專利名稱：活化淋巴細(xì)胞特異性的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及同種異體或異種器官移植后，或機(jī)體受病毒、細(xì)菌如結(jié)核桿菌感染或接種各種疫苗后，檢測體內(nèi)活化淋巴細(xì)胞的特異性的方法。

背景技術(shù)：
免疫(immune)或免疫性(immunity)是生物識別和清除抗原性異物的一種生理性反應(yīng)。引起免疫的抗原物質(zhì)大多不是生物體自身的，而是外源性物質(zhì)，它們進(jìn)入生物體后能被機(jī)體的免疫系統(tǒng)迅速識別，并通過一系列免疫應(yīng)答過程予以消滅，使機(jī)體恢復(fù)原來的平衡狀態(tài)。
在進(jìn)行器官移植時(shí)，供受體間的抗原性差異如主要組織相容性抗原(major histocompatibility antigen MHC)和次要組織相容性抗原(mH-antigen)的不同，就可刺激受體產(chǎn)生針對供體器官存在的與受體不同的抗原的特異性活化淋巴細(xì)胞，這些特異性活化淋巴細(xì)胞就會(huì)攻擊供體器官產(chǎn)生排斥反應(yīng)。當(dāng)機(jī)體受病原微生物感染，如麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型及庚型肝炎病毒、水痘和帶狀皰疹病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、冠狀病毒、輪狀病毒、柯薩基病毒、?？刹《?ECHO)、埃博拉病毒、黃熱病毒、腺病毒、森林腦炎病毒、風(fēng)疹病毒、登革熱病毒、流行性乙型腦炎病毒、狂犬病毒、SARS病毒、流行性感冒病毒(包括人、禽)流行性腮腺炎病毒、出血熱病毒、艾滋病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、立克次體、流行性腦炎雙球菌、傷寒或副傷寒桿菌、結(jié)核桿菌、白喉?xiàng)U菌、百日咳桿菌、炭疽桿菌、布氏桿菌、鼠疫耶爾森菌、麻瘋桿菌、非典型分枝桿菌、鉤端螺旋體、梅毒螺旋體、回歸熱螺旋體、衣原體、支原體、隱孢子蟲、利什曼原蟲、弓形蟲、日本血吸蟲、并殖吸蟲、華支睪吸蟲、姜片蟲、絲蟲、等感染時(shí)同樣會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生分別針對各種病原微生物的特異性活化淋巴細(xì)胞；在同一個(gè)機(jī)體中可能同時(shí)存在多種特異性的、分別針對多種不同抗原的活化淋巴細(xì)胞，如一個(gè)心臟移植后出現(xiàn)排斥反應(yīng)的患者感染了皰疹病毒，那么在該患者體內(nèi)，即有特異性針對供體器官主要組織相容性或次要組織相容性抗原的活化淋巴細(xì)胞，又有特異性針對皰疹病毒的活化淋巴細(xì)胞存在。
器官移植是治療許多器官終末期疾病的唯一方法。在器官移植后，供受體間MHC和mH抗原的差異將引起排斥反應(yīng)，排斥反應(yīng)仍是目前影響心、肝、腎、骨髓等器官或細(xì)胞移植后，3年、5年、10年存活率的主要因素，而排斥反應(yīng)的發(fā)生首先開始于淋巴細(xì)胞的活化。如果受者體內(nèi)出現(xiàn)抗供體特異性活化淋巴細(xì)胞，則預(yù)示著機(jī)體可能啟動(dòng)了攻擊供體器官的反應(yīng)，提示人們盡早采取針對性的措施，如增加免疫抑制劑劑量或更換免疫抑制劑種類等，從而使供體器官在受體體內(nèi)保持一個(gè)良好的功能狀態(tài)，進(jìn)而提高移植受者的生存質(zhì)量和生存期限。
目前活檢穿刺仍是世界上各移植中心診斷排斥反應(yīng)的根本方法和唯一標(biāo)準(zhǔn)，但由于活檢穿刺本身具有一定的危險(xiǎn)性，不宜多做，而且費(fèi)用昂貴，病人比較痛苦，不易為醫(yī)生和病人所接受。而且一個(gè)移植器官如心、肝、腎等，即使發(fā)生排斥反應(yīng)，其病變也不是均一的，而是有的部位有、有的部位無，有的輕、有的重?；顧z穿刺只能從器官的局部取材，容易誤診；另外活檢病理觀察，主要是看病理學(xué)改變，一旦出現(xiàn)病理學(xué)改變，也就表明器官已經(jīng)受到了損害；為建立一個(gè)方便、快速、敏感的非侵入性的器官移植排斥反應(yīng)診斷方法，國內(nèi)外研究者做了大量工作，嘗試了很多方法和標(biāo)志物，結(jié)果均不理想。所以，提供一個(gè)方便、快速、準(zhǔn)確、敏感的排斥反應(yīng)非侵入性診斷方法，對提高移植患者的生存質(zhì)量和延長移植器官的使用期限，具有重要意義；而且排斥反應(yīng)的發(fā)生首先開始于淋巴細(xì)胞的活化，活化淋巴細(xì)胞的出現(xiàn)應(yīng)早于病理改變。本發(fā)明主要是通過檢測外周血中被MHC或mH抗原活化的特異性淋巴細(xì)胞來診斷排斥反應(yīng)，所以本方法對排斥反應(yīng)的診斷應(yīng)早于移植器官的病理改變。另外，本方法簡便易行，可自動(dòng)操作，易標(biāo)準(zhǔn)化，克服了上述活檢穿刺方法的缺陷，能對診斷排斥反應(yīng)提供快速、準(zhǔn)確、清楚的測試結(jié)果。所以該方法的應(yīng)用對指導(dǎo)臨床調(diào)整免疫抑制劑用量，延長移植物存活期限，提高移植患者生存質(zhì)量，將會(huì)有極為重要的意義。
在病原微生物感染方面，如乙腦病毒、麻疹病毒、水痘病毒、結(jié)核桿菌等許多感染性疾病均有一個(gè)潛伏期，在這期間及發(fā)病早期大多只表現(xiàn)為非特異癥狀如發(fā)熱等，無特異性表現(xiàn)，而這些疾病的診斷常常依賴于該病典型臨床癥狀(特異性表現(xiàn))的出現(xiàn)，但典型癥狀出現(xiàn)一般較晚；有些甚至一直沒有典型癥狀，常導(dǎo)致誤診，延誤病情，引起嚴(yán)重后果。
本發(fā)明應(yīng)用在病原微生物感染診斷方面，可提供一個(gè)能在潛伏期或發(fā)病早期快速準(zhǔn)確進(jìn)行確診的方法，對各種傳染病早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療，避免傳染和流行，也將具有重要意義。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明適用于檢測任何抗原刺激機(jī)體所產(chǎn)生的活化淋巴細(xì)胞的特異性。
本發(fā)明所使用的抗原為同種異體抗原，異種抗原或各種病原微生物的抗原。同種異體抗原或異種抗原樣品可以是一種抗原也可以是來自一個(gè)個(gè)體或多個(gè)個(gè)體的混合抗原，其存在形式可以是以顆?？乖男问酱嬖谟谌嘶騽?dòng)物細(xì)胞膜上或存在于霉菌、細(xì)菌的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁上或存在于病毒包膜或衣殼上。也可以是以可溶性抗原的形式溶解在溶液中。
同種異體抗原是等位基因的直接或間接產(chǎn)物，該等位基因的產(chǎn)物可作為抗原被同一物種的另一成員所識別。該等位基因的產(chǎn)物不但有多肽，而且還有特異多糖和由等位基因編碼的酶合成的脂類。本發(fā)明中所用的同種異體抗原屬組織相容性抗原，包括主要組織相容性抗原(MHC)(在人類稱為“HLA”，豬稱為“SLA”，猴稱為“MAMU”，黃狒狒為“PACY”，小鼠的為H2抗原，大鼠的為RT1抗原等)和次要組織相容性抗原(mH-antigen)兩組。
異種抗原是指兩物種間一物種具有而另一物種所不具有的、能被另一物種識別產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)，如多肽、特異性多糖，脂類等。如將豬器官對人、猴、狒狒、黑猩猩等移植時(shí)，豬體內(nèi)所具有而人、猴、狒狒、黑猩猩等體內(nèi)所不具有的上述物質(zhì)即為異種抗原。
病原微生物抗原可以是一種細(xì)菌或病毒的某一個(gè)特異性抗原，也可以是這種細(xì)菌或病毒的混合抗原(每一種細(xì)菌或病毒都表達(dá)許多種抗原)，其存在形式可以是經(jīng)非離子去垢劑、脂溶劑或10％甲醛處理的細(xì)菌或病毒顆粒，也可以把細(xì)菌或病毒抗原表達(dá)在人或動(dòng)物細(xì)胞株的細(xì)胞膜上，還可以是以可溶性抗原的形式溶解于溶液中。
本發(fā)明中的目的抗原是指被檢測者體內(nèi)可能含有其特異性活化淋巴細(xì)胞的、通過檢測希望證實(shí)或排除的檢測用抗原。
本發(fā)明中的無關(guān)抗原是指在被檢測者體內(nèi)不可能含有其特異性活化淋巴細(xì)胞，在檢測中作為陰性對照的抗原。無關(guān)抗原根據(jù)檢測目的不同而不同，可另外添加，也可在一個(gè)檢測板內(nèi)相互作為陰性對照抗原。
本發(fā)明所使用的抗原可以是顆粒性抗原，如攜帶某個(gè)或某些人類HLA抗原的細(xì)胞、細(xì)菌或病毒，或攜帶某個(gè)病毒或細(xì)菌抗原的細(xì)胞、細(xì)菌或病毒等；也可以是可溶性抗原，如同種異體或異種抗原分子或某個(gè)病毒或細(xì)菌的某個(gè)特異性蛋白分子。
本發(fā)明所使用的抗原可以是一種同種異體或異種抗原分子，也可以是多種或人類全部HLA及mH抗原分子的混合物；是一種病毒或細(xì)菌的特異性抗原，也可以是幾種病毒或細(xì)菌的混合抗原。用單一抗原和混合抗原的區(qū)別在于結(jié)果提示診斷的精確性不同，如用同種異體抗原的混合抗原做檢測，其陽性結(jié)果只能提示有同種異體抗原特異性活化的淋巴細(xì)胞，即機(jī)體已啟動(dòng)了攻擊供體器官的排斥反應(yīng)，而不能確定是哪一個(gè)抗原誘導(dǎo)了淋巴細(xì)胞的活化從而引起了排斥反應(yīng)；而用各個(gè)單一抗原制成包含人類全部HLA和mH抗原的檢測板檢測，其結(jié)果陽性則可明確告訴我們機(jī)體中的活化淋巴細(xì)胞是由哪一個(gè)或哪幾個(gè)同種異體抗原誘導(dǎo)活化的；對于病毒或細(xì)菌感染性疾病的診斷也是一樣，如用呼吸道合胞病毒、冠狀病毒、腺病毒、流感病毒副流感病毒、麻疹病毒、水痘病毒、腮腺炎病毒、皰疹病毒等的混合抗原檢測，結(jié)果陽性，我們只能說患者被上述病毒中的一些病原體感染了而不能確定已被哪一種病毒感染的，而用單一某個(gè)病毒特異性的蛋白作抗原或相對單一地用某個(gè)病毒作抗原則可以確定是哪一種病毒感染。
