化合物沒(méi)有降低不需要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用。 此外，有幾家公司正在對(duì)其它PDE4抑制劑進(jìn)行臨床試驗(yàn)。然而，效果和毒副作用方面的問(wèn)題例如嘔吐和中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂仍未解決。
因此，選擇性抑制PDE4并降低或消除與在先的PDE4抑制劑有關(guān)的不利的中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用的化合物可用于治療變應(yīng)性疾病和炎性疾病以及其它與細(xì)胞因子例如TNF過(guò)度或非調(diào)節(jié)性產(chǎn)生有關(guān)的疾病。此外，選擇性PDE4抑制劑可用于治療與在具體靶組織中cAMP水平增高或PDE4功能增強(qiáng)有關(guān)的疾病。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及可用于治療其中抑制PDE4活性是非常有益的疾病和病癥的有效的選擇性PDE4抑制劑。本發(fā)明的PDE4抑制劑出人意料地降低或消除與在先的PDE4抑制劑有關(guān)的不利的中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用。
本發(fā)明尤其涉及具有結(jié)構(gòu)式(II)化合物
其中Y為OR5或NR5R6；R1為低級(jí)烷基、橋連烷基(例如降冰片基)、芳烷基(例如茚滿基)、環(huán)烷基、5-或6-元飽和雜環(huán)基(例如3-四氫呋喃基)、C1-3亞烷基環(huán)烷基(例如環(huán)戊基甲基)、芳基-或雜芳基-取代的炔丙基(例如-CH2C≡C-C6H5)、芳基-或雜芳基-取代的烯丙基(例如-CH2CH＝CH-C6H5)或鹵代環(huán)烷基(例如氟代環(huán)戊基)；R2為氫、甲基或鹵基取代的甲基，例如CHF2；R3為C(＝O)OR7、C(＝O)R7、C(＝NH)NR8R9、C(＝O)NR8R9、芳基或雜芳基；R4為氫、低級(jí)烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基或芳基；R5和R6獨(dú)立地為氫、低級(jí)烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基或烷芳基，或者R5和R6一起形成5-元環(huán)或6-元環(huán)；R7為支鏈或直鏈低級(jí)烷基或芳基，或者R7可以任選用一個(gè)或多個(gè)OR8、NR8R9或SR8取代；R8和R9相同或不同，它們選自氫、低級(jí)烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和芳烷基，或者R8和R9一起形成4-元環(huán)至7-元環(huán)；R10為氫、烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、芳基、C(＝O)烷基、C(＝O)環(huán)烷基、C(＝O)芳基、C(＝O)O烷基、C(＝O)O環(huán)烷基、C(＝O)芳基、CH2OH、CH2O烷基、CHO、CN、NO2或SO2R11；和R11為烷基、環(huán)烷基、三氟甲基、芳基、芳烷基或NR8R9。
本發(fā)明也涉及含有一種或多種結(jié)構(gòu)式(II)化合物的藥用組合物、所述化合物和含所述化合物的組合物在治療疾病中的用途以及化合物和參與合成結(jié)構(gòu)式(II)化合物的中間體的制備方法。
本發(fā)明也涉及通過(guò)給予哺乳動(dòng)物治療有效量的結(jié)構(gòu)式(II)化合物或含有結(jié)構(gòu)式(II)化合物的組合物，從而治療所述哺乳動(dòng)物病癥的方法，其中所述哺乳動(dòng)物患有的病癥如果抑制PDE4，可有益地調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的cAMP水平、降低哺乳動(dòng)物體內(nèi)的TNFα水平、抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)的炎性細(xì)胞激活和抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)的PDE4功能。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述本發(fā)明涉及具有結(jié)構(gòu)式(II)化合物 其中，Y為OR5或NR5R6；R1為低級(jí)烷基、橋連烷基(例如降冰片基)、芳烷基(例如茚滿基)、環(huán)烷基、5-或6-元飽和雜環(huán)基(例如3-四氫呋喃基)、C1-3亞烷基環(huán)烷基(例如環(huán)戊基甲基)、芳基-或雜芳基-取代的炔丙基(例如-CH2C≡C-C6H5)、芳基-或雜芳基-取代的烯丙基(例如-CH2CH＝CH-C6H5)或鹵代環(huán)烷基(例如氟代環(huán)戊基)；R2為氫、甲基或鹵基取代的甲基，例如CHF2；R3為C(＝O)OR7、C(＝O)R7、C(＝NH)NR8R9、C(＝O)NR8R9、芳基或雜芳基；R4為氫、低級(jí)烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基或芳基；R5和R6獨(dú)立地為氫、低級(jí)烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基或烷芳基，或者R5和R6一起形成5-元環(huán)或6-元環(huán)；R7為支鏈或直鏈低級(jí)烷基或芳基，或者R7可以任選用一個(gè)或多個(gè)OR8、NR8R9或SR8取代；和R8和R9相同或不同，它們選自氫、低級(jí)烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和芳烷基，或者R8和R9一起形成4-元環(huán)至7-元環(huán)；R10為氫、烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、芳基、C(＝O)烷基、C(＝O)環(huán)烷基、C(＝O)芳基、C(＝O)O烷基、C(＝O)O環(huán)烷基、C(＝O)芳基、CH2OH、CH2O烷基、CHO、CN、NO2或SO2R11；和
R11為烷基、環(huán)烷基、三氟甲基、芳基、芳烷基或NR8R9。
本文單獨(dú)或者結(jié)合使用的術(shù)語(yǔ)“烷基”，定義為包括含1-16個(gè)碳原子的直鏈和支鏈飽和烴基。術(shù)語(yǔ)“低級(jí)烷基”本文定義為具有1-6個(gè)碳原子(C1-C6)的烷基。低級(jí)烷基的實(shí)例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、異丁基、正丁基、新戊基、正己基等。術(shù)語(yǔ)“炔基”是指含有碳-碳三鍵的不飽和烷基。
術(shù)語(yǔ)“橋連烷基”本文定義為C6-C16的雙環(huán)或多環(huán)烴基，例如降冰片基、金剛烷基、雙環(huán)[2.2.2]辛基、雙環(huán)[2.2.1]庚基、雙環(huán)[3.2.1]辛基或十氫萘基。
術(shù)語(yǔ)“環(huán)烷基”本文定義為包括C3-C7環(huán)烴基。環(huán)烷基的實(shí)例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)己基和環(huán)戊基。
術(shù)語(yǔ)“亞烷基”是指具有一個(gè)取代基的烷基。例如術(shù)語(yǔ)“C1-3亞烷基環(huán)烷基”是指含有1-3個(gè)碳原子并用一個(gè)環(huán)烷基取代的烷基。
術(shù)語(yǔ)“鹵代烷基”本文定義為用一個(gè)或多個(gè)鹵代取代基例如氟代基、氯代基、溴代基、碘代基或者其組合取代的烷基。同樣，“鹵代環(huán)烷基”定義為具有一個(gè)或多個(gè)鹵代取代基的環(huán)烷基。
單獨(dú)或結(jié)合使用的術(shù)語(yǔ)“芳基”，本文定義為單環(huán)或多環(huán)的芳族基團(tuán)，優(yōu)選單環(huán)或雙環(huán)的芳族基團(tuán)，例如苯基或萘基，它們可以為未取代或者取代芳族基團(tuán)，例如被一個(gè)或多個(gè)、尤其是一個(gè)至三個(gè)選自以下的取代基取代鹵代基、烷基、羥基、羥基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、鹵代烷基、硝基、氨基、烷基氨基、?；被?、烷硫基、烷基亞磺?；屯榛酋；?。示例性的芳基包括苯基、萘基、四氫萘基、2-氯代苯基、3-氯代苯基、4-氯代苯基、2-甲基苯基、4-甲氧基苯基、3-三氟甲基苯基、4-硝基苯基等。
術(shù)語(yǔ)“雜芳基”本文定義為含有一個(gè)或兩個(gè)芳族環(huán)并且在芳環(huán)上含有至少一個(gè)氮原子、氧原子或硫原子的單環(huán)或雙環(huán)系，所述環(huán)系可以為未取代或者取代環(huán)系，例如被一個(gè)或多個(gè)、尤其是1-3個(gè)如下的取代基取代鹵代基、烷基、羥基、羥基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、鹵代烷基、硝基、氨基、烷基氨基、?；被?、烷硫基、烷基亞磺酰基和烷基磺?；?。雜芳基的實(shí)例包括噻吩基、呋喃基、吡啶基、噁唑基、喹啉基、異喹啉基、吲哚基、三唑基、異噻唑基、異噁唑基、咪唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基。
術(shù)語(yǔ)“芳烷基”本文定義為這樣的在先定義的烷基其中所述烷基的一個(gè)氫原子被本文定義的芳基取代，例如任選具有一個(gè)或多個(gè)取代基(例如鹵代基、烷基、烷氧基等)的苯基。芳烷基的實(shí)例是芐基。
術(shù)語(yǔ)“烷芳基”本文定義為這樣的在先定義的芳基其中所述芳基的一個(gè)氫原子被烷基、環(huán)烷基、鹵代烷基或鹵代環(huán)烷基取代。
術(shù)語(yǔ)“雜芳烷基”和“雜烷芳基”的定義類(lèi)似術(shù)語(yǔ)“芳烷基”和“烷芳基”，然而，所述芳基被在先定義的雜芳基取代。
術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基”定義為環(huán)中含有一個(gè)或多個(gè)雜原子的5-或6-元非芳族環(huán)，所述雜原子選自氧原子、氮原子和硫原子。非限制性實(shí)例包括四氫呋喃、哌啶、哌嗪、環(huán)丁砜、嗎啉、四氫吡喃、二氧六環(huán)等。
術(shù)語(yǔ)“鹵素”或“鹵代基”本文定義為包括氟、氯、溴和碘。
術(shù)語(yǔ)“烷氧基”定義為-OR，其中R為烷基。
術(shù)語(yǔ)“烷氧基烷基”定義為連接烷基的烷氧基。術(shù)語(yǔ)“芳氧基烷基”和“芳烷氧基烷基”類(lèi)似地定義為連接烷基的芳氧基或芳烷氧基。
術(shù)語(yǔ)“羥基”定義為-OH。
