抗原特異性的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制備方法，包括步驟：A）攜帶腫瘤抗原基因重組載體的構(gòu)建；B）DC細(xì)胞的分離與培養(yǎng)；C）使用步驟A）所述重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟B）所述的未成熟DC細(xì)胞；D）進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞因子誘導(dǎo)步驟C）所述的未成熟DC細(xì)胞成為成熟DC細(xì)胞；E）將步驟D）所述的成熟DC細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，獲得具有抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。本發(fā)明優(yōu)選同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)可用于表達(dá)CEA、MAGE-A3、MUC1三種廣譜腫瘤抗原的慢病毒混合載體轉(zhuǎn)導(dǎo)未成熟DC細(xì)胞，獲得經(jīng)活化和增殖的腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種新的多抗原廣譜CTL的制備方法和應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002]目前，癌癥的抗腫瘤免疫治療策略主要有:腫瘤全細(xì)胞疫苗(Whole-tumorcell vaccines)、樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗(Dendritic cell vaccines, DC疫苗)、重組蛋白疫苗(recombinant proteins vaccines)、多妝疫苗(Peptide vaccines)、DNA 疫苗(DNAvaccines)和病毒疫苗(Viral vaccines)等,有研究顯示，以DC疫苗聯(lián)合過(guò)繼性T細(xì)胞免疫治療(adoptive T-celI therapy)效果最好。DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞，成熟DC表面高表達(dá)MHC-1 / II分子、共刺激分子(⑶40、⑶80、⑶86等)和黏附分子(LFA-3、ICAM-1等)，不僅能有效的將腫瘤抗原遞呈給已活化或記憶性T細(xì)胞，還能將抗原遞呈給初始T細(xì)胞使其增殖，是機(jī)體適應(yīng)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，在適應(yīng)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中具有獨(dú)特的地位。目前，以DC為基礎(chǔ)的CTL主要包括:腫瘤抗原肽致敏的CTL、腫瘤全細(xì)胞抗原致敏的CTL、腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的CTL等。其中，用腫瘤抗原肽或腫瘤全細(xì)胞抗原致敏DC回輸后，雖然可以引起特異免疫保護(hù)作用，但并不持久；然而有意義的是，從有限的腫瘤組織中擴(kuò)增足量的有效刺激DC的mRNA，采用差異篩選方法獲特異性表達(dá)的腫瘤特異性抗原mRNA導(dǎo)入DC，制備RNA疫苗，或?qū)⒛[瘤抗原基因以裸DNA方式導(dǎo)人DC，或以病毒為載體轉(zhuǎn)導(dǎo)DC，使DC持續(xù)表達(dá)腫瘤抗原，可解決上述兩種CTL因抗原解離、腫瘤來(lái)源有限、有誘發(fā)自身免疫性疾病危險(xiǎn)等不足的問(wèn)題。
[0003]目前基因修飾DC的方法主要有病毒載體和非病毒載體介導(dǎo)兩大類方法。非病毒載體介導(dǎo)的方法主要有脂質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀法等。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo)作為早期的方法之一近年來(lái)雖然不斷改進(jìn)，但其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不高和細(xì)胞毒性仍是其廣泛應(yīng)用的障礙，同時(shí)對(duì)DC的功能及活性也有較大的影響?，F(xiàn)認(rèn)為病毒載體對(duì)DC的轉(zhuǎn)導(dǎo)更為有效。如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等。腺病毒載體轉(zhuǎn)基因效率高，不受靶細(xì)胞是否為分裂細(xì)胞的限制，容易制得高滴度病毒載體，生物活性評(píng)價(jià)也較簡(jiǎn)便，但由于有較高的免疫原性，導(dǎo)致其使用受限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種新型的廣譜腫瘤抗原特異性的CTL，使用慢病毒載體細(xì)胞基因工程的方法，利用樹(shù)突狀細(xì)胞強(qiáng)大的抗原遞呈功能，更有效的激活廣譜腫瘤抗原特異性T淋巴細(xì)胞的增殖和殺傷能力。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種CTL的制備方法，包括步驟:
[0007]A)攜帶腫瘤抗原基因重組載體的構(gòu)建；