本發(fā)明中所使用的抗原可通過如下方法得到 1.選定已配型器官移植受者多人，使這些人外周血B細(xì)胞膜上的HLA抗原組合包含人類全部的HLA-I類和II類抗原及其mH抗原。然后取這些人的外周血0.5ml放入含適量細(xì)胞培養(yǎng)基(如含10％新生?；蛱ヅＱ?GIBCO公司)的1640(GIBCO公司)或DMEM(GIBCO公司)或Eagle(GIBCO公司)培養(yǎng)基)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，同時(shí)在各培養(yǎng)瓶中加入適量B958細(xì)胞株(ATCC公司有售)的細(xì)胞培養(yǎng)上清(該細(xì)胞株在培養(yǎng)過程中能產(chǎn)生EB病毒釋放入培養(yǎng)液中)，其量以其所含EB病毒足以轉(zhuǎn)化移植受者0.5ml外周血中的全部B細(xì)胞為其合適的量(一般每毫升50萬個(gè)B958細(xì)胞培養(yǎng)三天后的上清約5-10ml即可)，然后把細(xì)胞培養(yǎng)瓶放37℃CO2孵箱中培養(yǎng)15天左右，每隔5天加培養(yǎng)液5-10ml，其培養(yǎng)時(shí)間長短以觀察到培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)呈團(tuán)狀懸浮生長的瘤細(xì)胞為準(zhǔn)。出現(xiàn)團(tuán)狀懸浮生長的瘤細(xì)胞后，即可象培養(yǎng)普通細(xì)胞一樣換液進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，只是要求所有接觸過這些細(xì)胞及B958細(xì)胞的物品及培養(yǎng)上清均要煮沸消毒，以殺滅EB病毒——雖然EB病毒分布很廣，正常人鼻咽腔等部位都可有EB病毒存在，但這一步消毒仍是必須的預(yù)防措施。以上這些受者的外周血經(jīng)上述處理就可建立各自的B細(xì)胞株，把這些細(xì)胞株通過克隆化、擴(kuò)增培養(yǎng)、按常規(guī)細(xì)胞凍存保種、即可建立他們各自固定表達(dá)某幾個(gè)HLA抗原或/和mH抗原的細(xì)胞系。
2.含人類HLA和mH抗原的細(xì)胞株還可通過以下基因工程方法得到選擇一不表達(dá)人HLA或/和mH抗原的人類細(xì)胞株如U937(ATCC公司有售)、K562(ATCC公司有售)等作為抗原載體，通過分子生物學(xué)常規(guī)技術(shù)分別提取上述所選定的受者的外周血白細(xì)胞中的mRNA，通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增、剪切、拼接等常規(guī)基因工程技術(shù)構(gòu)建分別能表達(dá)各種HLA抗原的表達(dá)載體，然后把這些表達(dá)載體轉(zhuǎn)入U(xiǎn)937或K562或其它不表達(dá)人HLA和mH抗原的細(xì)胞中令其表達(dá)，建立分別能表達(dá)各種HLA抗原的細(xì)胞株，即對人類全部HLA抗原分別進(jìn)行表達(dá)，對每個(gè)HLA抗原都各自建立一個(gè)表達(dá)細(xì)胞株，使每個(gè)細(xì)胞株只表達(dá)一種HLA抗原，通過建立一百多個(gè)細(xì)胞株使它們包含人類全部的HLA抗原，把這些表達(dá)HLA抗原的細(xì)胞株，分別通過克隆化、細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，常規(guī)凍存保種。即可建立分別固定表達(dá)某個(gè)人類HLA或mH抗原的細(xì)胞系。
3.含人類HLA和mH抗原的細(xì)胞株還可通過以下方法得到 3.1選擇已知表達(dá)或不表達(dá)人HLA或/和mH抗原的人類細(xì)胞株如Raji(ATCC公司有售)、U937(ATCC公司有售)、K562(ATCC公司有售)等作為瘤細(xì)胞株；選擇某已知HLA抗原的人的外周血B細(xì)胞，參考文獻(xiàn)(Abe等.J Immunol Methods，90111-123)，《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》(薛慶善主編，科學(xué)出版社出版，2001年第一版)，《SELECTED METHODS INCELLUAR IMMUNOLOGY》(Edited by Barbara B.Mishell and Stanley M.Shiigi W.H.Freeman and Company，San Francisco，1980)和《簡明免疫學(xué)技術(shù)》(朱正美 劉輝 主編科學(xué)出版社出版，2002年7月第一版)，添加一些細(xì)菌脂多糖(LPS)(SIGMA)(培養(yǎng)液中終濃度為2-25μg/ml)、用B細(xì)胞生長因子(BCGF)(自制，見3.2)、抗人IgM(Sigma公司)、美洲商陸(PWM)(Sigma公司)(培養(yǎng)液中終濃度為1-25μg/ml)和葡萄球菌A蛋白(Si gma公司)(培養(yǎng)液中終濃度為1/1000-1/10000)共同培養(yǎng)2-3周，然后參考《單克隆抗體技術(shù)》(徐志凱主編，陜西科學(xué)技術(shù)出版社出版，1992年1月第一版)，把Raji、U937或K562細(xì)胞與上述選擇的、已經(jīng)B細(xì)胞生長因子(BCGF)、抗人IgM、葡萄球菌A蛋白、細(xì)菌脂多糖和美洲商陸(PWM)刺激2-3周的、已知HLA抗原的人的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行融合，即可得到永生的、固定表達(dá)某幾個(gè)HLA抗原的細(xì)胞株。通過該方法，即可得到表達(dá)各種不同組合HLA抗原的細(xì)胞株。從而就可建立各種細(xì)胞株，并使這些細(xì)胞株包含人類幾乎全部的HLA抗原。
3.2建立B細(xì)胞株 1)制備含BCGF的培養(yǎng)上清液用含1％FCS(GIBCO公司)的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液將淋巴細(xì)胞配成密度為2×106個(gè)/ml的懸液。加PHA(SIGMA公司產(chǎn)品)至終濃度2μg/ml，裝入培養(yǎng)瓶。置飽和濕度、37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~4天。收集培養(yǎng)物于離心管中，于4℃下以1500r/min離心10min。收集上清液，即為粗制BCGF。于-20℃保存。
2)淋巴細(xì)胞制備抽取已知HLA抗原患者的外周血，肝素(Sigma公司)抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液(Sigma公司)分離其單個(gè)核細(xì)胞，用10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)液(GIBCO公司)配成密度為1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，放細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)4-8小時(shí)，晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶使細(xì)胞懸起，倒入離心管中1000r/min離心10min，沉淀為純化的淋巴細(xì)胞。
3)用含10％FCS的RPM I1640培養(yǎng)液將淋巴細(xì)胞配成密度為1×106個(gè)/ml的懸液。加入抗人IgM F(ab)2片段(Sigma公司)至終濃度為20μg/ml、粗制BCGF至終濃度為10％和細(xì)菌脂多糖(LPS)(SIGMA公司產(chǎn)品、培養(yǎng)液中終濃度為2-25μg/ml)。
4)在24孔板中，每孔加細(xì)胞懸液1ml，置37度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3~4d半量換液1次，即先從每孔中吸出0.5ml培養(yǎng)上清液棄去，再加入含20μg/ml抗人IgM F(ab)2、10％粗制BCGF和培養(yǎng)液中終濃度為2-25μg/ml細(xì)菌脂多糖(LPS)的新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)約3~5周，當(dāng)生長克隆較大時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。即為建立的、含已知HLA抗原的B細(xì)胞株。
5)通過該方法既可制備 表達(dá)各種不同HLA抗原的B細(xì)胞株。并使這些細(xì)胞株包含人類幾乎全部的HLA抗原。
4.含人類HLA抗原及mH抗原的細(xì)胞株還可通過下列方法得到，在人群中選擇一些不與其它人有相同HLA抗原或在十幾個(gè)HLA抗原中與其它人相同HLA抗原較少的個(gè)體，提取其外周血，按方法1的方法建立這些個(gè)體的B細(xì)胞株，然后以這些細(xì)胞株為載體，通過基因工程的方法(如方法2的方法)，把這些細(xì)胞株上未能包含的一些HLA或mH抗原也在這些細(xì)胞株上表達(dá)出來，從而使用較少的細(xì)胞株攜帶盡可能多的HLA抗原，最后達(dá)到用盡量少的細(xì)胞株表達(dá)出人類全部的HLA抗原和mH抗原。另外，按這一思路，選擇表達(dá)HLA-II類抗原較多的Raji細(xì)胞株(ATCC公司有售)或Dandi細(xì)胞株(ATCC公司有售)作為抗原載體，只需建幾個(gè)細(xì)胞株就可使細(xì)胞表面包含人類目前發(fā)現(xiàn)的全部18個(gè)DR抗原。
5.把通過上述方法或通過其它方法如直接從人或動(dòng)物脾臟或外周血得到的表達(dá)人類全部HLA抗原的細(xì)胞或細(xì)胞株(培養(yǎng)、擴(kuò)增后)，混合或分別用無菌雙蒸水37℃溫育0.5～2h，使細(xì)胞充分破碎，然后用低溫高速離心機(jī)3000g～10000g 20分鐘離心沉淀細(xì)胞膜，倒掉上清，把沉淀凍干備用，使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋即可得到單一的或混合的HLA顆?？乖瑢?shí)際上是脂質(zhì)體上攜帶HLA抗原，其稀釋濃度視實(shí)驗(yàn)要求而定。
6.本發(fā)明所使用的HLA抗原除上述的顆?？乖膺€可以是可溶性抗原，這些抗原可以通過如下方式得到方法2所構(gòu)建的HLA抗原表達(dá)載體可以在培養(yǎng)的人細(xì)胞中表達(dá)也可以在原核細(xì)胞或其它真核細(xì)胞(如酵母菌)中表達(dá)，不論以什么方式表達(dá)的HLA抗原均可經(jīng)10％甲醛固定洗滌后直接作為抗原使用，也可通過常規(guī)親和層析方法(如用抗β2微球蛋白抗體、抗HLA一類抗原或二類抗原單態(tài)抗體制備親和層析柱)或其它蛋白純化技術(shù)進(jìn)行純化，得到HLA抗原分子純品進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)用。
7.病原微生物特異性抗原的制備各種病原體如麻疹病毒、水痘病毒、結(jié)核桿菌等均可參考《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》(薛慶善主編，科學(xué)出版社出版，2001年第一版)；《診斷與實(shí)驗(yàn)病毒學(xué)》(鄭州大學(xué)出版社出版，2002年第一版，楊占秋、劉建軍、肖紅、丁曉華主編)；《醫(yī)用實(shí)驗(yàn)病毒學(xué)》(杜平主編，人民軍藝出版社出版，1985年第一版)；參考《現(xiàn)代結(jié)核病學(xué)》(人民軍醫(yī)出版社，2000年第一版，張敦熔主編)等資料，按各種微生物各自不同的生長繁殖特點(diǎn)在動(dòng)物體內(nèi)或體外培養(yǎng)，并按它們各自不同的方法使之純化，從而得到這些病原體的純品或相對純品，這些相對純化的病原體經(jīng)用60CO照射、0.1-10％甲醛、戊二醛、非離子去垢劑或脂溶劑如乙醚、氯仿處理等方法使之滅活后即可作為抗原使用。各種病原微生物的特異性抗原還可以是通過基因工程表達(dá)的這些病原微生物的特異性抗原，這些抗原可以表達(dá)在人類或動(dòng)物細(xì)胞上也可以表達(dá)在原核或真核細(xì)胞上，這些細(xì)胞可以直接作抗原用也可通過親和層析或其它蛋白純化技術(shù)把這些病原微生物特異性抗原純化后使用。