術(shù)語(yǔ)“羥基烷基”定義為連接烷基的羥基。
術(shù)語(yǔ)“氨基”定義為-NH2。
術(shù)語(yǔ)“烷基氨基”定義為-NR2，其中至少一個(gè)R為烷基，第二個(gè)R為烷基或氫。
術(shù)語(yǔ)“?；被倍x為RC(＝O)N，其中R為烷基或芳基。
術(shù)語(yǔ)“硝基”定義為-NO2。
術(shù)語(yǔ)“烷硫基”定義為-SR，其中R為烷基。
術(shù)語(yǔ)“烷基亞磺?；倍x為R-SO2，其中R為烷基。
術(shù)語(yǔ)“烷基磺酰基”定義為R-SO3，其中R為烷基。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R7為甲基，R2為甲基或二氟甲基，R4選自氫、甲基、三氟甲基、環(huán)丙基、乙酰基、乙炔基、芐基和苯基，R5和R6選自氫和甲基。R1選自
R3選自 和
在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，R1選自環(huán)戊基、四氫呋喃基、茚滿基、降冰片基、苯乙基和苯基丁基；R2選自甲基和二氟甲基；R3選自CO2CH3、C(＝O)CH2OH、C(＝O)CH(CH3)OH、C(＝O)C(CH3)2OH和 R4為氫或甲基；R5和R6獨(dú)立地為氫或甲基，或者R5和R6一起形成5-元環(huán)或6-元環(huán)；R10為氫。
本發(fā)明包括結(jié)構(gòu)式(II)化合物的所有可能的立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體，并且不僅包括外消旋化合物而且也包括旋光異構(gòu)體。當(dāng)需要結(jié)構(gòu)式(II)化合物的單一對(duì)映體時(shí)，通過(guò)拆分終產(chǎn)物或者通過(guò)由異構(gòu)體純的原料或者使用手性輔助劑立體有擇合成可以得到單一對(duì)映體(例如參見(jiàn)Z.Ma等，TetrahedronAsymmetry，8(6)，第883-888頁(yè)(1997))。終產(chǎn)物、中間體或者原料的拆分可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適的方法完成。此外，在其中結(jié)構(gòu)式(II)化合物的互變異構(gòu)體可能存在的情況下，本發(fā)明包括所述化合物的所有互變異構(gòu)形式。如此后所證明的，特定的立體異構(gòu)體顯示抑制PDE4的優(yōu)越能力，而沒(méi)有通常與PDE4抑制劑有關(guān)的不利中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用。
具體來(lái)說(shuō)，普遍認(rèn)為生物系統(tǒng)對(duì)于絕對(duì)立體化學(xué)性化合物具有非常敏感的活性。(參見(jiàn)E.J.Ariens，Medicinal Research Reviews，6451-466(1986)；E.J.Ariens，Medicinal Research Reviews，7367-387(1987)；K.M.Fowler，Handbook of StereoisomersTherapeutic Drugs，CRC Press，Donald P.Smith主編，第35-63頁(yè)(1989)；S.C.Stinson，Chemical and Engineering News，7538-70(1997))。
例如，咯利普蘭為含有一個(gè)手性中心的立體有擇PDE4抑制劑?？├仗m的(-)-對(duì)映體比其(+)-對(duì)映體在涉及其潛在的抗抑郁作用方面具有更強(qiáng)的藥理學(xué)作用。Schultz等，Naunyn-Schmiedeberg’s ArchPharmacol，33323-30(1986)。此外，咯利普蘭的代謝作用似乎是立體特異性的，(+)-對(duì)映體顯示比(-)-對(duì)映體更快的清除率。Krause等，Xenobiotica，18561-571(1988)。最后，最新的觀察顯示，咯利普蘭的(-)-對(duì)映體(R-咯利普蘭)比其(+)-對(duì)映體(S-咯利普蘭)的催吐作用強(qiáng)大約十倍。A.Robichaud等，Neuropharmacology，38289-297(1999)。這個(gè)觀察結(jié)果與試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)咯利普蘭異構(gòu)體的處理和咯利普蘭抑制PDE4酶的能力方面的差異非常不一致。本發(fā)明化合物可以具有三個(gè)手性中心。如下所示，特定立體化學(xué)取向的化合物能夠顯示類(lèi)似的PDE4抑制活性和藥理學(xué)活性，但是改變了中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性和催吐潛能。
因此，本發(fā)明的優(yōu)選的化合物具有結(jié)構(gòu)式(III) 結(jié)構(gòu)式(III)化合物為有效的選擇性PDE4抑制劑并且沒(méi)有結(jié)構(gòu)式(III)化合物的立體異構(gòu)體所顯示的不利的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用和催吐潛能。
含有酸性部分的結(jié)構(gòu)式(II)化合物可以與合適的陽(yáng)離子形成藥學(xué)上可接受的鹽。合適的藥學(xué)上可接受的陽(yáng)離子包括堿金屬(例如鈉或鉀)和堿土金屬(例如鈣或鎂)陽(yáng)離子。含有堿性中心的結(jié)構(gòu)式(II)化合物的藥學(xué)上可接受的鹽為與藥學(xué)上可接受的酸形成的酸加成鹽。實(shí)例包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽或硫酸氫鹽、磷酸鹽或磷酸氫鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、葡糖酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽和對(duì)甲苯磺酸鹽。根據(jù)前文所述，任何本文中提到的本發(fā)明化合物包括結(jié)構(gòu)式(II)化合物以及其藥學(xué)上可接受的鹽和溶劑合物。
本發(fā)明的化合物可以以純化學(xué)品治療性給藥，但是優(yōu)選以藥用組合物或制劑給予結(jié)構(gòu)式(II)化合物。因此，本發(fā)明還提供含有結(jié)構(gòu)式(II)化合物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體并任選其它治療和/或預(yù)防成分的藥用制劑。所述載體在與所述制劑中的其它成分相容并且對(duì)其接受者無(wú)害的意義上為“可接受的”。
具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的選擇性PDE4抑制劑可以單獨(dú)使用或與第二種抗炎治療藥物組合使用，例如所述第二種抗炎藥物為靶向TNFα的治療藥物，如用于治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的ENBREL或REMICADE。同樣，IL-1拮抗作用的治療用途在類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型中也已經(jīng)得到證明。因此，設(shè)想IL-1的拮抗作用與減弱TNFα的PDE4抑制作用結(jié)合將是有效的。
本發(fā)明的PDE4抑制劑可用于治療各種變應(yīng)性疾病、自身免疫病和炎性疾病。
術(shù)語(yǔ)“治療”包括預(yù)防、緩解、阻止或逆轉(zhuǎn)所治療疾病或癥狀發(fā)展進(jìn)程。因此術(shù)語(yǔ)“治療”包括適當(dāng)?shù)尼t(yī)學(xué)治療和/或預(yù)防給藥。
具體來(lái)說(shuō)，炎癥是一種局限化保護(hù)性反應(yīng)，它是由組織損傷或破壞引起的，它可以破壞、稀釋或隔絕(即隔離)損傷因子和受損的組織。本文所用的術(shù)語(yǔ)“炎性疾病”，是指任何其中過(guò)量或非調(diào)節(jié)性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致過(guò)度炎性癥狀、宿主組織損傷或組織功能喪失的疾病。此外，本文所用的術(shù)語(yǔ)“自身免疫病”是指任何種類(lèi)的其中組織損傷與對(duì)于身體自身成分的體液或細(xì)胞介導(dǎo)應(yīng)答有關(guān)的疾病。本文所用的術(shù)語(yǔ)“變應(yīng)性疾病”是指由變態(tài)反應(yīng)引起的任何癥狀、組織損傷或組織功能喪失。本文所用的術(shù)語(yǔ)“關(guān)節(jié)疾病”是指特征在于各種病因引起的關(guān)節(jié)炎性損傷的一大類(lèi)任何疾病。本文所用的術(shù)語(yǔ)“皮炎”是指特征在于各種病因引起的皮膚炎癥的一大類(lèi)任何皮膚疾病。本文所用的術(shù)語(yǔ)“移植排斥”是指特征在于移植組織和周?chē)M織功能喪失、疼痛、腫脹、白細(xì)胞增多和血小板減少的直接針對(duì)移植組織(包括器官和細(xì)胞(例如骨髓))的任何免疫反應(yīng)。
本發(fā)明也提供調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物體內(nèi)cAMP水平的方法以及治療特征為細(xì)胞因子水平升高的疾病的方法。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞因子”是指任何分泌型多肽，該多肽影響其它細(xì)胞的功能并調(diào)節(jié)所述免疫或炎癥反應(yīng)中細(xì)胞之間的相互作用。細(xì)胞因子包括但不限于單核因子、淋巴因子和趨化因子，而不管是哪些細(xì)胞產(chǎn)生的。例如，單核因子通常指由單核細(xì)胞產(chǎn)生并分泌的因子，然而，許多其它細(xì)胞也產(chǎn)生單核因子，例如天然殺傷細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腦星形膠質(zhì)細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、表皮角質(zhì)細(xì)胞和B-淋巴細(xì)胞。淋巴因子通常指由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的因子。細(xì)胞因子的實(shí)例包括但不限于白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNFα)和腫瘤壞死因子β(TNFβ)。