[0008]B) DC細(xì)胞的分離與培養(yǎng)；[0009]C)使用步驟A)所述重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟B)所述的未成熟DC細(xì)胞；
[0010]D)進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞因子誘導(dǎo)步驟C)所述的未成熟DC細(xì)胞成為成熟DC細(xì)胞；
[0011]E)將步驟D)所述的成熟DC細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，獲得具有抗原特異性的殺傷毒T淋巴細(xì)胞，即CTL。
[0012]所述的腫瘤抗原基因?yàn)樾聵?gòu)建的癌胚抗原(CEA)基因片段，或黑色素瘤相關(guān)抗原A3 (MAGE-A3)基因片段，或粘蛋白I抗原(MUCl)基因片段；本發(fā)明通過(guò)大量的篩選和探索，最終確定出癌胚抗原基因片段的核昔酸序列如SEQ ID NO:1所不；黑色素瘤相關(guān)抗原A3基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；粘蛋白I抗原基因片段如SEQ ID NO: 3所示，使得最終制備得來(lái)的CTL具有極佳的抗原特異性。
[0013]在采用血細(xì)胞分離儀或直接抽取腫瘤患者靜脈外周血(50-150毫升)，分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。經(jīng)培養(yǎng)，PBMC被分離為淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，備用。攜帶特定腫瘤相關(guān)抗原決定簇基因的慢病毒載體感染未成熟的單核細(xì)胞來(lái)源的未成熟DC細(xì)胞，并以細(xì)胞因子TNF-α誘導(dǎo)成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)產(chǎn)生。將成熟的DC與T淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)，使淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成為具有抗原特異性的，殺傷抗原陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(C TL)，最后將被激活的CTL回輸給腫瘤患者。整個(gè)過(guò)程需要12-14天。
[0014]本發(fā)明優(yōu)選為同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)可用于表達(dá)CEA、MAGE-A3、MUCl三種廣譜腫瘤抗原的慢病毒混合載體轉(zhuǎn)導(dǎo)未成熟DC細(xì)胞，獲得經(jīng)活化和增殖的腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞(Lv-DC-CTL)，以達(dá)到更大的廣譜腫瘤治療范圍和針對(duì)多靶點(diǎn)抗原誘導(dǎo)，增強(qiáng)特異腫瘤殺傷性的治療效果。
[0015]廣譜腫瘤抗原的使用可以彌補(bǔ)對(duì)腫瘤抗原缺乏檢測(cè)手段的不足，同時(shí)可以通過(guò)增加抗原靶點(diǎn)從而增強(qiáng)免疫療效；慢病毒載體可以有效和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，并使其持續(xù)表達(dá)腫瘤抗原；樹(shù)突狀細(xì)胞是專職的免疫抗原遞呈細(xì)胞，可以有效地促進(jìn)特異性T細(xì)胞的活化和增殖。
[0016]本發(fā)明可在符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的車(chē)間中進(jìn)行大批量，商業(yè)化生產(chǎn)高純度，并符合臨床應(yīng)用的高活性滴度的攜帶腫瘤相關(guān)抗原決定簇基因的慢病毒載體。克服了以往DC刺激物不能大規(guī)模，按照制藥標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)的缺點(diǎn)。
[0017]慢病毒載體系統(tǒng)(Lentiviral vector, Lv)是以慢病毒為基本骨架改建而來(lái)的,可有效地整合入靶細(xì)胞基因組并穩(wěn)定持久地表達(dá)所攜帶的外源基因，所攜帶外源基因不會(huì)發(fā)生突變，因而以其高效而穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移效率而成為近年來(lái)基因轉(zhuǎn)移載體的最佳選擇。與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比具有以下優(yōu)點(diǎn):(I)既可以感染處于有絲分裂期的細(xì)胞，也可以感染處于分裂終末期和靜止期的細(xì)胞；(2)轉(zhuǎn)移基因片段容量較大，可以容納約IOkb左右的外源基因，可以兼容多個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；(3)整合入宿主基因組的目的基因?qū)D(zhuǎn)錄沉默作用有較強(qiáng)的抵抗能力，可長(zhǎng)期而穩(wěn)定的表達(dá)；(4)不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)；(5) LVs經(jīng)改造后不在宿主細(xì)胞繁殖，不會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞的死亡，被感染或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠連續(xù)傳代。