8.本發(fā)明所使用的抗原還可以是異種抗原，如人類異種移植的合適供體豬(包括各種轉(zhuǎn)基因豬，近交系豬等)的抗原，或小鼠抗原、大鼠抗原、豚鼠抗原等，其抗原也可用上述方法建立它們各自的細(xì)胞系，從而作為異種移植時(shí)的檢測抗原。
本發(fā)明所使用抗原范圍較廣，所有外來的、能引起機(jī)體淋巴細(xì)胞特異性活化的物質(zhì)均可用作本發(fā)明的抗原，從而檢測機(jī)體是否存在被這些抗原特異性活化的淋巴細(xì)胞。
通過上述方法或其它方法得到的單一的或混合的抗原，顆粒性抗原或可溶性抗原，同種異體抗原或異種抗原，人類HLA抗原或小鼠、大鼠、豬等動(dòng)物抗原或細(xì)菌、病毒等病原微生物抗原及人類使用的各種疫苗抗原，只要是能引起機(jī)體特異性淋巴細(xì)胞活化的抗原均可作為檢測抗原，用以檢測機(jī)體內(nèi)是否存在抗原相應(yīng)的特異性活化淋巴細(xì)胞。
通過上述方法得到的，表達(dá)在人類或動(dòng)物細(xì)胞上的抗原或表達(dá)在細(xì)菌細(xì)胞壁或病毒包膜或衣殼上的抗原，需經(jīng)絲裂霉素或經(jīng)過0.1-10％甲醛或非離子去垢劑及脂溶劑如丙酮、二甲苯、氯仿等處理滅活后尚可作為檢測抗原使用，特殊情況下亦可不經(jīng)處理直接使用。經(jīng)親合層析或其它蛋白質(zhì)純化方法得到的較純的純化蛋白質(zhì)抗原(可溶性抗原)及脂質(zhì)體上吸附的目的抗原可直接作為檢測抗原使用。
經(jīng)無菌操作得到上述各種抗原后，即可把這些抗原分別或混合搭配(根據(jù)不同目的進(jìn)行各種搭配)后，與用常規(guī)淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞的方法得到的機(jī)體外周血單個(gè)核細(xì)胞一起培養(yǎng)。其稀釋單個(gè)核細(xì)胞及抗原的培養(yǎng)液中，除常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)需添加的小牛或胎牛血清(也可用商品化的無血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng))外還需添加免疫抑制劑和/或抗癌藥和細(xì)胞因子活性中和抗體和/或細(xì)胞增殖抑制性細(xì)胞因子。這些免疫抑制劑和抗癌藥包括普樂可復(fù)(FK506)、環(huán)孢素系列如環(huán)孢霉素A、C、環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、雷帕霉素、RS-61443(mycophenolate mofetil，MM，分子式為C24H11NCLO7)(是霉酚酸mycophenolicacid，MPA(分子式為C17H11O6)的一種酯類衍生物)、BQR(6-氟-2-3甲基-4-喹啉酸)、脫氧精胍菌素、人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株JM分泌的免疫抑制因子、腎上腺皮質(zhì)激素(如甲基強(qiáng)的松龍、強(qiáng)的松、氫化可的松、地塞米松等)、拓?fù)涿敢种苿如喜樹堿(CAM)、依托泊甙(VP-16)]、烷化劑[如順鉑、氮芥、美法蘭、本丁酸氮芥、卡氮芥等]，抗代謝藥[甲氨蝶呤、阿糖胞苷、胸苷酸合成酶抑制劑雙氮四氫葉酸等]，維甲類化合物-維生素A衍生物[如全反式維甲酸、棕櫚酸視黃質(zhì)、4-N-羥基苯維甲氨]及其它一些潛在的具有誘導(dǎo)免疫抑制作用或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的藥物。前面所述各種抗原的作用在于抑制其特異性活化淋巴細(xì)胞的活性或誘導(dǎo)其特異性活化淋巴細(xì)胞的凋亡，后面所述這些藥物的作用在于使實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確、敏感、陰陽性結(jié)果對比明顯。
培養(yǎng)液中各種免疫抑制劑和抗癌藥的使用劑量不盡相同，需根據(jù)各藥的特點(diǎn)及生產(chǎn)廠家不同調(diào)整控制它們的濃度，一般在它們的說明書中最低血藥維持濃度(谷值)的上下1000倍左右(其劑量范圍大致為 0.001ng-100μg/ml)，如FK506的劑量范圍為0.001ng-10μg/ml(最適使用范圍0.01ng-100ng/ml)，環(huán)孢霉素A的劑量范圍為0.01ng-10μg/ml(最適使用范圍0.1ng-1μg/ml)，其使用濃度以該藥能達(dá)到使檢查結(jié)果，重復(fù)性好的最低濃度為其合適濃度。免疫抑制劑或抗癌藥的選用，可根據(jù)情況選其中的一種單獨(dú)使用或幾種混合應(yīng)用。
對細(xì)胞增殖具有刺激活性的細(xì)胞因子的中和抗體，包括白介素1、2、4、3、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23，干擾素(-α、β、w、γ)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干細(xì)胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、神經(jīng)生長因子(NGF)等所有對淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等單個(gè)核細(xì)胞具有促進(jìn)活化和增殖作用的細(xì)胞因子的中和抗體，及一些對淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等單個(gè)核細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡、抑制活化和抑制增殖作用的細(xì)胞因子如IL-2、IL-4、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、干擾素γ、腫瘤壞死因子(TNF)等。
中和抗體這里是指對細(xì)胞因子生物學(xué)活性具有抑制作用的抗體。其意義在于對一些具有刺激細(xì)胞活化增殖作用的細(xì)胞因子的生物學(xué)活性進(jìn)行抑制，使其不能發(fā)揮生物學(xué)作用。
這些中和抗體和抑制性細(xì)胞因子的作用在于協(xié)助特異性抗原對特異性活化淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)特異性抑制，即和特異性抗原共同作用可抑制抗原特異性活化淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞等的細(xì)胞活性，由于不同細(xì)胞因子在其中的作用不同，不同單位生產(chǎn)的同一細(xì)胞因子或細(xì)胞因子中和抗體的活性單位或效價(jià)不同等原因，其培養(yǎng)液中的中和抗體的終濃度差別也很大，可在1μg～10mg/ml之間的任一濃度，以使檢測結(jié)果最敏感、重復(fù)性最好時(shí)的濃度為其合適的濃度；抑制性細(xì)胞因子使用濃度以其活性單位計(jì)算，一般終濃度應(yīng)在0.01～1000個(gè)活性單位/ml，(常常在0.1-50個(gè)活性單位/ml)，以使檢測結(jié)果達(dá)到最敏感、準(zhǔn)確時(shí)的濃度為其合適濃度。
上述免疫抑制劑、細(xì)胞因子活性中和抗體及具有抑制淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞活性的細(xì)胞因子種類均較多，其作用也較復(fù)雜，檢測時(shí)可選擇其中的一種或幾種搭配使用，其各種組合不受限制，以能使檢測敏感、準(zhǔn)確、重復(fù)性好為標(biāo)準(zhǔn)。
上述通過各種方法得到的目的抗原、無關(guān)對照抗原及用淋巴細(xì)胞分離液分離的單個(gè)核細(xì)胞，用含合適濃度合理搭配的免疫抑制劑和抗癌藥、細(xì)胞因子中和抗體或/和抑制性細(xì)胞因子的細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至合適的濃度。
用攜帶目的抗原的細(xì)胞作抗原時(shí)，如方法1、2、3、4得到的抗原，抗原細(xì)胞的濃度約為0.01～10×106/ml，被檢者單個(gè)核細(xì)胞濃度約為0.1-5×106/ml，優(yōu)選前者為1-2×106/ml左右，后者為1-3×106/ml左右。若為可溶性純化抗原，其特異性目的抗原的濃度(不包括非特異性蛋白)，約為0.1μg/ml-10mg/ml。方法5所得到的抗原的使用濃度，約為0.1-100×106個(gè)細(xì)胞破碎后的細(xì)胞膜稀釋至1ml使用液，一般為1-10×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞膜抗原稀釋至1ml。方法6、7所得到的抗原一般以目的抗原計(jì)算，使用液配為0.1μg-10mg/ml。
把上述稀釋至合適濃度的目的抗原和無關(guān)陰性對照抗原分別與待檢的單個(gè)核細(xì)胞樣品，滴入合適的細(xì)胞培養(yǎng)板中混合培養(yǎng)，每孔加抗原和待檢細(xì)胞各100μl，放37℃的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，在本發(fā)明方法所提供的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中，待檢樣品中的活化淋巴細(xì)胞在遇到其特異性抗原時(shí)，這些活化淋巴細(xì)胞的活性將被明顯抑制，在細(xì)胞培養(yǎng)5～72小時(shí)，一般為24小時(shí)后對試驗(yàn)孔和無關(guān)抗原對照孔及不加抗原的單獨(dú)待檢單個(gè)核細(xì)胞孔的細(xì)胞活性進(jìn)行檢測，根據(jù)各孔細(xì)胞活性的變化，即可判定待檢單個(gè)核細(xì)胞中有無已知抗原對應(yīng)的活化淋巴細(xì)胞。其細(xì)胞活性的檢測方法有兩種，一種是直接法，一種是間接法前一種是直接給各孔添加某種物質(zhì)，根據(jù)各孔細(xì)胞對這種物質(zhì)的清除能力(阻止該物質(zhì)如伊紅、臺盼蘭、曙紅進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的能力)或轉(zhuǎn)化能力(如轉(zhuǎn)化可溶性MTT為甲