本發(fā)明還提供降低哺乳動(dòng)物體內(nèi)TNF水平的方法，該方法包括給予所述哺乳動(dòng)物有效量的結(jié)構(gòu)式(II)化合物。本文所用的術(shù)語(yǔ)“降低TNF水平”是指以下情況之一a)通過(guò)抑制所有細(xì)胞(包括但不限于單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)體內(nèi)釋放TNF，使哺乳動(dòng)物體內(nèi)過(guò)量的TNF水平降低至正常水平或者正常水平以下；或b)在翻譯或轉(zhuǎn)錄水平上誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物體內(nèi)過(guò)量的TNF水平下調(diào)至正常水平或者正常水平以下；或c)通過(guò)抑制作為翻譯后事件的直接合成TNF誘導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)。
此外，本發(fā)明化合物可用于抑制炎性細(xì)胞激活。本文所用的術(shù)語(yǔ)“炎性細(xì)胞激活”是指刺激(包括但不限于細(xì)胞因子、抗原或自身抗體)誘導(dǎo)的增殖性細(xì)胞反應(yīng)，產(chǎn)生可溶性介質(zhì)(包括但不限于細(xì)胞因子、氧自由基、酶、前列腺素類(lèi)或血管活性胺)或者炎性細(xì)胞(包括但不限于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、粒性白細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)細(xì)胞表面表達(dá)新的或數(shù)量增加的介質(zhì)(包括但不限于主要組織相容性抗原或細(xì)胞粘著分子)。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，這些細(xì)胞表型中的一種或其組合的激活可引起炎癥的發(fā)生、持續(xù)或惡化。
本發(fā)明化合物也可用于引起氣道平滑肌松弛、支氣管擴(kuò)張和防止支氣管收縮。
因此，本發(fā)明化合物可用于治療以下疾病例如關(guān)節(jié)疾病(如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、脊椎炎、甲狀腺相關(guān)性眼病、貝切特氏病、膿毒病、敗血癥性休克、內(nèi)毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒病、革蘭氏陽(yáng)性膿毒病、中毒性休克綜合征、哮喘、慢性支氣管炎、過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎、春季結(jié)膜炎、嗜曙紅細(xì)胞肉芽腫、成人(急性)呼吸窘迫綜合征(ARDS)、慢性肺部炎性疾病(例如慢性阻塞性肺炎)、硅肺、肺結(jié)節(jié)病、心肌、腦或肢端再灌注損傷、由于輕度外傷引起的腦或脊髓損傷、包括囊性纖維變性的纖維變性、瘢痕疙瘩形成、疤痕組織形成、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和移植排斥病(例如移植物抗宿主(GvH)反應(yīng)和同種異體移植排斥)、慢性腎小球腎炎、炎性腸病例如節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎、增生性淋巴細(xì)胞疾病如白血病(例如慢性淋巴細(xì)胞白血?。籆LL)(參見(jiàn)Mentz等，Blood 88，第2172-2182(1996))以及炎性皮膚病例如特應(yīng)性皮炎、牛皮癬或蕁麻疹。
這類(lèi)疾病或有關(guān)病癥的其它實(shí)例包括心肌病例如充血性心力衰竭、發(fā)熱、惡病質(zhì)、感染或惡性腫瘤繼發(fā)性惡病質(zhì)、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)繼發(fā)性惡病質(zhì)、ARC(AIDS相關(guān)綜合征)、腦型瘧、骨質(zhì)疏松和骨吸收疾病以及由于感染引起的發(fā)燒和肌痛。此外本發(fā)明化合物可用于治療尿崩癥和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如抑郁癥和多發(fā)梗塞性癡呆。
本發(fā)明化合物也具有通常稱(chēng)作治療藥物以外的用途。例如，本發(fā)明化合物也可以用作器官移植的保存劑(參見(jiàn)Pinsky等，J.Clin.Invest.，92，第2994-3002頁(yè)(1993))。
選擇性PDE4抑制劑也可以用于治療勃起機(jī)能障礙、尤其是血管原性陽(yáng)萎(Doherty，Jr.等，美國(guó)專(zhuān)利第6,127,363號(hào))、尿崩癥(KidneyInt.，37，第362頁(yè)，(1990)；Kidney Int.，35，第494頁(yè)，(1989))和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如多發(fā)梗塞性癡呆(Nicholson，Psychopharmacology，101，第147頁(yè)(1990))、抑郁癥(Eckman等，Curr.Ther.Res.，43，第291頁(yè)(1988))、焦慮癥和應(yīng)激反應(yīng)(Neuropharmacology，38，第1831頁(yè)(1991))、腦缺血(Eur.J.Pharmacol.，272，第107頁(yè)(1995))、遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙(J.Clin.Pharmacol.，16，第304頁(yè)(1976))、帕金森氏病(參見(jiàn)Neurology，25，第722頁(yè)(1975)；Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.，26，第421頁(yè)(1999))和經(jīng)前綜合征。對(duì)于抑郁癥而言，PDE4選擇性抑制劑在各種抑郁癥的動(dòng)物模型例如“行為絕望”或Porsolt試驗(yàn)(Eur.J.Pharmacol.，47，第379頁(yè)(1978)；Eur.J.Pharmacol.，57，第431頁(yè)(1979)；Antidepressantsneurochemical，behavioral and clinicalprospectives，Enna，Malick，and Richelson，eds.，Raven Press，第121頁(yè)(1981))和“尾懸浮試驗(yàn)”(Psychopharmacology，85，第367頁(yè)(1985))中顯示有效。最新的研究成果顯示，各種抗抑郁藥長(zhǎng)期體內(nèi)治療增加PDE4的腦性表達(dá)(J.Neuroscience，19，第610頁(yè)(1999))。因此，治療中選擇性PDE4抑制劑可以單獨(dú)使用或者與第二種治療方法聯(lián)合使用，四種主要抗抑郁治療為電驚厥方法、單胺氧化酶抑制劑和5-羥色胺或去甲腎上腺素的選擇性重?cái)z取抑制劑。選擇性PDE4抑制劑也可以用于借助直接作用于支氣管平滑肌細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)支氣管擴(kuò)張活動(dòng)，從而用于治療哮喘。
適用于本發(fā)明中的化合物和藥用組合物包括其中以有效量給予哺乳動(dòng)物所述有效成分以便達(dá)到其預(yù)定治療目的的化合物和藥用組合物。更準(zhǔn)確地說(shuō)，“治療有效量”是指有效防止所治療患者已有癥狀發(fā)展或者緩解該癥狀的劑量。特別是參照本發(fā)明所公開(kāi)的細(xì)節(jié)，有效劑量的確定完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”包括雄性和雌性，并且包括人、家養(yǎng)動(dòng)物(例如貓、狗)、家畜(例如牛、馬、豬)和野生生物(例如靈長(zhǎng)類(lèi)、大型貓科動(dòng)物、動(dòng)物園動(dòng)物)。
“治療有效劑量”是指達(dá)到所需作用的所述化合物量。這類(lèi)化合物的毒性和治療效果可以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)或者實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法測(cè)定，例如測(cè)定LD50(50％群體致死的劑量)和ED50(50％群體有效治療的劑量)。毒性和治療效果之間的劑量比率為治療指數(shù)，它表示為L(zhǎng)D50和ED50的比值。優(yōu)選高治療指數(shù)的化合物。由這類(lèi)數(shù)據(jù)得出的資料可以用于計(jì)算用于人的劑量范圍。這類(lèi)化合物的劑量?jī)?yōu)選在包括幾乎沒(méi)有或者沒(méi)有毒性的ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。根據(jù)所使用的劑型和所用的給藥途徑，所述劑量可以在該范圍內(nèi)變化。
每個(gè)醫(yī)生可以根據(jù)患者的病情選擇準(zhǔn)確的制劑、給藥途徑和劑量?？梢詡€(gè)別調(diào)整劑量和間隔時(shí)間以便提供足以維持治療效果的活性部分的血漿濃度。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，本文所述的治療可以延伸為預(yù)防以及治療確診的疾病或者癥狀。進(jìn)而還知道，所需用于治療的本發(fā)明化合物劑量根據(jù)所治療病癥的性質(zhì)、患者的年齡和狀況而變化，并且最終由主治醫(yī)生或獸醫(yī)決定。然而，一般來(lái)說(shuō)用于成人治療的常用劑量在每日0.001mg/kg至約100mg/kg的范圍內(nèi)。所需劑量可以方便地以單一劑量給予或以合適的間隔時(shí)間，以多劑量給予，例如每日兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)亞劑量給予。在實(shí)踐中，醫(yī)生決定最適合于每個(gè)患者的實(shí)際給藥方案，所述劑量根據(jù)具體患者的年齡、體重和反應(yīng)而改變。以上劑量為一般情況下的典型實(shí)例，個(gè)別情況可能需要較高或較低的劑量，這也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的制劑可以以標(biāo)準(zhǔn)方式給藥，以用于治療所指定疾病，例如口服、胃腸外、粘膜(例如舌下或者口腔含化給藥)、局部、經(jīng)皮、直腸、通過(guò)吸入(例如鼻或者肺深部吸入)。胃腸外給藥包括但不限于靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、鞘內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi)。胃腸外給藥也可以使用高壓技術(shù)象POWDERJECTTM完成。