此外，DCs對(duì)慢病毒載體天然易感，故修飾的慢病毒載體變異株能成為DCs的合適載體，而不成熟及成熟DCs都能被慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，不成熟DCs被感染后仍能進(jìn)一步發(fā)育成熟，而成熟DCs仍具有良好的抗原呈遞功能，能誘導(dǎo)同種CTL產(chǎn)生。因此，慢病毒載體成為基因修飾DC的理想載體。
[0018]腫瘤抗原的存在是T細(xì)胞特異免疫反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，有效地篩選腫瘤抗原(或抗原肽)是提高其致敏DC后誘導(dǎo)特異性抗腫瘤反應(yīng)能力的關(guān)鍵和難點(diǎn)。為制備廣譜腫瘤抗原CTL，我們根據(jù)以往的研究成果選擇了以下三個(gè)腫瘤抗原:1)癌胚抗原(CEA)是一種相對(duì)廣譜的腫瘤標(biāo)志物，在大多數(shù)的結(jié)直腸癌、胰腺癌，50%的乳腺癌以及70%的非小細(xì)胞型肺癌，以及正常的結(jié)腸粘膜以及胎兒消化器官都有表達(dá)。目前基于CEA為免疫原的腫瘤治療已經(jīng)展開(kāi)相當(dāng)數(shù)量的臨床實(shí)驗(yàn)。2)黑色素瘤相關(guān)抗原A3(MAGE-A3)，該抗原只在機(jī)體發(fā)育的胚胎期及其出生后的睪丸和卵巢等生殖細(xì)胞上表達(dá)。MAGE-A3可在多種腫瘤中表達(dá)，且存在很多⑶4+和⑶8+T細(xì)胞表位。Sienel等對(duì)204例I/II期非小細(xì)胞肺癌的多中心研究，檢測(cè)手術(shù)標(biāo)本中MAGE-A3的陽(yáng)性表達(dá)率為39.2%，更有意義的是，99名II期患者腫瘤中的表達(dá)陽(yáng)性率為49.5%，顯著高于105名I期患者的29.5% (P〈0.004),認(rèn)為在非小細(xì)胞肺癌中，MAGE-A3表達(dá)水平增高可能與疾病分期進(jìn)展存在相關(guān)性。此外，MAGE-A3還廣泛表達(dá)于其他實(shí)體腫瘤，有研究報(bào)道原發(fā)性肝癌為24%，頭頸部鱗癌為44.4%，結(jié)腸癌為27.3 %，肝內(nèi)膽管癌為40.7 %。由于MAGE-A3在腫瘤中的高水平表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)MAGE-A3的表達(dá)水平可以為腫瘤的診斷提供分子水平的證據(jù)。更有價(jià)值的是，把MAGE-A3作為腫瘤特異性抗原，利用抗原遞呈細(xì)胞把MAGE-A3抗原遞呈給免疫細(xì)胞識(shí)別，可以達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。3)粘蛋白I(MUCl)為一種跨膜糖蛋白，在多種腺癌中異常過(guò)表達(dá)的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物，具有高度表達(dá)、非MHC限制性活化CTL等免疫學(xué)特性，由外周骨架和外周糖鏈組成，其多肽骨架含有空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定一致的連續(xù)重復(fù)序列，構(gòu)成許多相同的重復(fù)的表位，這些表位可被抗體識(shí)別，也可作為超抗原與T細(xì)胞受體多價(jià)結(jié)合而活化T細(xì)胞。目前有多種基于MUCl的免疫原作為疫苗和基于MUCl抗體的免疫導(dǎo)向載體用于腫瘤生物治療的研究，如L-BLP25已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1為攜帶腫瘤抗原的慢病毒載體圖。其中Lv-CEA載體攜帶腫瘤抗原CEA片段，LV-MAGE-A3載體攜帶腫瘤抗原MAGE-A3片段，Lv-MUCl載體攜帶腫瘤抗原MUCl片段。 [0020]圖2為攜帶不同腫瘤抗原基因片段慢病毒載體的酶切鑒定。其中，L為DNA標(biāo)準(zhǔn)，1、2、4 分別為 Lv-CEA、Lv-MAGE-A3、Lv-MUCl 重組載體 Xhol/Spel 雙酶切；3 為 Lv_MAGE_A3重組載體BamHII/Spel雙酶切。其結(jié)果如表1所示。
[0021]圖3為攜帶腫瘤抗原的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)Hela細(xì)胞后所做蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。其中，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)簽蛋白HA證實(shí)腫瘤抗原表達(dá)，內(nèi)參蛋白為Beta-actin。在A圖中，1_3分別為不同濃度Lv-CEA轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hela細(xì)胞(1: 2.5，1: 5，1:10) ;4為空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hela細(xì)胞對(duì)照；5_6分別為L(zhǎng)v-MAGE-A3轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hela細(xì)胞(1: 100，1:500)。B圖中，1-2分別為不同濃度Lv-MUCl轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hela細(xì)胞(1:5，1:10) ;3為空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hela細(xì)胞對(duì)照。