類結(jié)晶的能力)等作為可檢測信號來評價(jià)各孔細(xì)胞的活性；后一種是根據(jù)本方法的反應(yīng)原理，選擇合適的檢測方法和可檢測信號，如細(xì)胞活性的降低為細(xì)胞凋亡所致，則參考《細(xì)胞凋亡的分子醫(yī)學(xué)》(胡野、凌志強(qiáng)、單小云編著，2002年8月軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社出版)，就使用細(xì)胞凋亡的各種判定方法作為可檢測信號，根據(jù)凋亡細(xì)胞的多少，反推各孔細(xì)胞活性的變化。
本發(fā)明中的可檢測信號是指通過某種方法，或添加某種物質(zhì)，使實(shí)驗(yàn)孔中待檢單個(gè)核細(xì)胞的反應(yīng)變化結(jié)果直觀地或通過儀器設(shè)備呈現(xiàn)出來的信號，也就是待檢單個(gè)核細(xì)胞的反應(yīng)變化結(jié)果的顯示(展示)方式。本發(fā)明的可檢測信號主要有以下幾種 1、給各孔添加MTT，觀察各組細(xì)胞轉(zhuǎn)化可溶性MTT為甲

類結(jié)晶的量，從而了解各組細(xì)胞活性增強(qiáng)或減弱等變化的大小。
2、參考《細(xì)胞凋亡的分子醫(yī)學(xué)》(胡野、凌志強(qiáng)、單小云編著，2002年8月軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社出版)，根據(jù)本發(fā)明方法的反應(yīng)原理，通過蘇木素-伊紅染色法，甲基綠-派諾寧染色法，姬姆薩染色法，瑞氏染色法對各組細(xì)胞進(jìn)行染色后放顯微鏡下直接觀察，根據(jù)凋亡細(xì)胞的特征性變化，計(jì)數(shù)比較各組細(xì)胞發(fā)生凋亡的比率。
3、參考《細(xì)胞凋亡的分子醫(yī)學(xué)》(胡野、凌志強(qiáng)、單小云編著，2002年8月軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社出版)，根據(jù)本發(fā)明方法的反應(yīng)原理，通過用丫啶橙(Acridine orange)、碘化丙啶、溴化乙啶、羅丹名123、異硫氰酸熒光素(標(biāo)記抗體)等標(biāo)記各組細(xì)胞，根據(jù)凋亡細(xì)胞的特征性變化，在熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞發(fā)生凋亡的多少。
4、參考《細(xì)胞凋亡的分子醫(yī)學(xué)》(胡野、凌志強(qiáng)、單小云編著，2002年8月軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社出版)，根據(jù)本發(fā)明方法的反應(yīng)原理，利用抗組蛋白抗體和抗DNA抗體，通過細(xì)胞凋亡的酶聯(lián)免疫分析方法，檢測各組細(xì)胞由于細(xì)胞凋亡所形成的斷裂的單鏈或雙聯(lián)DNA的多少，從而推測各組細(xì)胞發(fā)生凋亡的多少。
MTT方法和細(xì)胞凋亡檢測方法之間相互的對應(yīng)關(guān)系是MTT方法是利用活細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化可溶性MTT為藍(lán)紫色甲

類結(jié)晶物質(zhì)的原理(死細(xì)胞不具有這種能力)，檢測各組細(xì)胞中活細(xì)胞的活性，活細(xì)胞越多、細(xì)胞活性越強(qiáng)可溶性MTT轉(zhuǎn)化為藍(lán)紫色甲

類結(jié)晶物質(zhì)的量越多；細(xì)胞凋亡檢測方法檢測的是各組細(xì)胞的凋亡情況-即死細(xì)胞的多少；在試驗(yàn)中各組加入的待檢活細(xì)胞是一定的，各組中待檢細(xì)胞發(fā)生凋亡的多，則其中的活細(xì)胞就少，轉(zhuǎn)化可溶性MTT為藍(lán)紫色甲

類結(jié)晶物質(zhì)的量就少，反之，則轉(zhuǎn)化可溶性MTT為藍(lán)紫色甲

類結(jié)晶物質(zhì)的量就大。
通過以上分析，雖然本發(fā)明方法的試驗(yàn)結(jié)果可以通過多種方法和形式，轉(zhuǎn)化成各種可檢測信號，但本發(fā)明經(jīng)過比較認(rèn)為，四唑鹽比色是其中最方便和敏感的試驗(yàn)結(jié)果顯示方法。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后給各孔加四唑鹽(MTT 5mg/ml)10-20μl，繼續(xù)放37℃的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)0.5-6h，一般為1-2h，其結(jié)果可以放倒置顯微鏡下直接觀察各孔轉(zhuǎn)化黃色可溶性MTT為藍(lán)紫色甲

類結(jié)晶物質(zhì)的量。也可以在培養(yǎng)結(jié)束后除去各孔的培養(yǎng)上清，然后每孔加二甲基亞砜(DMSO)100-150μl輕輕振蕩5分鐘，令甲

類結(jié)晶充分溶解后，用酶標(biāo)儀在490nm-590nm之間選一具有最大吸光值的波長測各孔吸光值，一般用550nm，比較實(shí)驗(yàn)孔與陰性對照孔之間的差異，從而了解待測樣品中有無已知目的抗原特異性活化淋巴細(xì)胞的存在，本發(fā)明的陰性對照孔還包括不加任何抗原的、只含有待檢細(xì)胞的孔。

具體實(shí)施例方式 下述實(shí)施例是為了更好的解釋本發(fā)明的目的，而不應(yīng)被理解限制本 發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 作為抗原的細(xì)胞的制備在心臟移植時(shí)，無菌操作取供體脾臟，用200目研磨網(wǎng)研磨供者脾細(xì)胞，用無血清1640培養(yǎng)液(GIBCO公司)1500rpm洗滌兩次，去上清，沉淀用無血清1640培養(yǎng)液制成約1×108個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，用常規(guī)人淋巴細(xì)胞分離液(GIBCO公司)分離單個(gè)核細(xì)胞，2000rpm水平離心機(jī)離心20分鐘，吸取分離液與1640培養(yǎng)液界面上的細(xì)胞層細(xì)胞移入另一無菌離心管，無血清1640培養(yǎng)液，1500rpm、1000rpm離心洗滌兩次，去上清(若有紅細(xì)胞則用37～40℃預(yù)溫的0.83％NH4Cl溶液懸起，37～40℃水浴處理10分鐘，然后再用無血清1640培養(yǎng)液1000rpm離心洗滌2次)，沉淀用含絲裂霉素(Sigma公司)25μg/ml的無血清1640培養(yǎng)液制成約1×107個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，37℃水浴作用30分鐘，1000rpm離心10分鐘棄上清，沉淀細(xì)胞用無血清1640培養(yǎng)液1000rpm離心洗3次，沉淀用細(xì)胞凍存液(按《實(shí)用單克隆抗體技術(shù)》徐志凱主編，陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1992年第一版中的配方制備)制成約2×107個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，分裝入凍存管內(nèi)，-70℃冰箱或液氮中凍存?zhèn)溆谩?br> 純化白細(xì)胞介素-2中和單抗(第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室生產(chǎn))，用PBS溶液配成4mg/ml，一次性針頭濾器除菌分裝，-20℃凍存?zhèn)溆?；四氮唑鹽(MTT，Sigma產(chǎn)品)用生理鹽水制成5mg/ml的使用液，一次性針頭濾器過濾除菌，分裝，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 待檢活化淋巴細(xì)胞的制備心臟移植后不同時(shí)間(一般在心臟移植后3-5天即可有抗供體活化淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，故在心臟移植3-5天后即可開始檢測)，抽取受者靜脈血5-10ml，按上述方法分離單個(gè)核細(xì)胞，用無血清1640培養(yǎng)液離心洗滌2次，沉淀用含20％胎牛血清(GIBCO公司)的1640培養(yǎng)液(其中每ml含F(xiàn)K506 0.125ng，甲基強(qiáng)的松龍5μg)，制成約2×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液備用。在制備活化淋巴細(xì)胞的同時(shí)，復(fù)蘇凍存的供者脾細(xì)胞，然后用無血清1640培養(yǎng)液1000rpm離心洗滌一次，沉淀用上述含20％胎牛血清和免疫抑制劑的1640培養(yǎng)液制成2×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液備用。
分別把供、受體細(xì)胞，IL-2中和單抗按以下分組及用量加入96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中；A.受體細(xì)胞100μl+供體細(xì)胞100μl；B.受體細(xì)胞100μl+供體細(xì)胞100μl+IL-2中和單抗20μl；C.受體細(xì)胞100μl+IL-2中和單抗20μl+稀釋細(xì)胞用的1640培養(yǎng)液100μl；D.受體細(xì)胞100μl+稀釋細(xì)胞用的1640培養(yǎng)基100μl。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。上述操作完成后把培養(yǎng)板放37℃的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。
MTT顯色法在上述細(xì)胞培養(yǎng)20-24h后每孔加入MTT 10μl，繼續(xù)培養(yǎng)0.5-4h后可以于倒置顯微鏡下直接觀察各孔黃色水溶性MTT轉(zhuǎn)化為藍(lán)紫色甲

類結(jié)晶物質(zhì)的量，也可以先除去各孔培養(yǎng)液，每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕震蕩5分鐘，使甲

類結(jié)晶物質(zhì)充分溶解后，用酶標(biāo)儀測各孔吸光值，參考波長范圍為490nm-590nm，最佳為550nm。
結(jié)果與混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)和預(yù)處理淋巴細(xì)胞分型試驗(yàn)正好相反，當(dāng)受體體內(nèi)有激活的抗供體淋巴細(xì)胞存在(活檢證實(shí)有排斥反應(yīng)發(fā)生)時(shí)，A組和B組反應(yīng)明顯減弱，尤其是B組細(xì)胞處理MTT的能力幾乎被完全抑制，而C組和D組則差別不大均較強(qiáng)，或C組比D組稍減弱。
判定標(biāo)準(zhǔn) 一、倒置顯微鏡下直接觀察有排斥反應(yīng)發(fā)生時(shí)A、B兩組與C、D兩組相比，細(xì)胞活性明顯減弱，尤其是B組，細(xì)胞活性可完全被抑制，A組細(xì)胞活性減弱的程度可能與排斥反應(yīng)強(qiáng)弱有關(guān)，排斥反應(yīng)越強(qiáng)減弱越明顯，排斥反應(yīng)弱時(shí)，A組與C、D組比活性減弱不明顯；但只要有排斥反應(yīng)，B組細(xì)胞活性就會(huì)比C組明顯減弱。無排斥反應(yīng)各組細(xì)胞活性無明顯差別或C、B組均較弱，有時(shí)C更弱。無排斥反應(yīng)但最近或目前正在發(fā)生細(xì)菌或病毒感染各組細(xì)胞活性均較強(qiáng)，各組之間亦無明顯差別，或C組稍減弱。最近或目前正在發(fā)生細(xì)菌或病毒感染，同時(shí)有排斥反應(yīng)發(fā)生A組或有減弱，B組的細(xì)胞活性比C組及A、D組的細(xì)胞活性明顯減弱。D組的細(xì)胞活性很強(qiáng)。
二、酶標(biāo)儀測各孔吸光值 細(xì)胞培養(yǎng)20-24小時(shí)后加MTT，每孔10μl，繼續(xù)培養(yǎng)0.5-1.5小時(shí)后吸去每孔的培養(yǎng)液，每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕震蕩5分鐘，使甲