對(duì)于口腔含化給藥而言，所述組合物可以是以常規(guī)方式配制的片劑或者錠劑形式。例如，用于口服的片劑和膠囊劑可以含有常規(guī)的賦形劑例如粘合劑(例如糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨糖醇、西黃蓍膠、淀粉漿或者聚乙烯吡咯烷酮)、填充劑(例如乳糖、蔗糖、微晶纖維素、纖維素、玉米淀粉、磷酸鈣或者山梨糖醇)、潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石粉、聚乙二醇或者二氧化硅)、崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或者羥基乙酸淀粉鈉)或者潤(rùn)濕劑(例如月桂基硫酸鈉)。可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法將所述片劑包衣。
或者，本發(fā)明的化合物可以摻入口服液體制劑例如水性或者油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿或者酏劑中。而且，含有這些化合物的制劑可以以干燥產(chǎn)品提供，使用前用水或者其它合適的溶媒配制。這類(lèi)液體制劑可以含有常規(guī)的添加劑，例如懸浮劑，如山梨糖醇糖漿、甲基纖維素、葡萄糖/糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠和氫化食用脂肪；乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨糖醇單油酸酯或者阿拉伯膠；非水性溶媒(可以包括食用油)，例如杏仁油、分級(jí)分離的椰子油、油性酯、丙二醇和乙醇；和防腐劑，例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或者丙酯和山梨酸。
這類(lèi)制劑也可以配制為栓劑，例如含有常規(guī)的栓劑基質(zhì)如可可脂或者其它甘油酯。用于吸入的組合物一般可以以溶液、懸浮液或者乳液的形式提供，它們可以以干粉或者以使用常規(guī)拋射劑(例如二氯二氟甲烷或者三氯氟甲烷)的氣霧劑形式給予。典型的局部和經(jīng)皮制劑含有常規(guī)水性或者非水性介質(zhì)，例如滴眼劑、乳油、軟膏、洗劑和糊劑或者為加藥的膏藥、貼劑或者膜劑形式。
此外，本發(fā)明的組合物可以配制用于經(jīng)注射或者連續(xù)輸注胃腸外給藥。注射劑可以是在油性或者水性溶媒中的懸浮劑、溶液劑或者乳劑形式并且可以含有組方劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，所述有效成分可以是粉末形式，使用前用合適的溶媒(例如無(wú)菌、無(wú)熱原水)配制。
本發(fā)明的組合物也可以配制為儲(chǔ)庫(kù)型制劑。這類(lèi)長(zhǎng)效制劑可以植入給予(例如皮下或肌內(nèi))或者通過(guò)肌內(nèi)注射給予。因此，本發(fā)明的化合物可以用合適的聚合物或者疏水物質(zhì)(例如在可接受的油中的乳劑)、離子交換樹(shù)脂或者微溶衍生物(例如微溶性鹽)配制。
對(duì)于獸用而言，式(II)化合物或其無(wú)毒性鹽根據(jù)常規(guī)獸醫(yī)實(shí)踐以合適的可接受制劑給予。獸醫(yī)可以容易地確定最適合具體動(dòng)物的給藥方案和給藥途徑。
因此，另一方面，本發(fā)明提供含有式(II)化合物及其藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體的藥用組合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供制備含有式(II)化合物的藥用組合物的方法，該方法包括將式(II)化合物與其藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體混合。
以下提供結(jié)構(gòu)式(II)化合物的具體非限制性實(shí)施例，其合成根據(jù)以下給出的方法進(jìn)行。
一般而言，結(jié)構(gòu)式(II)化合物可以根據(jù)以下合成方案制備。在下述方案中，本領(lǐng)域內(nèi)知道，當(dāng)需要時(shí)根據(jù)合成化學(xué)的一般原理可以使用保護(hù)基。這些保護(hù)基在合成的最終步驟中可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的堿性、酸性或者氫解條件下去除。通過(guò)對(duì)任何化學(xué)官能團(tuán)使用合適的處理和保護(hù)，未在本文中專(zhuān)門(mén)提到的結(jié)構(gòu)式(II)化合物的合成可以通過(guò)與以下給出的方案的類(lèi)似方法完成。
除非另有說(shuō)明，所有的原料均得自商業(yè)供應(yīng)商，并且無(wú)需進(jìn)一步純化就可使用。所有反應(yīng)物和層析流分通過(guò)在250mm硅膠板上的薄層層析分析，用UV(紫外)光或者I2(碘)染色顯現(xiàn)。產(chǎn)物和中間體經(jīng)快速層析或者反相HPLC純化。
如以下所提出的合成方案可以制備通用結(jié)構(gòu)式(II)化合物。其它的合成途徑對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是已知的。以下反應(yīng)方案提供結(jié)構(gòu)式(II)化合物，其中R1和R2即C2H5和環(huán)戊基由原料所決定。適當(dāng)選擇其它原料或者對(duì)中間體和實(shí)例進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)可提供具有其它所述R1-R11取代基的通用結(jié)構(gòu)式(II)的化合物。
以下說(shuō)明結(jié)構(gòu)式(II)的不同中間體和化合物的合成方法。提供下列說(shuō)明性的實(shí)施例，不應(yīng)該解釋為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1(S)-4-(3-環(huán)氧基-4-甲氧基苯基)-3-甲基-3-[1-(甲基亞肼基)乙基]-吡咯烷-1-羧酸甲酯(1a)和(R)-4-(3-環(huán)戊氧基-4-甲氧基苯基)-3-甲基-3-[1-(甲基亞肼基)乙基]-吡咯烷-1-羧酸甲酯(1b)的制備 向(R)-3-乙酰基-4-(3-環(huán)戊氧基-4-甲氧基苯基)-3-甲基-吡咯烷-1-羧酸甲酯(參見(jiàn)Feldman等的美國(guó)專(zhuān)利第5,665,654號(hào)的實(shí)施例12(該專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中))(或(R)-3-乙?；?4-(3-環(huán)戊氧基-4-甲氧基苯基)-3-甲基-吡咯烷-1-羧酸甲酯)(0.133mmol，50mg)的含有催化量的乙酸(20μl)的甲醇(2ml)攪拌溶液中加入甲肼(0.147mmol，7.8μl)。將反應(yīng)物溫和加熱36小時(shí)，然后再加入三份甲肼。所形成的腙經(jīng)HPLC純化。題述產(chǎn)物通過(guò)HNMR加以證實(shí)。1H MR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)6.8(d，1H)；6.68(m，2H)；4.73(bm，1H)；3.91-4.03(m，2H)；3.83(s，3H)；3.75(s，3H)；3.47-3.69(m，2H)；2.98(s，3H)；1.83-1.92(bm，8H)；1.6(bm，2H)；1.0(s，3H)。
實(shí)施例2 向(3S，4R)-3-乙?；?4-(3-環(huán)戊氧基-4-甲氧基苯基)-3-甲基-吡咯烷-1-羧酸甲酯(50mg，0.133mmol)的0.5ml乙醇溶液中加入羥胺鹽酸鹽(103mg，1.5mmol)和0.1ml水。將懸浮液加熱至50℃并攪拌過(guò)夜。然后讓該溶液冷卻至室溫并減壓濃縮。使用50-100％乙腈-水(0.05％TFA)的梯度洗脫液，在C18柱(Luna10μ，C128，250×10mm)上經(jīng)HPLC純化，得到凍干后為白色粉末的產(chǎn)物2(a)(24.4mg，得率47％)。用相同的方法制備實(shí)例2(b)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)6.84-6.76(m，1H，芳族)；6.70-6.59(m，2H，芳族)；4.87-4.57(m，1H)；3.96-3.60(m，3H)；3.83(s，3H，OCH3)；3.75(s，3H，OCH3)；3.59-3.45(m，1H)；340-3.21(m，1H)；1.92(s，3H，CH3)；1.90-1.48(m，8H，環(huán)戊基)；0.96(s，3H，CH3)。中間體13-(茚滿-2-基氧基)-4-甲氧基-苯甲醛的制備 3-羥基-4-甲氧基-苯甲醛(15.2g，100mmol，1當(dāng)量)、2-茚滿醇(12.1g，90mmol，0.9當(dāng)量)和三苯膦(26.2g，100mmol，1當(dāng)量)的無(wú)水THF(300ml)溶液用滴加的偶氮二羧酸二異丙酯(19.6ml，100mmol，1當(dāng)量)處理。將反應(yīng)混合物在回流下攪拌16小時(shí)，然后冷卻，用乙醚(500ml)稀釋。該溶液用水(2×150ml)、1M NaOH(24×125ml)和飽和NaCl(氯化鈉)(2×100ml)洗滌，用CH2Cl2干燥，然后濃縮，得到存放時(shí)會(huì)固化的漿狀物。將該固體懸浮于乙醚(350ml)中并攪拌過(guò)夜，以使所有的厚塊狀物全部崩裂。通過(guò)真空過(guò)濾收集固體，將其用乙醇/水重結(jié)晶(21.4g)。濃縮乙醚濾液，經(jīng)快速層析純化(硅膠，7.5×36cmBiotage KP-Sil柱，用25％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脫)，又得到5g產(chǎn)物。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ9.86(s，1H)，7.49-7.44(m，2H)，7.25-7.16(m，4H)，6.97(d，J＝8.7Hz，1H)，5.29-5.22(m，1H)，3.89(s，1H)，3.45(dd，J＝16.7，6.6Hz，2H)，3.24(dd，J＝16.7，3.6 Hz，2H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ190.9，155.5，147.9，140.4，130.0，126.9，126.8，124.7，112.1，111.0，78.9，56.1，39.7。中間體2(E)-4-[3-(茚滿-2-基氧基)-4-甲氧基苯基]-3-甲基丁-3-烯-2-酮