[0022]圖4為單核細(xì)胞分化成為DC細(xì)胞過(guò)程中細(xì)胞表型的流式檢測(cè)圖。單核細(xì)胞在含有GM-CSF和IL-4的無(wú)血清的AM-V培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天分化成為未成熟DC細(xì)胞，然后通過(guò)添加細(xì)胞因子TNF-α與IFN-Y培養(yǎng)分化成為成熟的DC細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析單核來(lái)源的DC細(xì)胞，在O天、5天和7天檢測(cè)⑶14，⑶83，HLA-DR，⑶80和⑶86的細(xì)胞表型。
[0023]圖5為通過(guò)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)DC細(xì)胞，并激活、擴(kuò)增特異性T淋巴細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。A圖中流式分析散點(diǎn)圖顯示，未經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)HLA-A2陽(yáng)性的MCF-7沒(méi)有顯著的細(xì)胞殺傷毒性(效應(yīng)T細(xì)胞與靶細(xì)胞的比率為10:1)。B圖中經(jīng)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC與T細(xì)胞共培養(yǎng)后MCF-7的細(xì)胞比率與HLA-A2-陰性的PLC/PRF/5對(duì)照相比明顯減少，顯示其特異性的腫瘤細(xì)胞殺傷毒性。C圖中總結(jié)了不同效應(yīng)T細(xì)胞與靶細(xì)胞比率的細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)。隨著效應(yīng)T細(xì)胞比率的增加，腫瘤細(xì)胞殺傷毒性也有相應(yīng)增強(qiáng)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0025]采用血細(xì)胞分離儀或直接抽取腫瘤患者靜脈外周血，分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。PBMC被進(jìn)一步分離為淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞凍存或繼續(xù)培養(yǎng)，備用。單核細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化為未成熟DC細(xì)胞后，通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶腫瘤抗原的慢病毒載體表達(dá)、處理和遞呈相關(guān)腫瘤抗原。并經(jīng)細(xì)胞因子TNF-a、IFN_gama進(jìn)一步誘導(dǎo)成為成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)。通過(guò)把這些成熟的具有遞呈腫瘤抗原特性的DC與同源的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，獲得具有抗原特異性的、殺傷毒性的T淋巴細(xì)胞(Lv-DC-CTL)。最后通過(guò)回輸Lv-DC-CTL達(dá)到治療腫瘤的目的。整個(gè)Lv-DC-CTL制備的過(guò)程需要12-14天。
[0026]實(shí)施例1
[0027]以祀向癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA)為例,通過(guò)體外合成、分子克隆方法獲得CEA特異性的基因片段。癌胚抗原基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；黑色素瘤相關(guān)抗原A3基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；粘蛋白I抗原基因片段如 SEQ ID NO:3 所示。
[0028]實(shí)施例2
[0029]將所述CEA的基因片段導(dǎo)入慢病毒載體Lv，如圖1所示得到攜帶CEA抗原基因的慢病毒載體Lv-CEA。采用相同的方法，構(gòu)建具有MAGE-A3、MUCl抗原基因片段的的慢病毒載體。如圖1所示，其中，Lv-CEA慢病毒載體為攜帶CEA抗原片段的表達(dá)載體；Lv-MAGE_A3慢病毒載體為攜帶MAGE-A3抗原片段的表達(dá)載體；Lv-MUCl慢病毒載體為攜帶MUCl抗原片段的表達(dá)載體。
[0030]將攜帶有不同嵌合抗原受體基因片段的慢病毒載體采用單/雙酶切鑒定，其結(jié)果如圖2和表1所示。