類結(jié)晶物質(zhì)充分溶解后，用酶標(biāo)儀測各孔吸光值，參考波長為550nm，以只加150μl二甲基亞砜(DMSO)的無細(xì)胞孔為調(diào)零孔。以B組平均OD值小于70％C組平均OD值為陽性，等于70％-90％C組平均OD值為可疑陽性。
結(jié)果通過用本方法對15例心臟移植患者進(jìn)行跟蹤監(jiān)測100余人次，活檢對照56例次，本試驗(yàn)檢測結(jié)果陽性29例次，其中活檢證實(shí)18例次無癥狀排斥反應(yīng)，其中4例次為III級排斥反應(yīng)，5例次為II級排斥反應(yīng)，9例次為I級排斥反應(yīng)。另有11例次活檢結(jié)果雖不正常但達(dá)不到I級排斥反應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)。27例次本試驗(yàn)結(jié)果陰性者活檢均為陰性。
表1 活檢陽性 陰性 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果 陽性 18 11 陰性 0 27 兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的一致性為80.3％，特異性為71％，敏感性100％。
說明本發(fā)明特異性較低的主要原因是因?yàn)槠涿舾行愿?，就上表?1例假陽性結(jié)果的活檢片子看雖達(dá)不到I級排斥反應(yīng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但也不是完全正常，也許是活檢本身如前所述反映情況不全面的原因，加上人看片子的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不致所致。
測試結(jié)果說明對每個(gè)心臟移植患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，其監(jiān)測結(jié)果與活檢病理結(jié)果進(jìn)行對照。
真陽性(TP)本方法為陽性，活檢證實(shí)發(fā)生了I級以上排斥反應(yīng)。
真陰性(TN)本方法為陰性，活檢證實(shí)無排斥反應(yīng)發(fā)生。
假陽性(FP)本方法為陽性，活檢證實(shí)無排斥反應(yīng)發(fā)生。
假陰性(FN)本方法為陰性，活檢證實(shí)發(fā)生了I級以上排斥反應(yīng)。
一致性＝(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN) 特異性＝TN/(TN+FP) 敏感性＝TP/(TP+FN) 排斥反應(yīng)的發(fā)生首先開始于淋巴細(xì)胞的活化，活化淋巴細(xì)胞的出現(xiàn)應(yīng)早于病理改變。本方法主要側(cè)重于檢測患者外周血中有無供體抗原特異性的活化淋巴細(xì)胞。本試驗(yàn)的結(jié)果可能早于活檢病理改變，這將使我們有可能在移植器官受到損害，器官出現(xiàn)病理改變前發(fā)現(xiàn)并預(yù)測排斥反應(yīng)的發(fā)生。這可能就是所謂的假陽性產(chǎn)生的原因。
實(shí)施例2 刺激抗原的制備參考《現(xiàn)代結(jié)核病學(xué)》(人民軍醫(yī)出版社，2000年第一版，張敦熔主編)一書，用國內(nèi)外廣泛使用的，已商品化的固體或液體培養(yǎng)基(例如國內(nèi)外廣泛使用的固體培養(yǎng)基Lowenstein-Jensen(L-J)，小川等的雞蛋培養(yǎng)基和Middlebrook 7H10、7H11等瓊脂培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基Middlebrook 7H9、Sauton等)，從結(jié)核病人上呼吸道分泌物中分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增結(jié)核桿菌，用生理鹽水10000rpm低溫離心洗滌一次，沉淀用4℃冷丙酮懸起，4℃處理30-60分鐘，用生理鹽水10000rpm低溫離心洗滌二次，沉淀用10％甲醛懸起，4℃處理過夜，10000rpm低溫離心20分鐘，沉淀用無血清1640培養(yǎng)液10000rpm離心洗3次，沉淀用含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液(其中每ml含F(xiàn)K5060.125ng，甲基強(qiáng)的松龍5μg)制成約2×108個(gè)細(xì)菌/ml的細(xì)菌懸液，分裝入凍存管內(nèi)，-70℃冰箱或液氮中凍存?zhèn)溆谩?br> 純化白細(xì)胞介素-2中和單抗及四氮唑鹽的制備如實(shí)施例1。
待檢活化淋巴細(xì)胞的制備抽取可疑結(jié)核病患者靜脈血5-10ml，按實(shí)施例1的方法分離單個(gè)核細(xì)胞，用無血清1640培養(yǎng)液洗滌2次，沉淀用含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液(其中每ml含F(xiàn)K506 0.125ng，甲基強(qiáng)的松龍5μg)，制成約2×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液備用。在制備活化淋巴細(xì)胞的同時(shí)，復(fù)蘇凍存的結(jié)核桿菌抗原，然后用上述含20％胎牛血清和免疫抑制劑的1640培養(yǎng)液制成的2×107個(gè)細(xì)菌/ml的細(xì)菌懸液備用。
分別把患者單個(gè)核細(xì)胞懸液、細(xì)菌懸液、IL-2中和單抗按以下分組及用量加入96孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中；A.患者細(xì)胞100μl+細(xì)菌懸液100μl；B.患者細(xì)胞100μl+細(xì)菌懸液100μl+IL-2中和單抗35μl；C.患者細(xì)胞100μl+IL-2中和單抗35μl+稀釋細(xì)胞用的1640培養(yǎng)液100μl；D.患者細(xì)胞100μl+稀釋細(xì)胞用的1640培養(yǎng)基100μI。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。上述操作完成后把培養(yǎng)板放37℃的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。
MTT顯色法在上述細(xì)胞培養(yǎng)20-24h后加入MTT每孔10μl，繼續(xù)培養(yǎng)0.5-4h后可以于倒置顯微鏡下直接觀察各孔黃色水溶性MTT轉(zhuǎn)化為藍(lán)紫色甲

類結(jié)晶物質(zhì)的量，也可以先除去各孔培養(yǎng)液，每孔加100μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕震蕩5分鐘，使甲

類結(jié)晶物質(zhì)充分溶解后，用酶標(biāo)儀測各孔吸光值，參考波長為490nm、570nm、630nm。結(jié)果當(dāng)受體體內(nèi)有激活的抗結(jié)核桿菌特異性活化淋巴細(xì)胞存在時(shí)，A組和B組反應(yīng)明顯減弱，尤其是B組細(xì)胞處理MTT的能力幾乎被完全抑制，而C組和D組則差別不大均很強(qiáng)，或C組比D組稍減弱。
判定標(biāo)準(zhǔn) 一、倒置顯微鏡下直接觀察有結(jié)核桿菌感染A、B兩組與C、D兩組相比，細(xì)胞活性明顯減弱，尤其是B組，細(xì)胞活性可完全被抑制，A組細(xì)胞活性減弱的程度可能與特異性活化淋巴細(xì)胞的多少有關(guān)，特異性活化淋巴細(xì)胞越多減弱越明顯，否則A組與C、D組比活性減弱不明顯；但只要有抗原特異性活化淋巴細(xì)胞，B組細(xì)胞活性就會(huì)比C組明顯減弱。無結(jié)核桿菌感染各組細(xì)胞活性無明顯差別或C、B組較弱無結(jié)核桿菌感染，但最近或目前正在發(fā)生其它細(xì)菌或病毒感染各組細(xì)胞活性均較強(qiáng)，各組之間亦無明顯差別，或C組稍減弱。最近或目前正在發(fā)生細(xì)菌或病毒感染，同時(shí)有結(jié)核桿菌感染A組或有減弱，B組的細(xì)胞活性比C組及A、D組的細(xì)胞活性明顯減弱。A、C、D組細(xì)胞活性均很強(qiáng)。
二、酶標(biāo)儀測各孔吸光值 細(xì)胞培養(yǎng)20-24小時(shí)后加MTT，每孔10μl，繼續(xù)培養(yǎng)1-2h后吸去每孔的培養(yǎng)液，每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕震蕩5分鐘，使甲

類結(jié)晶物質(zhì)充分溶解后，用酶標(biāo)儀測各孔吸光值，參考波長為550nm，以只加150μl二甲基亞砜(DMSO)的無細(xì)胞孔為調(diào)零孔。以B組平均OD值小于60％C組平均OD值為陽性，等于60％-80％C組平均OD值為可疑陽性。
測試結(jié)果說明用本法對患者進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果可與結(jié)核常用臨床診斷方法的結(jié)果進(jìn)行對照。
真陽性(TP)本方法為陽性，培養(yǎng)、PCR等方法中有一個(gè)為陽性 真陰性(TN)本方法為陰性，培養(yǎng)、PCR等方法均為陰性。
假陽性(FP)本方法為陽性，培養(yǎng)、PCR等方法均為陰性。
假陰性(FN)本方法為陰性，培養(yǎng)、PCR等方法中有一個(gè)為陽性。
一致性＝(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN) 特異性＝TN/(TN+FP) 敏感性＝TP/(TP+FN) 結(jié)核桿菌進(jìn)入機(jī)體后，首先活化體內(nèi)的淋巴細(xì)胞，活化淋巴細(xì)胞的出現(xiàn)應(yīng)早于臨床癥狀的出現(xiàn)。本方法主要側(cè)重于檢測患者外周血中有無結(jié)核桿菌抗原特異性的活化淋巴細(xì)胞。本試驗(yàn)的結(jié)果可能有利于結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療。
實(shí)施例3 排斥反應(yīng)監(jiān)測抗原板的制備通過用前述抗原制備方法1，4所得到的，分別表達(dá)不同同種異體抗原的細(xì)胞系(例如Raji細(xì)胞)，通過培養(yǎng)擴(kuò)增后，用無血清1640培養(yǎng)液1500rpm洗滌兩次，去上清，沉淀用10％甲醛或多聚甲醛溶液，制成約1×108個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，4℃處理過夜后，用無血清1640培養(yǎng)液，1000rpm離心洗滌3次，去上清，沉淀用細(xì)胞凍存液(見實(shí)施例1)，制成約2×107個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，然后分別把這些表達(dá)不同同種異體抗原的細(xì)胞加入96孔U形底或圓底細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中，每孔10μl，使培養(yǎng)板中的細(xì)胞包含人類大部甚至全部的同種異體抗原。各孔包含哪一個(gè)或那幾個(gè)同種異體抗原都是已知的，不表達(dá)人類同種異體抗原的細(xì)胞如U973，K562等作為陰性對照細(xì)胞；另設(shè)3個(gè)只加待檢細(xì)胞的孔亦作陰性對照。加入抗原細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板即可做為排斥反應(yīng)監(jiān)測抗原板，-70℃冰箱或液氮中凍存?zhèn)溆谩?br> 純化白細(xì)胞介素-2中和單抗及四氮唑鹽的制備如實(shí)施例1。
待檢活化淋巴細(xì)胞的制備器官移植后不同時(shí)間，抽取受者靜脈血25ml，按上述方法分離單個(gè)核細(xì)胞，用無血清1640培養(yǎng)液洗滌2次，沉淀用含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液(其中每ml含F(xiàn)K506 0.0625ng，甲基強(qiáng)的松龍2.5μg，純化白細(xì)胞介素-2中和單抗約60μg)，制成約2×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液備用。
把待檢單個(gè)核細(xì)胞懸液分別加入上述已制備好的排斥反應(yīng)監(jiān)測抗原板各孔中，每孔100μl，操作完成后把培養(yǎng)板放37℃的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。
MTT顯色法在上述細(xì)胞培養(yǎng)20-24h后加入MTT每孔10μl，繼續(xù)培養(yǎng)0.5-4h后可以于倒置顯微鏡下直接觀察各孔黃色水溶性MTT轉(zhuǎn)化為藍(lán)紫色甲