將中間體1(0.14mol，1當(dāng)量)和2-丁酮(50ml，0.56mol，4當(dāng)量)的無(wú)水THF(50ml)溶液冷卻至-4℃。將氯化氫氣體通入充分?jǐn)嚢璧娜芤簬追昼姡缓蠼o反應(yīng)混合物加蓋，于-4℃貯存16小時(shí)。將混合物傾至充分?jǐn)嚢璧谋滹柡蚇aHCO3(約2L)溶液中。如有必要，用飽和NaHCO3將pH調(diào)至＞7，然后用乙酸乙酯(3×300ml)萃取該混合物。乙酸乙酯層用NaHCO3(2×200ml)、水(2×200ml)和飽和NaCl(2×200ml)洗滌，用CH2Cl2干燥，然后濃縮，得到漿狀物。將該粗品混合物經(jīng)快速層析純化(硅膠，7.5×36cm Biotage KP-Sil柱，用25％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脫)，得到一種固體產(chǎn)物。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.49-7.43(m，2H)，7.26-7.15(m，5H)，6.90(d，J＝8.2Hz，1H)，5.25-5.16(M，1H)，3.85(s，3H)，3.38(dd，J＝16.7，6.5Hz，2H)，3.25(dd，J＝16.7，3.8Hz，2H)，2.45(S，3H)，2.10(d，J＝1.1Hz)。中間體31-{(3SR，4RS)-1-芐基-4-[3-(茚滿-2-基氧基)-4-甲氧基苯基]-3-甲基-吡咯烷-3-基}-乙酮 (外消旋體)將中間體2(50.6mmol，1當(dāng)量)和N-甲氧基甲基-N-芐基-三甲基甲硅烷基甲胺(50.6mmol，1當(dāng)量)的二氯甲烷(85ml)溶液在0℃下用滴加的三氟乙酸(在二氯甲烷中1M，5ml，5.1mmol，0.1當(dāng)量)溶液處理。在相同溫度下攪拌30分鐘后，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌16小時(shí)。將該溶液再用N-甲氧基甲基-N-芐基三甲基甲硅烷基甲胺(25.3mmol，0.5當(dāng)量)處理，在室溫下攪拌1小時(shí)，第三次用N-甲氧基甲基-N-芐基-三甲基甲硅烷基甲胺(25.3mmol，0.5當(dāng)量)處理。濃縮反應(yīng)混合物，將殘余物溶于乙酸乙酯(500ml)中。該溶液用1N HCl(2×60ml，含有加入的10ml飽和NaCl)、水(250ml)、1M NaOH(250ml)、水(250ml)、飽和NaCl(2×100ml)洗滌，用CH2Cl2干燥，然后真空濃縮。將該殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，7.5×36cm Biotage KP-Sil柱，用5-10％乙醚的二氯甲烷溶液洗脫)，得到所述產(chǎn)物。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.38-7.16(m，9H)，6.88(br s，1H)，6.78(brs，2H)，5.18-5.13(m，1H)，3.82-3.73(m，2H)，3.79(s，3H)，3.60(d，J＝13.0Hz，1H)，3.41-3.17(m，4H)，3.14(d，J＝9.7Hz，1H)，3.05(t，J＝8.3Hz，1H)，2.84(t，J＝8.3Hz，1H)，2.44(d，J＝9.7Hz，1H)，2.24(s，3H)，0.86(s，3H)。中間體4反式-(±)-3-乙?；?4-[3-(茚滿-2-基氧基)-4-甲氧基苯基]-3-甲基-吡咯烷-1-羧酸甲酯 外消旋體將中間體3(40.5mmol，1當(dāng)量)的乙腈(150ml)溶液用氯甲酸甲酯(15.6ml，202.5mmol，5當(dāng)量)處理，然后將混合物在回流下攪拌1小時(shí)。濃縮反應(yīng)混合物，將該殘余物經(jīng)快速層析純化(硅膠，7.5×36cmBiotage KP-Sil柱，用50-60％乙酸乙酯的庚烷溶液洗脫)，得到所述產(chǎn)物。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.24-7.16(m，4H)，6.82(d，J＝8.8 Hz，1H)，6.75-6.72(m，2H)，5.18-5.10(m，1H)，3.91(t，J＝11.2Hz，1H)，3.80(s，3H)，3.77-3.65(m，3H)，3.74(s，3H)，3.42-3.16(m，5H)，2.17(d，J＝6.8Hz，3H)，1.04(s，3H)。13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ210.1/209.9，155.3，149.4，146.9/146.8，140.5/140.4，130.5/130.0，126.7，124.7，121.3/121.1，116.1/115.8，111.9，79.2，58.2/57.4，55.9，54.7/54.2，52.6，50.2/50.0，48.5/48.1，39.7，26.6/26.5，17.8。實(shí)施例3 向中間體4(102.4mg，0.24mmol)的0.5ml乙醇溶液中加入羥胺鹽酸鹽(83.8mg，1.2mmol)和0.1ml水。將懸浮液加熱至50℃并攪拌過(guò)夜。然后讓該溶液冷卻至室溫并減壓濃縮。使用50-100％乙腈-水(0.05％TFA)的梯度洗脫液，在C18柱(Luna 10μ，C18，250×10mm)上經(jīng)HPLC純化，得到固體產(chǎn)物(60mg，得率57％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)7.26-7.16(m，4H，芳族)，6.83-6.77(m，1H，芳族)，6.74-6.71(m，2H)，5.14-5.11(m，1H)，3.92-3.64(m，3H)，3.80(s，3H，OCH3)，3.74(s，3H，OCH3)，3.58-3.48(m，1H)，3.38-3.16(m，5H)，1.92(s，3H，CH3)，0.96(s，3H，CH3)。
測(cè)試了結(jié)構(gòu)式(II)化合物抑制PDE4的能力。一種化合物抑制PDE4活性的能力與該化合物的IC50值即抑制50％酶活性所需的抑制劑濃度有關(guān)。使用重組人PDE4測(cè)定結(jié)構(gòu)式(II)化合物的IC50值。
本發(fā)明化合物一般抑制重組人PDE4的IC50值為低于約50μM，優(yōu)選低于約25μM，更優(yōu)選低于約15μM。本發(fā)明化合物一般抑制重組人PDE4的IC50值為低于約1μM，通常低于約0.05μM。為充分體現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的PDF4抑制劑的IC50為約1nM至約15μM。
由一般使用在濃度范圍0.1pM-500μM的濃度-反應(yīng)曲線，確定所述化合物的IC50值。使用如Loughney等，J. Biol.Chem.，271，第796-806頁(yè)(1996)中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，針對(duì)其它PDE酶的試驗(yàn)也表明本發(fā)明的化合物對(duì)于cAMP特異性PDE4酶具有高度選擇性。
也測(cè)試了結(jié)構(gòu)式(II)化合物降低人外周血淋巴細(xì)胞分泌TNFα的能力。降低分泌TNFα的能力與EC50值(即能夠抑制50％總TNFα的化合物有效濃度)有關(guān)本發(fā)明化合物一般EC50值為低于約50μM，優(yōu)選低于約25μM，更優(yōu)選低于約15μM。本發(fā)明化合物的PBL/TNFαEC50值優(yōu)選為低于約1μM，通常低于約0.05μM。為充分體現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的PDE4抑制劑的EC50為約1nM至約500nM。
通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法可以完成重組人PDE的制備以及IC50和EC50的測(cè)定。典型方法介紹如下人PDE的表達(dá)在桿狀病毒感染的草地貪夜蛾(Spodoptera fugiperda)(Sf9)細(xì)胞中的表達(dá)使用pBlueBacIII(Invitrogen)或者pFastBac(BRL-Gibco)構(gòu)建桿狀病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。通過(guò)跨越所述載體接點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序并且通過(guò)對(duì)經(jīng)PCR產(chǎn)生的所有區(qū)進(jìn)行完全測(cè)序，證實(shí)所有質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。質(zhì)粒pBB-PDE1A3/6在pBlueBacIII中含有PDE1A3的完整可讀框(Loughney等，J.Biol.Chem.，27l，第796-806頁(yè)(1996))。質(zhì)粒Hcam3aBB在pBlueBacIII中含有PDE1C3的完整可讀框(Loughney等(1996))。質(zhì)粒pBB-PDE3A在pBlueBacIII中含有PDE3A的完整可讀框(Meacci等，Proc.Natl.Acad. Sci.，USA，89，第3721-3725頁(yè)(1992))。
按照生產(chǎn)商的方案，使用MaxBac系統(tǒng)(Invitrogen)或者FastBac系統(tǒng)(Gibco-BRL)生產(chǎn)重組病毒原液。在這兩種情況下，重組人PDE在所得病毒中的表達(dá)由病毒多角體啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。當(dāng)使用MaxBac系統(tǒng)時(shí)，為了確保野生型(occ+)病毒不污染制劑，將病毒噬斑純化兩次。如下進(jìn)行蛋白表達(dá)。讓Sf9細(xì)胞在補(bǔ)充如下成分的Grace’s昆蟲(chóng)培養(yǎng)基(Gibco-BRL)中于27℃生長(zhǎng)10％胎牛血清、0.33％ TCyeastolate、0.33％水解乳白蛋白、4.2mM碳酸氫鈉、10μg/ml慶大霉素、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素。以每個(gè)細(xì)胞大約2-3個(gè)病毒顆粒的感染復(fù)數(shù)感染指數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，然后孵育48小時(shí)。通過(guò)離心收集細(xì)胞，用無(wú)補(bǔ)充組分的Grace’s培養(yǎng)基洗滌并且快速冷凍保存。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(酵母)中的表達(dá)人PDE1B、PDE2、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE5和PDE7的重組產(chǎn)生類(lèi)似于美國(guó)專(zhuān)利第5,702,936號(hào)的實(shí)施例7中所述進(jìn)行(該專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中)，只是使用酵母轉(zhuǎn)化載體，該酵母轉(zhuǎn)化載體衍生自Price等，Methods in Enzymology，185，第308-318頁(yè)(1990)介紹的基礎(chǔ)ADH2質(zhì)粒，該質(zhì)粒中加入酵母ADH2啟動(dòng)子和終止子序列，所述釀酒酵母宿主為蛋白酶缺陷型菌株BJ2-54，BJ2-54于1998年8月31日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Manassas，Virginia)，保藏號(hào)為ATCC 74465。使轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞在2x SC-leu培養(yǎng)基(pH6.2，含有微量金屬和維生素)中生長(zhǎng)。24小時(shí)后，加入含有甘油的YEP培養(yǎng)基至終濃度為2x YET/3％甘油。約24小時(shí)后，收獲細(xì)胞，洗滌并且于-70℃保存。人磷酸二酯酶制劑磷酸二酯酶活性的測(cè)定如下測(cè)定所述制劑的磷酸二酯酶活性。利用活性炭分離技術(shù)的PDE測(cè)定基本如Loughney等(1996)所述進(jìn)行。在該測(cè)定中，PDE活性將[32P]cAMP或者[32P]cGMP轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的[32P]5’-AMP或者[32P]5’-GMP與存在的PDE活性量成正比。然后，在蛇毒5’-核苷酸酶的作用下，[32P]5’-AMP或者[32P]5’-GMP被定量轉(zhuǎn)化為游離的[32P]磷酸和未標(biāo)記的腺苷或鳥(niǎo)苷。因此，釋放的[32P]磷酸的量與酶活性成正比。該測(cè)定在100μl含有(終濃度)以下組分的反應(yīng)混合物中于30℃下進(jìn)行40mM Tris HCl(pH8.0)、1μM硫酸鋅、5mM氯化鎂和0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)。或者，在評(píng)估PDE1比活的測(cè)定中，孵育混合物還包括使用0.1mM氯化鈣和10μg/ml鈣調(diào)蛋白。PDE酶以產(chǎn)率＜30％總底物水解的量存在(線性測(cè)試條件)。通過(guò)加入底物(1mM[32P]cAMP或cGMP)，并將該混合物孵育12分鐘，開(kāi)始所述測(cè)試。然后加入75μg大響尾蛇(Crotalus atrox)毒液，繼續(xù)孵育3分鐘(總共15分鐘)。通過(guò)加入200μl活性炭(在0.1 M磷酸二氫鈉pH4中的25mg/ml懸浮液)終止反應(yīng)。離心(750Xg，3分鐘)沉淀所述活性炭后，取出上清液樣品，在閃爍計(jì)數(shù)器中測(cè)定放射性，然后計(jì)算PDE活性。
類(lèi)似于Loughney等，J. Biol.Chem.，271，第796-806頁(yè)(1996)所述的方法進(jìn)行抑制劑的分析，只是同時(shí)使用cGMP和cAMP，底物濃度保持在低于32nM，該值遠(yuǎn)低于被測(cè)PDE的Km。人PDE4A、4B、4C、4D制劑用釀酒酵母制備PDE4A通過(guò)與50ml裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.5，10μM硫酸鋅，2mM氯化鎂，14.2mM2-巰基乙醇，各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽，各20μg/ml的鈣蛋白酶抑制劑I和II和2mM苯甲脒鹽酸鹽)混合，在室溫下，解凍酵母細(xì)胞(50g帶有HDUN1.46的酵母菌株YI26)。將細(xì)胞在弗氏(French)壓碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments)中于10℃裂解。用Beckman JA-10轉(zhuǎn)子，將所述提取物于4℃以9,000rpm離心22分鐘。取出上清液，用BeckmanTI45轉(zhuǎn)子，于4℃以36,000rpm離心45分鐘。
通過(guò)加入固體硫酸銨(0.26g/ml上清液)，同時(shí)在冰浴中攪拌并且維持pH在7.0-7.5之間，從高速上清液沉淀PDE4A。通過(guò)用BeckmanJA-10轉(zhuǎn)子以9,000rpm離心22分鐘，收集含有PDE4A的沉淀蛋白。將所述沉淀物重懸于50ml緩沖液G(50mM MOPS pH7.5，10μM硫酸鋅，5mM氯化鎂，100mM氯化鈉，14.2mM 2-巰基乙醇，2mM苯甲脒鹽酸鹽，各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽，以及各20μg/ml的鈣蛋白酶抑制劑I和II)中，然后通過(guò)0.45μm濾膜。
將所述重懸浮樣品(50-100ml)上樣到在緩沖液G中平衡的5×100cm Pharmacia SEPHACRYLS-300柱中。以流速2ml/min洗脫酶活性并將其合并，以供稍后的分級(jí)分離用。
將經(jīng)凝膠過(guò)濾層析分離的PDE4A上樣到在緩沖液A(50mMMOPS pH7.5，10μM硫酸鋅，5mM氯化鎂，14.2mM2-巰基乙醇和100mM苯甲脒鹽酸鹽)中平衡的1.6×20cm Sigma Cibacron BlueAgarose-300型柱(10ml)中。依次用50-100ml緩沖液A、20-30ml含有20mM 5’-AMP的緩沖液A、50-100ml含有1.5M氯化鈉的緩沖液A和10-20ml緩沖液C(50mM Tris HCl pH8，10μM硫酸鋅、14.2mM2-巰基乙醇和2mM苯甲脒鹽酸鹽)洗滌所述柱子。用20-30ml含有20mM cAMP的緩沖液C洗脫所述酶。
合并PDE活性峰，用硫酸銨(0.33g/ml酶合并液)沉淀，以便去除過(guò)量的環(huán)核苷酸。將沉淀蛋白重懸于緩沖液X(25mM MOPS pH7.5，5μM硫酸鋅，50mM氯化鈉，1mM DTT和1mM苯甲脒鹽酸鹽)中，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，通過(guò)在Pharmacia PD-10柱上凝膠過(guò)濾將其脫鹽。將所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷凍，然后于-70℃保存。
通過(guò)SDS-PAGE，所得制劑的純度約＞80％。這些制劑水解cAMP的比活約10-40μmol cAMP/每分鐘/毫克蛋白。用釀酒酵母制備PDE4B在室溫下，通過(guò)與100ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.2，2mM EDTA，2mM EGTA，1mMDTT，2mM苯甲脒鹽酸鹽、各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、鈣蛋白酶抑制劑I和II)混合，解凍酵母細(xì)胞(150g帶有HDUN2.32的酵母菌株YI23)。將所述混合物冷卻至4℃，轉(zhuǎn)移到Bead-Beater中，快速混合6個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)30秒)使所述細(xì)胞裂解。在Beckman J2-21M離心機(jī)中，使用JA-10轉(zhuǎn)子，將所述勻漿于4℃以9,000rpm離心22分鐘?；厥丈锨逡?，并且在Beckman XL-80超速離心機(jī)中，使用TI45轉(zhuǎn)子，將其于4℃以36,000rpm離心45分鐘?；厥丈锨逡翰⑶彝ㄟ^(guò)加入固體硫酸銨(0.26g/ml上清液)，同時(shí)在冰浴中攪拌并且維持pH在7.0-7.5的范圍內(nèi)，沉淀PDE4B。然后，在Beckman J2離心機(jī)中，使用JA-10轉(zhuǎn)子，將該混合物以9,000rpm(12,000Xg)離心22分鐘。棄去上清液，將沉淀溶于200ml緩沖液A(50mM MOPS pH7.5，5mM氯化鎂，1mM DTT，1mM苯甲脒鹽酸鹽，以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)中。將pH和電導(dǎo)率分別校正為7.5和15-20mS。
將所述重懸浮樣品上樣到在緩沖液A中平衡的1.6×200cmSigma Cibacron Blue Agarose-300型柱(25ml)中。將所述樣品在12個(gè)小時(shí)內(nèi)循環(huán)通過(guò)所述柱4-6次。依次用125-250ml緩沖液A、125-250ml含有1.5M氯化鈉的緩沖液A和25-50ml緩沖液A洗滌所述柱子。用50-75ml緩沖液E(50mM Tris HCl pH8，2mM EDTA，2mMEGTA，1mM DTT，2mM苯甲脒鹽酸鹽和20mM cAMP)和50-75ml含有1M氯化鈉的緩沖液E洗脫所述酶。合并PDE活性峰，用硫酸銨(0.4g/ml酶合并液)沉淀，以便去除過(guò)量的環(huán)核苷酸。將沉淀蛋白重懸于緩沖液X(25mM MOPS pH7.5，5μM硫酸鋅，50mM氯化鈉，1mM DTT和1mM苯甲脒鹽酸鹽)中，并且按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，通過(guò)在Pharmacia PD-10柱上凝膠過(guò)濾將其脫鹽。將該酶合并液對(duì)含有50％甘油的緩沖液X透析過(guò)夜。將所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷凍，然后于-70℃保存。
通過(guò)SDS-PAGE，所得制劑的純度約＞90％。這些制劑水解cAMP的比活約10-50μmol cAMP/每分鐘/毫克蛋白。用釀酒酵母制備PDE4C在室溫下，通過(guò)與100ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.2，2mM EDTA，2mM EGTA，1mMDTT，2mM苯甲脒鹽酸鹽，各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、鈣蛋白酶抑制劑I和II)混合，解凍酵母細(xì)胞(150g帶有HDUN3.48的酵母菌株YI30)。將所述混合物冷卻至4℃，轉(zhuǎn)移到BEAD-BEATER中并且快速混合6個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)30秒)使所述細(xì)胞裂解。在Beckman J2-21M離心機(jī)中，使用JA-10轉(zhuǎn)子，將所述勻漿于4℃以9,000rpm離心22分鐘?；厥丈锨逡?，并且在BeckmanXL-80超速離心機(jī)中，使用TI45轉(zhuǎn)子，將其于4℃以36,000rpm離心45分鐘。
回收上清液，通過(guò)加入固體硫酸銨(0.26g/ml上清液)，同時(shí)在冰浴中攪拌并且維持pH在7.0-7.5的范圍內(nèi)，沉淀PDE4C。30分鐘后，在Beckman J2離心機(jī)中，使用JA-10轉(zhuǎn)子，將該混合物以9,000rpm(12,000Xg)離心22分鐘。棄去上清液，將沉淀溶于200ml緩沖液A(50mM MOPS pH7.5，5mM氯化鎂，1mM DTT，2mM苯甲脒鹽酸鹽，以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)中。將pH和電導(dǎo)率分別校正為7.5和15-20mS。