[0031]表1攜帶不同腫瘤抗原基因片段的慢病毒載體采用酶切鑒定結(jié)果
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制備方法，包括步驟: A)攜帶腫瘤抗原基因重組載體的構(gòu)建； B)DC細(xì)胞的分離與培養(yǎng)； C)使用步驟A)所述重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟B)所述的未成熟DC細(xì)胞； D)進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞因子誘導(dǎo)步驟C)所述的未成熟DC細(xì)胞成為成熟DC細(xì)胞； E)將步驟D)所述的成熟DC細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，獲得具有抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。
2.如權(quán)利要求1所述的抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制備方法，其特征是:所述步驟A)所述的重組載體的載體為病毒載體。
3.如權(quán)利要求2所述的抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制備方法，其特征是:所述步驟A)所述的重組載體的載體為慢病毒載體。
4.如權(quán)利要求1所述的抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制備方法，其特征是:所述步驟A)所述的腫瘤抗原基因?yàn)樾聵?gòu)建的癌胚抗原(CEA)基因片段，或黑色素瘤相關(guān)抗原A3(MAGE-A3)基因片段，或粘蛋白I抗原(MUCl)基因片段；所述癌胚抗原基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述黑色素瘤相關(guān)抗原A3基因片段的核苷酸序列如SEQID NO:2所示；所述粘蛋白I抗原基因片段如SEQ ID NO:3所示。
5.如權(quán)利要求4所述的抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制備方法，其特征是:所述攜帶腫瘤抗原基因重組載體為攜帶癌胚抗原(CEA)基因，或攜帶黑色素瘤相關(guān)抗原A3(MAGE-A3)基因，或攜帶粘蛋白I抗原(MUCl)基因的重組載體的一種，或者兩種或者三種混合重組載體。
6.如權(quán)利要求1所述的抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制備方法，其特征是，所述步驟C)使用重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)未成熟DC細(xì)胞所用的重組載體為一種攜帶腫瘤抗原基因片段的重組載體，或者兩種或兩種以不同腫瘤抗原基因片段的重組載體的混合重組載體。
7.如權(quán)利要求6所述的抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制備方法，其特征是:所述步驟C)使用重組載體轉(zhuǎn)導(dǎo)未成熟DC細(xì)胞所用的重組載體為分別攜帶癌胚抗原基因片段，粘蛋白I抗原基因片段，黑色素瘤相關(guān)抗原A3基因片段的三種重組載體混合物。
8.如權(quán)利要求1所述的抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制備方法，其特征是:所述步驟B)為從腫瘤患者的外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞，將單個(gè)核細(xì)胞被進(jìn)一步分離為淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，淋巴細(xì)胞凍存或繼續(xù)培養(yǎng)，備用；單核細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)分化為未成熟DC細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8所述的抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制備方法，其特征是:所述外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)，經(jīng)細(xì)胞因子GM-CSF或/和IL4誘導(dǎo)分化為未成熟DC細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求1所述的抗原特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的制備方法，其特征是:所述步驟D)所述細(xì)胞因子為細(xì)胞因子TNF- α或/和IFN-gama。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK104004712SQ201410169608
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年4月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月24日
【發(fā)明者】張鴻聲, 張艷磊, 羅曉玲, 王宇環(huán) 申請(qǐng)人:深圳市合一康生物科技有限公司