類結(jié)晶物質(zhì)的量，也可以先除去各孔培養(yǎng)液，每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕震蕩5分鐘，使甲

類結(jié)晶物質(zhì)充分溶解后，用酶標(biāo)儀測各孔吸光值，參考波長為490nm-630nm。
判定標(biāo)準(zhǔn) 一、倒置顯微鏡下直接觀察 已知患者供體同種異體抗原時(shí)，首先找出含供者抗原的孔中處理MTT的能力明顯減弱的孔，然后再找出不含該患者供體同種異體抗原的孔中處理MTT的能力最弱的孔與之比較，若前者比后者處理MTT的能力明顯減弱則說明有排斥反應(yīng)發(fā)生；否則則無排斥反應(yīng)發(fā)生。
不知患者供體同種異體抗原時(shí)，首先找出含同種異體抗原的孔中處理MTT的能力明顯減弱的孔，然后與陰性對照孔中處理MTT的能力最弱的孔進(jìn)行比較，若前者比后者處理MTT的能力明顯減弱則說明有排斥反應(yīng)發(fā)生；否則則無排斥反應(yīng)發(fā)生。
二、酶標(biāo)儀測各孔吸光值 細(xì)胞培養(yǎng)20-24小時(shí)后加MTT，每孔10μl，繼續(xù)培養(yǎng)1-2h后吸去每孔的培養(yǎng)液，每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕震蕩5分鐘，使甲

類結(jié)晶物質(zhì)充分溶解后，用酶標(biāo)儀測各孔吸光值，參考波長為490nm，以只加150μl二甲基亞砜(DMSO)的無細(xì)胞孔為調(diào)零孔。以含抗原孔中有單孔OD值小于陰性對照孔中最低OD值孔的60％時(shí)為陽性，等于陰性對照孔中最低OD值孔的60％-80％為可疑陽性。
結(jié)果通過對15例心臟移植患者進(jìn)行跟蹤監(jiān)測100余人次，發(fā)現(xiàn)14例次無癥狀排斥反應(yīng)，活檢證實(shí)其中4例次為III級排斥反應(yīng)，2例次為II級排斥反應(yīng)，8例次為I級排斥反應(yīng)。
測試結(jié)果說明對每個(gè)心臟移植患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，其監(jiān)測結(jié)果與活檢病理結(jié)果進(jìn)行對照。
真陽性(TP)本方法為陽性，活檢證實(shí)發(fā)生了I級以上排斥反應(yīng)。
真陰性(TN)本方法為陰性，活檢證實(shí)無排斥反應(yīng)發(fā)生。
假陽性(FP)本方法為陽性，活檢證實(shí)無排斥反應(yīng)發(fā)生。
假陰性(FN)本方法為陰性，活檢證實(shí)發(fā)生了I級以上排斥反應(yīng)。
一致性＝(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN) 特異性＝TN/(TN+FP) 敏感性＝TP/(TP+FN) 實(shí)施例4 病原微生物抗原板的制備參考《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》(薛慶善主編，科學(xué)出版社出版，2001年第一版)；《診斷與實(shí)驗(yàn)病毒學(xué)》(鄭州大學(xué)出版社出版，2002年第一版，楊占秋、劉建軍、肖紅、丁曉華主編)；《醫(yī)用實(shí)驗(yàn)病毒學(xué)》(杜平主編，人民軍藝出版社出版，1985年第一版)等資料，按其上描述的各種病原微生物的培養(yǎng)、擴(kuò)增及提純方法，分別制備、純化各種細(xì)菌和病毒的特異性抗原，60Co照射滅火其中可能存在的活細(xì)菌或活病毒，然后把這些不同的細(xì)菌或病毒的特異性抗原用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)液(其中每ml含F(xiàn)K506 0.0125ng，甲基強(qiáng)的松龍0.5μg，純化白細(xì)胞介素-2中和單抗約90μg)稀釋至含目的抗原5mg/ml，然后分別把這些不同病原微生物的特異性抗原加入96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中，每孔100μl，使培養(yǎng)板中包含幾種甚至幾十種致病微生物的特異性抗原。各孔包含哪一個(gè)致病微生物的特異性抗原都是已知的，非致病微生物抗原如大腸桿菌等的抗原或其蛋白質(zhì)抗原如牛血清白蛋白等可以作為陰性對照；加入致病微生物的特異性抗原的細(xì)胞培養(yǎng)板即可做為病原微生物感染的檢測抗原板，-70℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?br> 純化白細(xì)胞介素-2中和單抗及四氮唑鹽的制備如實(shí)施例1。
待檢活化淋巴細(xì)胞的制備抽取患者靜脈血25ml，按上述方法分離單個(gè)核細(xì)胞，用無血清1640培養(yǎng)液洗滌2次，沉淀用含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液(其中每ml含F(xiàn)K506 0.0125ng，甲基強(qiáng)的松龍0.5μg，純化白細(xì)胞介素-2中和單抗約90μg)，制成約2×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液備用。
把待檢單個(gè)核細(xì)胞懸液分別加入上述已制備好的病原微生物感染檢測抗原板各孔中，每孔100μl，操作完成后把培養(yǎng)板放37℃的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。
MTT顯色法在上述細(xì)胞培養(yǎng)4-20h后加入MTT每孔20μl，繼續(xù)培養(yǎng)0.5-4h后可以于倒置顯微鏡下直接觀察各孔黃色水溶性MTT轉(zhuǎn)化為藍(lán)紫色甲

類結(jié)晶物質(zhì)的量，也可以先除去各孔培養(yǎng)液，每孔加100μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕震蕩5分鐘，使甲

類結(jié)晶物質(zhì)充分溶解后，用酶標(biāo)儀測各孔吸光值，參考波長為490nm、550nm、630nm。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體被某種病原微生物感染時(shí)，檢測板中含相應(yīng)病原微生物抗原的孔內(nèi)的細(xì)胞處理MTT的能力明顯減弱，甚至被完全抑制。
判定標(biāo)準(zhǔn) 一、倒置顯微鏡下直接觀察 首先找出含病原微生物抗原的孔中處理MTT的能力明顯減弱的孔，然后與陰性對照孔中處理MTT的能力最弱的孔進(jìn)行比較，若前者比后者處理MTT的能力明顯減弱則說明有該病原微生物感染；否則則無該病原微生物感染。
二、酶標(biāo)儀測各孔吸光值 細(xì)胞培養(yǎng)20-24小時(shí)后加MTT，每孔10μl，繼續(xù)培養(yǎng)1-2h后吸去每孔的培養(yǎng)液，每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕震蕩5分鐘，使甲