將所述重懸浮樣品上樣到在緩沖液A中平衡的1.6×20cm SigmaCibacron Blue Agarose-300型柱(25ml)中。將所述樣品在12個(gè)小時(shí)內(nèi)循環(huán)通過(guò)所述柱4-6次。依次用125-250ml緩沖液A、125-250ml含有1.5M氯化鈉的緩沖液A和25-50ml緩沖液A洗滌所述柱子。用50-75ml緩沖液E(50mM Tris HCl pH8，2mM EDTA，2mM EGTA，1mM DTT，2mM苯甲脒鹽酸鹽和20mM cAMP)和50-75ml含有1M氯化鈉的緩沖液E洗脫所述酶。合并PDE4C活性峰，用硫酸銨(0.4g/ml酶合并液)沉淀，以便去除過(guò)量的環(huán)核苷酸。將沉淀蛋白重懸于緩沖液X(25mM MOPS pH7.2，5μM硫酸鋅，50mM氯化鈉，1mM DTT和1mM苯甲脒鹽酸鹽)中，并且按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，經(jīng)在PharmaciaPD-10柱上凝膠過(guò)濾將其脫鹽。將該酶合并液對(duì)含有50％甘油的緩沖液X透析過(guò)夜。將所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷凍，然后于-70℃保存。
通過(guò)SDS-PAGE，所得制劑的純度約＞80％。這些制劑水解cAMP的比活約10-20μmol cAMP/每分鐘/毫克蛋白。用釀酒酵母制備PDE4D在室溫下，通過(guò)與150ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml裂解緩沖液(50mM MOPS pH7.2，10μM硫酸鋅，2mM氯化鎂，14.2mM2-巰基乙醇，2mM苯甲脒鹽酸鹽，各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、鈣蛋白酶抑制劑I和II)混合，解凍酵母細(xì)胞(100g帶有HDUN4.11的酵母菌株YI29)。將所述混合物冷卻至4℃，轉(zhuǎn)移到Bead-Beater中并且快速混合6個(gè)循環(huán)(每個(gè)循環(huán)30秒)使所述細(xì)胞裂解。在Beckman J2-21M離心機(jī)中，使用JA-10轉(zhuǎn)子，將所述勻漿于4℃以9,000rpm離心22分鐘?；厥丈锨逡海贐eckman XL-80超速離心機(jī)中，使用TI45轉(zhuǎn)子，將其于4℃以36,000rpm離心45分鐘?；厥丈锨逡?，通過(guò)加入固體硫酸銨(0.33g/ml上清液)，同時(shí)在冰浴中攪拌并且維持pH在7.0-7.5的范圍內(nèi)，沉淀PDE4D。30分鐘后，在Beckman J2離心機(jī)中，使用JA-10轉(zhuǎn)子，將該混合物以9,000rpm(12,000Xg)離心22分鐘。棄去上清液，將沉淀溶于100ml緩沖液A(50mM MOPS pH7.5，10μM硫酸鋅，5mM氯化鎂，14.2mM 2-巰基乙醇，100mM苯甲脒鹽酸鹽，以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽、抑蛋白酶肽、鈣蛋白酶抑制劑I和II)中。將pH和電導(dǎo)率分別校正為7.5和15-20mS。
以流速0.67ml/min，將所述重懸浮樣品上樣到在緩沖液A中平衡的1.6×20cm Sigma Cibacron Blue Agarose-300型柱(10ml)中。依次用50-100ml緩沖液A、20-30ml含有20mM 5’-AMP的緩沖液A、50-100ml含有1.5M氯化鈉的緩沖液A和10-20ml緩沖液C(50mMTris HCl pH8，10μM硫酸鋅，14.2mM2-巰基乙醇，2mM苯甲脒鹽酸鹽)洗滌所述柱子。用20-30ml含有20mM cAMP的緩沖液C洗脫所述酶。
合并PDE4D活性峰，用硫酸銨(0.4g/ml酶合并液)沉淀，以便去除過(guò)量的環(huán)核苷酸。將沉淀蛋白重懸于緩沖液X(25mM MOPS pH7.2，5μM硫酸鋅，50mM氯化鈉，1mM DTT和1mM苯甲脒鹽酸鹽)中，并且按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，通過(guò)在Pharmacia PD-10柱上凝膠過(guò)濾將其脫鹽。將該酶合并液對(duì)含有50％甘油的緩沖液X透析過(guò)夜。將所述酶的制劑在干冰/乙醇浴中快速冷凍，然后于-70℃保存。
通過(guò)SDS-PAGE，所得制劑的純度約＞80％。該制劑水解cAMP的比活約20-50μmol cAMP/每分鐘/毫克蛋白。脂多糖刺激人外周血淋巴細(xì)胞釋放TNFα為了評(píng)價(jià)化合物降低人外周血淋巴細(xì)胞(PBL)分泌TNFα的能力，進(jìn)行以下試驗(yàn)。先前的研究已經(jīng)證明，人PBL與cAMP升高的因子(例如前列腺素E21、毛喉素、8-溴-cAMP或二丁基-cAMP)一起孵育，當(dāng)用脂多糖(LPS，內(nèi)毒素)時(shí)抑制所述細(xì)胞分泌TNFα。因此，已進(jìn)行的初步實(shí)驗(yàn)已證明，選擇性PDE4抑制劑(例如咯利普蘭)以依賴(lài)于劑量的方式抑制LPS誘導(dǎo)的人淋巴細(xì)胞分泌TNFα。因此，應(yīng)用人PBL TNFα分泌量作為化合物升高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度和/或抑制細(xì)胞內(nèi)PDE4活性的能力的標(biāo)準(zhǔn)。
將取自人自愿者的肝素化血液(約30ml)以1∶1與Dulbecco氏改進(jìn)磷酸緩沖鹽水混合。將該混合物以1∶1與HISTOPAQUE混合，然后在Beckman TJ6型離心機(jī)的吊桶中，在室溫下無(wú)需制動(dòng)以1,500rpm離心。紅細(xì)胞離心后位于試管底部，血清保留在試管的表面。含有淋巴細(xì)胞的一層沉降在血清層和HISTOPAQUE層之間，通過(guò)抽吸將其取出，置于一支新試管中。將該細(xì)胞定量并調(diào)至3×106細(xì)胞/ml，然后將100μl等份樣品加到96孔板的各孔中。在加入細(xì)菌LPS(25mg/ml)前15分鐘，將試驗(yàn)化合物和RPMI培養(yǎng)基(Gibco/BRL LifeSciences)加到各種孔中。讓混合物在濕潤(rùn)室中于37℃孵育20小時(shí)。然后在室溫下通過(guò)以800rpm離心5分鐘分離細(xì)胞。將180μl等份上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的板上，用于測(cè)定TNFα的濃度。采用市售的酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)(CYTOSCREEN免疫測(cè)定試劑盒，BiosourceInternational)，測(cè)定細(xì)胞上清液中的TNFα蛋白。
基于細(xì)胞的測(cè)定提供了以下本發(fā)明的各種吡咯烷化合物的結(jié)果。EC50值(即能夠抑制50％總TNFα的化合物有效濃度)說(shuō)明本發(fā)明化合物抑制人PBL釋放LPS刺激性TNFα的能力。
下表說(shuō)明了式(II)化合物抑制體外PDE4活性和釋放TNFα的能力。在下表中，確定抑制人重組PDE4的IC50值。
上述數(shù)據(jù)說(shuō)明，本發(fā)明化合物為有效的PDE4抑制劑，例如所述化合物對(duì)人重組PDE4的IC50為約1nM至約15μM。優(yōu)選化合物的IC50為約50nM或以下，特別優(yōu)選化合物的IC50為約25nM或以下。
同樣，優(yōu)選的化合物的PBL/TNFαEC50為約1000nM或以下，最好是500nM或以下。更優(yōu)選的化合物的PBL/TNFαEC50為約100nM或以下。
為充分體現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，所述化合物對(duì)人重組PDE4的IC50為約50nM或以下，PBL/TNFαEC50為約1000nM或以下。更優(yōu)選的是，所述化合物的IC50為約25nM或以下，PBL/TNFαEC50為約500nM或以下。動(dòng)物模型內(nèi)毒素刺激性小鼠釋放TNFα和運(yùn)動(dòng)能力聯(lián)合測(cè)定該項(xiàng)研究的目的是為了測(cè)定PDE4抑制劑在LPS小鼠模型中的體內(nèi)作用，以及測(cè)定表現(xiàn)為固有運(yùn)動(dòng)能力減少的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)副作用。
試驗(yàn)動(dòng)物為雌性Balb/c小鼠，平均體重約20g。以劑量為0.1mg/kg、1.0mg/kg、10.0mg/kg和100mg/kg，通過(guò)腹膜內(nèi)(i.p.)注射給予配制在30％ CremophorEL中的PDE4抑制劑。根據(jù)所測(cè)量的體重，調(diào)整各種劑量體積(約150μl)。1小時(shí)后，將5mg/kgLPS(終體積200μl)通過(guò)尾靜脈注射到每只動(dòng)物體內(nèi)。LPS處理后90分鐘，將動(dòng)物放血，收集血清樣品，然后于-70℃貯存待用于測(cè)定。
對(duì)于效果測(cè)定，將該血清樣品稀釋2倍，采用CYTOSCREEN免疫測(cè)定試劑盒(Biosource International)，測(cè)定TNFα水平。每種試驗(yàn)化合物有三個(gè)復(fù)份，數(shù)據(jù)為三個(gè)復(fù)份樣品的平均值。
X-Y平面的運(yùn)動(dòng)或后腿直立(rearing up on the hind legs)次數(shù)通過(guò)對(duì)每單位時(shí)間內(nèi)“光束”交叉次數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)對(duì)其定量?；顒?dòng)事件次數(shù)的減少與該動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力或不活動(dòng)成正比。定量計(jì)分與上述客觀測(cè)量有很好的相關(guān)性。
下表概述了通過(guò)上述方法獲得的運(yùn)動(dòng)能力測(cè)定(運(yùn)動(dòng)性，％活動(dòng))結(jié)果
1)比對(duì)照固有運(yùn)動(dòng)能力減少50％的有效劑量(mg/kg)。
還與咯利普蘭和Feldman等的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,665,754中公開(kāi)的化合物相比，確定式(II)化合物具有較少的中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用。還發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用活性與本發(fā)明化合物的絕對(duì)立體化學(xué)有關(guān)。
以上總結(jié)的結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物可用于選擇性地抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)的PDE4活性，而沒(méi)有與在先PDE4抑制劑有關(guān)的不利的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用和催吐作用。
顯然，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以對(duì)本文以上提出的本發(fā)明內(nèi)容作各種修改和變化，因此，本發(fā)明只受所附權(quán)利要求書(shū)的限制。
權(quán)利要求
1.一種具有以下結(jié)構(gòu)式的化合物， 其中Y為OR5或NR5R6；R1為低級(jí)烷基、橋連烷基、芳烷基、環(huán)烷基、5-或6-元飽和雜環(huán)基、C1-3亞烷基環(huán)烷基、芳基-或雜芳基-取代的炔丙基、芳基-或雜芳基-取代的烯丙基或鹵代環(huán)烷基；R2為氫、甲基或鹵基取代的甲基；R3選自C(＝O)OR7、C(＝O)R7、C(＝NH)NR8R9、C(＝O)NR8R9、芳基或雜芳基；R4為氫、低級(jí)烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基或芳基；R5和R6獨(dú)立為氫、低級(jí)烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基或烷芳基，或者R5和R6一起形成5-元環(huán)或6-元環(huán)；R7為支鏈或直鏈低級(jí)烷基或芳基，并且R7可以任選用一個(gè)或多個(gè)RO8、NR8R9或SR8取代；R8和R9相同或不同，它們選自氫、低級(jí)烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基和芳烷基，或者R8和R9一起形成4-元至7-元環(huán)；R10為氫、烷基、鹵代烷基、環(huán)烷基、芳基、C(＝O)烷基、C(＝O)環(huán)烷基、C(＝O)芳基、C(＝O)O烷基、C(＝O)O環(huán)烷基、C(＝O)芳基、CH2OH、CH2O烷基、CHO、CN、NO2或SO2R11；R11為烷基、環(huán)烷基、三氟甲基、芳基、芳烷基或NR8R9。
2.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物具有以下結(jié)構(gòu)
3.權(quán)利要求1的化合物，其中R1選自
4.權(quán)利要求1的化合物，其中R3選自
5.權(quán)利要求1的化合物，其中R4選自氫、甲基、三氟甲基、環(huán)丙基、芐基和苯基。
6.權(quán)利要求1的化合物，其中R5和R6獨(dú)立為氫或低級(jí)烷基。
7.權(quán)利要求1的化合物，其中R7為低級(jí)烷基。
8.權(quán)利要求1的化合物，其中R8和R9獨(dú)立為氫或低級(jí)烷基，或者R8和R9一起形成5-元環(huán)或6-元環(huán)。
9.權(quán)利要求1的化合物，其中R1選自環(huán)戊基、四氫呋喃基、茚滿基、降冰片基、苯乙基和苯基丁基；R2選自甲基和二氟甲基；R3選自CO2CH3、C(＝O)CH2OH、C(＝O)CH(CH3)OH、C(＝O)C(CH3)2OH，和 R4為氫或甲基；R5和R6獨(dú)立為氫或甲基，或者R5和R6一起形成5-元環(huán)或6-元環(huán)；R7為甲基；R10為氫。
10.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物具有以下結(jié)構(gòu) (R和S異構(gòu)體)
11.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物對(duì)人重組PDE4的IC50為約1nM至約15μM。
12.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物的PBL/TNFαEC50為約1nM至約20μM。
13.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物對(duì)人重組PDE4的IC50為約1nM至約15μM，PBL/TNFαEC50為約1nM至約25μM。
14.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物對(duì)人重組PDE4的IC50為100×10-6M或100×10-6M以下。
15.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物對(duì)人重組PDE4的IC50為50×10-6M或50×10-6M以下。
16.一種藥用組合物，它包含權(quán)利要求1的化合物、藥學(xué)上可接受的載體和任選的第二種抗炎治療藥物。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中所述第二種抗炎治療藥物能夠靶向TNFα。
18.一種治療患有抑制cAMP特異性PDE具有治療益處的病癥的哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的權(quán)利要求1化合物。
19.一種調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物體內(nèi)cAMP水平的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物有效量的權(quán)利要求1化合物。
20.一種治療患有抑制cAMP特異性PDE具有治療益處的病癥的哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物有效量的包含權(quán)利要求1化合物和藥學(xué)上可接受的載體的藥用組合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述病癥是變應(yīng)性疾病、自身免疫病、炎性疾病、關(guān)節(jié)疾病或皮炎。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述病癥是類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎或脊椎炎。
23.權(quán)利要求20的方法，其中所述病癥是甲狀腺相關(guān)性眼病、貝切特氏病、膿毒病、敗血癥性休克、內(nèi)毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒病、革蘭氏陽(yáng)性膿毒病、中毒性休克綜合征、過(guò)敏性結(jié)膜炎、春季結(jié)膜炎或嗜曙紅細(xì)胞肉芽腫。
24.權(quán)利要求20的方法，其中所述病癥是哮喘、慢性支氣管炎、過(guò)敏性鼻炎、成人呼吸窘迫綜合征、慢性肺部炎性疾病、慢性阻塞性肺部疾病、硅肺和肺結(jié)節(jié)病。
25.權(quán)利要求20的方法，其中所述病癥是心肌、腦或肢端的再灌注損傷、由于外傷引起的腦或脊髓損傷。
26.權(quán)利要求20的方法，其中所述病癥是纖維變性、瘢痕疙瘩形成或疤痕組織形成。
27.權(quán)利要求20的方法，其中所述病癥是系統(tǒng)性紅斑狼瘡、移植排斥性病癥、移植物抗宿主反應(yīng)或同種異體移植排斥。
28.權(quán)利要求20的方法，其中所述病癥是慢性腎小球腎炎、炎性腸病、節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結(jié)腸炎。
29.權(quán)利要求20的方法，其中所述病癥是增生性淋巴細(xì)胞疾病或白血病。
30.權(quán)利要求20的方法，其中所述病癥是炎性皮膚病、特應(yīng)性皮炎、牛皮癬或蕁麻疹。
31.權(quán)利要求20的方法，其中所述病癥是心肌病、充血性心力衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化、發(fā)熱、惡病質(zhì)、感染或惡性腫瘤繼發(fā)性惡病質(zhì)、獲得性免疫缺陷綜合征繼發(fā)性惡病質(zhì)、ARC、腦型瘧、骨質(zhì)疏松、骨吸收疾病、由于感染引起的發(fā)燒和肌痛、勃起機(jī)能障礙、尿崩癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、抑郁癥、多發(fā)梗塞性癡呆、焦慮癥或應(yīng)激反應(yīng)、腦缺血、遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙、帕金森氏病或經(jīng)前綜合征。
33.權(quán)利要求20的方法，其中所述哺乳動(dòng)物表現(xiàn)出最小催吐反應(yīng)。
34.權(quán)利要求20的方法，其中所述哺乳動(dòng)物沒(méi)有催吐反應(yīng)。
35.權(quán)利要求20的方法，其中所述哺乳動(dòng)物表現(xiàn)出最小的不利中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用。
36.權(quán)利要求20的方法，其中所述哺乳動(dòng)物沒(méi)有不利的中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用。
37.一種降低哺乳動(dòng)物體內(nèi)TNF水平的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的權(quán)利要求1化合物。
38.一種抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)炎性細(xì)胞激活的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的權(quán)利要求1化合物。
37.一種抑制哺乳動(dòng)物體內(nèi)PDE4功能的方法，所述方法包括給予所述哺乳動(dòng)物治療有效量的權(quán)利要求1化合物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了為有效選擇性PDE4抑制劑的式(I)化合物，以及制備所述化合物的方法。還公開(kāi)了應(yīng)用所述化合物治療炎性疾病和其它涉及細(xì)胞因子水平升高的疾病以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病。
文檔編號(hào)A61P31/04GK1434797SQ00819091
公開(kāi)日2003年8月6日 申請(qǐng)日期2000年11月28日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月23日
發(fā)明者K·W·福勒, A·奧利弗, J·奧丁戈 申請(qǐng)人:艾科斯有限公司