類結(jié)晶物質(zhì)充分溶解后，用酶標(biāo)儀測各孔吸光值，參考波長為550nm，以只加150μl二甲基亞砜(DMSO)的無細(xì)胞孔為調(diào)零孔。以含病原微生物抗原孔中有單孔OD值小于陰性對照孔中最低OD值孔的70％時(shí)為陽性，等于陰性對照孔中最低OD值孔的70％-90％為可疑陽性。
測試結(jié)果說明結(jié)果陽性，說明體內(nèi)有該孔抗原對應(yīng)的特異性活化淋巴細(xì)胞存在，即機(jī)體是被該特異性抗原對應(yīng)的病原微生物感染了。該結(jié)果可與病原微生物感染檢測的其它方法，如ELISA，PCR等方法進(jìn)行對照。
真陽性(TP)本方法為陽性，ELISA、PCR等方法中有一個(gè)為陽性。
真陰性(TN)本方法為陰性，ELISA、PCR等方法均為陰性。
假陽性(FP)本方法為陽性，ELISA、PCR等方法均為陰性。
假陰性(FN)本方法為陰性，ELISA、PCR等方法中有一個(gè)為陽性。
一致性＝(TP+TN)/(TP+TN+FP+FN) 特異性＝TN/(TN+FP) 敏感性＝TP/(TP+FN) 病原微生物進(jìn)入機(jī)體后，首先活化體內(nèi)的淋巴細(xì)胞，活化淋巴細(xì)胞的出現(xiàn)應(yīng)早于臨床癥狀的出現(xiàn)；本方法主要側(cè)重于檢測患者外周血中有無病原微生物抗原特異性的活化淋巴細(xì)胞；本試驗(yàn)的結(jié)果可能有利于傳染病的早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療，避免疾病的傳播和流行。
實(shí)施例5 純化白細(xì)胞介素-15中和單抗(第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室生產(chǎn))，用PBS溶液配成8mg/ml，一次性針頭濾器除菌分裝，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 除了用白細(xì)胞介素-15中和單抗代替白細(xì)胞介素-2中和單抗，以及用20μg氫化可的松代替5μg甲基強(qiáng)的松龍以外，重復(fù)實(shí)施例1的操作。
判定標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例1。
結(jié)果與實(shí)施例1比較無明顯差別。
實(shí)施例6 除了用強(qiáng)的松15μg代替5μg甲基強(qiáng)的松龍以外，重復(fù)實(shí)施例1的操作。
結(jié)果與實(shí)施例1對照無明顯差別。
實(shí)施例7 除了用實(shí)施例5中的白細(xì)胞介素-15中和單抗代替白細(xì)胞介素-2中和單抗，以及用每ml含125ng雷帕霉素和20μg地塞米松的含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液代替實(shí)施例1中的含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液(其中每ml含F(xiàn)K506 0.125ng，甲基強(qiáng)的松龍5μg)以外，重復(fù)實(shí)施例1的操作。
判定標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例1。
結(jié)果與實(shí)施例1比較無明顯差別。
實(shí)施例8 除了用實(shí)施例5中的白細(xì)胞介素-15代替白細(xì)胞介素-2，以及用每ml含12.5ng脫氧精胍菌素和5μg甲強(qiáng)龍的含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液代替實(shí)施例1中的含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液(其中每ml含F(xiàn)K506 0.125ng，甲基強(qiáng)的松龍5μg)以外，重復(fù)實(shí)施例1的操作。
判定標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例1。
結(jié)果與實(shí)施例1比較無明顯差別。
實(shí)施例9 排斥反應(yīng)檢測抗原板的制備 1.膜抗原的制備在心臟移植時(shí)，無菌操作取供體脾臟，用200目研磨網(wǎng)研磨供者脾細(xì)胞，用無血清1640培養(yǎng)液1500rpm洗滌兩次，去上清，沉淀用無血清1640培養(yǎng)液制成約1×108個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，用常規(guī)人淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，2000rpm水平離心機(jī)離心20分鐘，吸取分離液與1640培養(yǎng)液界面上的細(xì)胞層細(xì)胞移入另一無菌離心管，無血清1640培養(yǎng)液、1500rpm、1000rpm離心洗滌兩次，去上清(若有紅細(xì)胞則用37～40℃預(yù)溫的0.83％NH4Cl溶液懸起，37～40℃水浴處理10分鐘，然后再用無血清1640培養(yǎng)液1000rpm洗滌2次)，沉淀用滅菌蒸餾水制成約1×108個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，37℃水浴作用60分鐘，10000rpm離心10分鐘棄上清，沉淀細(xì)胞用二甲苯(乙醚、氯仿亦可)5-10ml懸起，充分震蕩5分鐘，溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)，然后加和上述滅菌蒸餾水等量的無血清1640培養(yǎng)液，在充分振搖5分鐘，1000rpm離心5分鐘，吸除上層二甲苯，另加新的二甲苯5-10ml，在充分振搖5分鐘，1000rpm離心5分鐘，吸除上層二甲苯，混勻下層水相的膜蛋白，分裝入凍存管內(nèi)，每管1ml，冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?br> 2.排斥反應(yīng)檢測抗原板的制備①取48或96孔可包抗原的細(xì)胞培養(yǎng)板或可用于細(xì)胞培養(yǎng)的酶標(biāo)板和抗人HLA I類分子單態(tài)抗體或β2微球蛋白抗體及抗人HLA II類抗原單態(tài)抗體(抗體均為第四軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室生產(chǎn)，或晶美公司生產(chǎn))；②用ELISA包被液分別稀釋上述抗體至4mg/ml，然后加入上述酶標(biāo)板或細(xì)胞培養(yǎng)板中，100μl/孔，4℃過夜(一般A、C、E、G排左邊六孔加HLA I類分子單態(tài)抗體或β2微球蛋白抗體，B、D、F、H排左邊六孔加抗人HLA II類抗原單態(tài)抗體)，第二天吸去包被液，無菌生理鹽水洗滌三次；③取上述凍干的膜蛋白，每管加無菌生理鹽水1ml混勻，上述包被抗體的孔每孔加0.1ml 4℃過夜，第二天吸去上清液，無菌生理鹽水洗滌三次；分別含供體HLA I類抗原和HLA II類抗原的檢測板就制備完成了；④板子除去洗滌液后晾干，-70℃凍存?zhèn)溆? 3.純化白細(xì)胞介素-2中和單抗及四氮唑鹽如實(shí)施例1所述制備。
4.待檢活化淋巴細(xì)胞的制備心臟移植一周后定期抽取受者靜脈血5-10ml，按上述方法分離單個(gè)核細(xì)胞，用無血清1640培養(yǎng)液洗滌2次，沉淀用含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液(其中每ml含F(xiàn)K506 0.125ng，甲基強(qiáng)的松龍5μg)，制成約2×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液備用。在制備活化淋巴細(xì)胞的同時(shí)，取上述制備好的分別含供體HLA I類抗原和HLAII類抗原的檢測板各一條(一條有6孔包了HLA I類抗原，6孔未包抗原；另一條有6孔包了HLA II類抗原，6孔未包抗原)，室溫下預(yù)溫待用。
分別把受體細(xì)胞，IL-2中和單抗按以下分組及用量加入96孔或48孔上述已制備好的排斥反應(yīng)抗原檢測板中；A.包HLA抗原孔+受體細(xì)胞100μl；B.包HLA抗原孔+受體細(xì)胞100μl+IL-2中和單抗45μl；C.未包HLA抗原孔+受體細(xì)胞100μl+IL-2中和單抗45μl；D.未包HLA抗原孔+受體細(xì)胞100μl；HLA I類抗原、II類抗原檢測板均按以上分組加。以上各孔加稀釋細(xì)胞用的1640培養(yǎng)基100μl。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。上述操作完成后把培養(yǎng)板放37℃的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。
MTT顯色法同實(shí)施例1。
判定標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例1。
由HLA I類抗原引起的排斥反應(yīng)，則含I類抗原的B組反應(yīng)明顯減弱，而由HLA II類抗原引起的排斥反應(yīng)，則含II類抗原的B組反應(yīng)明顯減弱；含供體HLA I類抗原和HLA II類抗原的檢測板條B組的反應(yīng)均明顯減弱時(shí)，則說明供體的HLA I類抗原和II類抗原均參與了排斥反應(yīng)。
實(shí)施例10 1.病毒檢測抗原的制備參考《體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)》(薛慶善主編，科學(xué)出版社出版，2001年第一版)；《診斷與實(shí)驗(yàn)病毒學(xué)》(鄭州大學(xué)出版社出版，2002年第一版，楊占秋、劉建軍、肖紅、丁曉華主編)；《醫(yī)用實(shí)驗(yàn)病毒學(xué)》(杜平主編，人民軍藝出版社出版，1985年第一版)等資料，對麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型及庚型肝炎病毒、水痘和帶狀皰疹病毒、單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、冠狀病毒、輪狀病毒、柯薩基病毒、埃可病毒(ECHO)、黃熱病毒、腺病毒、森林腦炎病毒、風(fēng)疹病毒、登革熱病毒、流行性乙型腦炎病毒、狂犬病毒、SARS病毒、流行性感冒病毒(包括人、禽)流行性腮腺炎病毒、出血熱病毒、艾滋病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等，按他們各自的生長繁殖特點(diǎn)在體內(nèi)或體外培養(yǎng)，并按它們各自不同的方法使之純化從而得到這些病原體的純品或相對純品，這些相對純化的病原體經(jīng)用60CO照射、0.1-10％甲醛、超聲、非離子去垢劑或脂溶劑如乙醚、氯仿處理等方法使之滅活后，用生理鹽水稀釋至10mg/ml病毒蛋白，分裝入凍存管內(nèi)，1ml/管凍干，-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?br> 2.病毒檢測抗原板的制備①購買上述各種病毒的特異性抗體(晶美公司產(chǎn)品)，用ELISA包被液分別稀釋至4mg/ml；②取48或96孔可包抗原的細(xì)胞培養(yǎng)板或可用于細(xì)胞培養(yǎng)的酶標(biāo)板，然后把上述用包被液稀釋好的各種特異性抗體分別加至上述酶標(biāo)板或細(xì)胞培養(yǎng)板中，每種特異性抗體設(shè)三個(gè)復(fù)空，100μl/孔(留三個(gè)空白孔不包抗體)，4℃過夜；第二天吸去包被液，無菌生理鹽水洗滌三次；③取上述凍干的各種病毒的蛋白質(zhì)，每管加無菌蒸餾水1ml混勻，分別加至對應(yīng)的、包被相應(yīng)病毒特異性抗體的孔中，每孔加0.1ml，4℃過夜，第二天吸去上清液，無菌生理鹽水洗滌三次；包含有上述各種病毒抗原的檢測板就制備完成了；④板子除去洗滌液后晾干，-70℃凍存?zhèn)溆? 3.純化白細(xì)胞介素-2中和單抗及四氮唑鹽如實(shí)施例1所述制備。
4.待檢活化淋巴細(xì)胞的制備抽取待檢患者靜脈血5-10ml，按上述方法分離單個(gè)核細(xì)胞，用無血清1640培養(yǎng)液洗滌2次，沉淀用含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液(其中每ml含F(xiàn)K506 0.125ng，甲基強(qiáng)的松龍5μg，白細(xì)胞介素-2中和單抗75μg)，制成約2×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液備用。在制備活化淋巴細(xì)胞的同時(shí)，取出病毒檢測抗原板預(yù)溫。
5.把上述已稀釋好的患者待檢淋巴細(xì)胞分別加入上述已制備好的病毒檢測抗原板各孔中，100μl/孔，然后再加稀釋細(xì)胞用的1640培養(yǎng)基100μl/孔。上述操作完成后把培養(yǎng)板放37℃CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。
MTT顯色法在上述細(xì)胞培養(yǎng)20-24h后每孔加入MTT 10μl，繼續(xù)培養(yǎng)0.5-4h后可以于倒置顯微鏡下直接觀察各孔黃色水溶性MTT轉(zhuǎn)化為藍(lán)紫色甲

類結(jié)晶物質(zhì)的量，也可以先除去各孔培養(yǎng)液，每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕震蕩5分鐘，使甲

類結(jié)晶物質(zhì)充分溶解后，用酶標(biāo)儀測各孔吸光值，參考波長范圍為490nm-590nm，最佳為550nm。
一、倒置顯微鏡下直接觀察 觀察含病毒抗原的各孔轉(zhuǎn)化黃色可溶性MTT為不溶性甲

類結(jié)晶物質(zhì)的量，與不含病毒抗原的空白孔比較有無明顯減少，若含某病毒抗原的孔轉(zhuǎn)化黃色可溶性MTT為不溶性甲

類結(jié)晶物質(zhì)的量與不含病毒抗原的空白對照孔比較有明顯減少，則說明患者有該病毒感染，否則則說明無該病毒感染。
二、酶標(biāo)儀測各孔吸光值 細(xì)胞培養(yǎng)20-24小時(shí)后加MTT，每孔10μl，繼續(xù)培養(yǎng)0.5-1.5小時(shí)后吸去每孔的培養(yǎng)液，每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕震蕩5分鐘，使甲

類結(jié)晶物質(zhì)充分溶解后，用酶標(biāo)儀測各孔吸光值，參考波長為550nm，以只加150μl二甲基亞砜(DMSO)的無細(xì)胞孔為調(diào)零孔。以各病毒的三孔平均OD值小于70％空白孔三孔的平均OD值為陽性，等于70％-90％空白孔三孔的平均OD值為可疑陽性。
實(shí)施例11 排斥反應(yīng)監(jiān)測抗原板的制備通過用前述抗原制備方法2所得到的，分別表達(dá)不同同種異體抗原的細(xì)胞系(例如只表達(dá)DR15的細(xì)胞系(瑞斯奇生物工程公司生產(chǎn)))，通過培養(yǎng)擴(kuò)增后，用無血清1640培養(yǎng)液1500rpm洗滌兩次，去上清，沉淀用10％甲醛或多聚甲醛溶液，制成約1×108個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，4度處理過夜后，用無血清1640培養(yǎng)液，1000rpm離心洗滌3次，去上清，沉淀用細(xì)胞凍存液，制成約2×107個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，然后分別把這些表達(dá)不同同種異體抗原的細(xì)胞加入96孔U形底或圓底細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中，每孔10μl，每孔只含一種同種異體抗原，各孔組合起來，使培養(yǎng)板中的細(xì)胞包含人類大部甚至全部的同種異體抗原。各孔包含哪一個(gè)同種異體抗原都是已知的，不表達(dá)人類同種異體抗原的細(xì)胞如U973，K562等作為陰性對照細(xì)胞；另設(shè)3個(gè)只加待檢細(xì)胞的孔亦作陰性對照。加入抗原細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板即可做為排斥反應(yīng)監(jiān)測抗原板，-70℃冰箱或液氮中凍存?zhèn)溆谩?br> 純化白細(xì)胞介素-2中和單抗及四氮唑鹽如實(shí)施例1所述制備。
待檢活化淋巴細(xì)胞的制備器官移植一周后定期抽取受者靜脈血25ml，按上述方法分離單個(gè)核細(xì)胞，用無血清1640培養(yǎng)液洗滌2次，沉淀用含20％胎牛血清的1640培養(yǎng)液(其中每ml含F(xiàn)K506 0.125ng，甲基強(qiáng)的松龍5μg，純化白細(xì)胞介素-2中和單抗約100μg)，制成約2×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液備用。
把待檢單個(gè)核細(xì)胞懸液分別加入上述已制備好的排斥反應(yīng)監(jiān)測抗原板各孔中，每孔100μl，然后再補(bǔ)上述細(xì)胞稀釋用培養(yǎng)液每孔100μl，操作完成后把培養(yǎng)板放37℃的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。
MTT顯色法同上。
判定標(biāo)準(zhǔn) 一、倒置顯微鏡下直接觀察 已知患者供體同種異體抗原時(shí)，首先找出含供者抗原的孔中處理MTT的能力明顯減弱的孔，然后再找出不含該患者供體同種異體抗原的孔中處理MTT的能力最弱的孔與之比較，若前者比后者處理MTT的能力明顯減弱則說明有排斥反應(yīng)發(fā)生；否則則無排斥反應(yīng)發(fā)生。
不知患者供體同種異體抗原時(shí)，首先找出含同種異體抗原的孔中處理MTT的能力明顯減弱的孔，然后與陰性對照孔中處理MTT的能力最弱的孔進(jìn)行比較，若前者比后者處理MTT的能力明顯減弱則說明有排斥反應(yīng)發(fā)生；否則則無排斥反應(yīng)發(fā)生。
二、酶標(biāo)儀測各孔吸光值 細(xì)胞培養(yǎng)20-24小時(shí)后加MTT，每孔10μl，繼續(xù)培養(yǎng)1-2h后吸去每孔的培養(yǎng)液，每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO)，輕輕震蕩5分鐘，使甲以只加150μl二甲基亞砜(DMSO)的無細(xì)胞孔為調(diào)零孔。以含抗原孔中有單孔OD值小于陰性對照孔中平均OD值的70％時(shí)為陽性，等于陰性對照孔中平均OD值孔的70％-90％為可疑陽性。
測試結(jié)果說明對每個(gè)心臟移植患者進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測，其監(jiān)測結(jié)果與活檢病理結(jié)果進(jìn)行對照。本方法可以提示排斥反應(yīng)是由哪一個(gè)同種異體抗原引起的。
實(shí)施例12 除了把白細(xì)胞介素-15中和單抗和白細(xì)胞介素-2中和單抗聯(lián)合應(yīng)用以外，重復(fù)實(shí)施例1的操作。
結(jié)果與實(shí)施例1對照無明顯差別。
權(quán)利要求
1、一種檢測機(jī)體活化淋巴細(xì)胞特異性的方法，此方法包括
1)制備檢測用抗原，并用培養(yǎng)基稀釋；所述抗原能使機(jī)體的淋巴細(xì)胞活化；所述培養(yǎng)基除包含常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)所需成分外，還添加了免疫抑制劑和/或抗腫瘤藥和對細(xì)胞增殖具有刺激活性的細(xì)胞因子的中和抗體和/或?qū)蝹€(gè)核細(xì)胞具有抑制活化和抑制增殖作用的細(xì)胞因子；
2)用所述培養(yǎng)基制備包含待檢活化淋巴細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞；
3)將所述檢測用抗原、含待檢活化淋巴細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞加入細(xì)胞培養(yǎng)板中一起培養(yǎng)；
4)通過比較試驗(yàn)孔與陰性對照孔的可檢測信號的差異，來確定檢測樣品中是否存在抗原特異的活化淋巴細(xì)胞。
2、權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原選自人主要組織相容性抗原(HLA)，同種異體抗原，異種抗原，病毒抗原和細(xì)菌抗原。
3、權(quán)利要求2的方法，其中所述抗原可以是顆?？乖?，也可以是可溶性抗原；其中所述人主要組織相容性抗原是HLA I類抗原或II類抗原中的一種，也可以是多種HLA I類和II類抗原的混合物。
4、權(quán)利要求1的方法，其特征在于，基于所述培養(yǎng)基的量，所述免疫抑制劑或抗腫瘤藥的用量為0.001ng-100μg/ml，所述對細(xì)胞增殖具有刺激活性的細(xì)胞因子的中和抗體的用量為1μg-10mg/ml，所述對單個(gè)核細(xì)胞具有抑制活化和抑制增殖作用的細(xì)胞因子的用量為0.01-1000個(gè)活性單位/ml。
5、權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述可檢測信號是指能反映各孔細(xì)胞活性變化的信號。
6、權(quán)利要求4的方法，其中所述免疫抑制劑選自普樂可復(fù)，環(huán)孢素，環(huán)磷酰胺，硫唑嘌呤，雷帕霉素，RS-61443，BQR，人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株JM分泌的免疫抑制因子，脫氧精胍菌素和腎上腺皮質(zhì)激素；所述抗腫瘤藥選自拓?fù)涿敢种苿⑼榛瘎?，抗代謝藥，維甲類化合物-維生素A衍生物及其它一些潛在的具有誘導(dǎo)免疫抑制作用或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的藥物。
7、權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所述免疫抑制劑和抗癌藥可單獨(dú)使用或聯(lián)合使用。
8、權(quán)利要求6的方法，其中所述腎上腺皮質(zhì)激素選自甲基強(qiáng)的松龍，強(qiáng)的松，氫化可的松和地塞米松等。
9、權(quán)利要求6的方法，其中所述環(huán)孢素選自環(huán)孢霉素A和環(huán)孢霉素C。
10、權(quán)利要求4的方法，其中所述對細(xì)胞增殖具有刺激活性的細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素1、2、3、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23，α-干擾素，β-干擾素，ω-干擾素，γ-干擾素，粒細(xì)胞集落刺激因子，巨噬細(xì)胞集落刺激因子，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子，干細(xì)胞因子，血小板生成素。
11、權(quán)利要求4的方法，其中所述對單個(gè)核細(xì)胞具有抑制活化和抑制增殖作用的細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素2、4、10，轉(zhuǎn)化生長因子β。
12、一種用于檢測活化淋巴細(xì)胞特異性的培養(yǎng)基，其特征在于，除包含常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)所需成分外，還添加了免疫抑制劑和/或抗癌藥和對細(xì)胞增殖具有刺激活性的細(xì)胞因子的中和抗體和/或?qū)蝹€(gè)核細(xì)胞具有抑制活化和抑制增殖作用的細(xì)胞因子。
13、權(quán)利要求12的培養(yǎng)基，其特征在于，基于所述培養(yǎng)基的量，所述免疫抑制劑的用量為0.001ng-100μg/ml。
14、權(quán)利要求12的培養(yǎng)基，其特征在于，基于所述培養(yǎng)基的量，所述對細(xì)胞增殖具有刺激活性的細(xì)胞因子的中和抗體的用量為1μg-10mg/ml。
15、權(quán)利要求12的培養(yǎng)基，其特征在于，基于所述培養(yǎng)基的量，所述對單個(gè)核細(xì)胞具有抑制活化和抑制增殖作用的細(xì)胞因子的用量為0.01-1000個(gè)活性單位/ml。
16、權(quán)利要求14的培養(yǎng)基，其特征在于所述的細(xì)胞因子中和抗體可單獨(dú)使用或聯(lián)合使用。
17、權(quán)利要求14和15的培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞因子中和抗體和對單個(gè)核細(xì)胞具有抑制活化和抑制增殖作用的細(xì)胞因子可以分別使用，也可聯(lián)合使用。
18、權(quán)利要求13的培養(yǎng)基，其中所述免疫抑制劑選自普樂可復(fù)，環(huán)孢素，環(huán)磷酰胺，硫唑嘌呤，雷帕霉素，RS-61443，BQR，脫氧精胍菌素和腎上腺皮質(zhì)激素；所述抗腫瘤藥選自拓?fù)涿敢种苿?、烷化劑，抗代謝藥，維甲類化合物-維生素A衍生物及其它一些潛在的具有誘導(dǎo)免疫抑制作用或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用的藥物。
19、權(quán)利要求18的培養(yǎng)基，其中所述免疫抑制劑和抗腫瘤藥可單獨(dú)使用，或聯(lián)合使用。
20、權(quán)利要求18的培養(yǎng)基，其中所述腎上腺皮質(zhì)激素選自甲基強(qiáng)的松龍，強(qiáng)的松，氫化可的松和地塞米松。
21、權(quán)利要求18的培養(yǎng)基，其中所述環(huán)孢素選自環(huán)孢霉素A和環(huán)孢霉素C。
22、權(quán)利要求14的培養(yǎng)基，其中所述對細(xì)胞增殖具有刺激活性的細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素1、2、3、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23，α-干擾素，β-干擾素，ω-干擾素，γ-干擾素，粒細(xì)胞集落刺激因子，巨噬細(xì)胞集落刺激因子，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子，干細(xì)胞因子，血小板生成素。
23、權(quán)利要求15的培養(yǎng)基，其中所述對單個(gè)核細(xì)胞具有抑制活化和抑制增殖作用的細(xì)胞因子選自白細(xì)胞介素2、4、10，轉(zhuǎn)化生長因子β、腫瘤壞死因子。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測活化淋巴細(xì)胞特異性的方法，應(yīng)用本方法可鑒定器官移植后、病原微生物感染后或疫苗接種后，受者或患者體內(nèi)活化淋巴細(xì)胞的特異性。本方法的建立，不但可以及時(shí)診斷器官移植的排斥反應(yīng)，指導(dǎo)臨床上的合理用藥，而且對許多感染性疾病均可及時(shí)診斷，及早隔離治療，避免傳播和流行，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/569GK1627074SQ20031011987
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月8日
發(fā)明者胡軍 申請人:胡軍