一種快速磁珠法提取植物組織基因組dna的試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速磁珠法提取植物組織基因組DNA的試劑盒及提取方法，包括LysisA液、LysisB液、LysisC液、磁珠懸液、結(jié)合液、wshing1液、wshing2液、洗脫液。利用本發(fā)明試劑盒提取植物組織基因組DNA回收率高、純度高、片段完整、無PCR抑制物質(zhì)。DNA提取從裂解、純化到收集產(chǎn)物的全過程均可由儀器完成，自動(dòng)化程度高，提取所使用的試劑高效安全，最大程度避免對人體的傷害。
【專利說明】一種快速磁珠法提取植物組織基因組DNA的試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種利用磁珠法提取植物組織基因組DNA的試劑盒及其提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸的分子生物學(xué)技術(shù)是進(jìn)行病原微生物檢測，轉(zhuǎn)基因檢測，物種鑒定，物種起源、多樣性評估及其親緣關(guān)系、系統(tǒng)進(jìn)化等常用研究手段之一。純化的DNA是用來進(jìn)行PCR檢測、基因測序的基礎(chǔ)物質(zhì)，盡管在不同樣品(動(dòng)物組織、微生物)中，DNA是一個(gè)相對穩(wěn)定的分子，但是對于植物組織來說，DNA提取技術(shù)仍然是基于DNA擴(kuò)增的檢測技術(shù)的瓶頸，能否取得高質(zhì)量的核酸DNA是后續(xù)分析技術(shù)成功與否的關(guān)鍵，提取方法的靈敏度、速度也將直接關(guān)系到后續(xù)試驗(yàn)的成敗。對于一般的分析來說，好的制備技術(shù)應(yīng)該是簡便、安全、廉價(jià)，并且能保證DNA純度和濃度。用于檢測分析的DNA應(yīng)具備一定的濃度、純度、完整性。提取試劑和提取技術(shù)都可能對這些參數(shù)造成影響。
[0003]傳統(tǒng)的核酸分離方法主要有化學(xué)法、抽提法、物理冷凍、煮沸法和和硅膠膜吸附，提取的步驟主要包含細(xì)胞裂解、有機(jī)溶劑萃取、沉淀，高速離心等過程，植物組織裂解步驟中，去污劑破壞細(xì)胞壁使蛋白-核酸復(fù)合物游離到溶液中，蛋白質(zhì)和多糖結(jié)合CTAB或PVP從溶解DNA的液相中分離出來，SDS分離核蛋白和核酸，用酚和/或氯仿去除液相中有活性的核酸酶和PCR抑制因子，如親脂類分子、多糖、蛋白質(zhì)，用醇洗滌后即可得到核酸DNA。硅膠膜吸附也可用來協(xié)助DNA的提取和純化，裂解后，DNA結(jié)合鹽酸胍一氫氧化物離液劑中的硅膠顆粒而沉淀， 沉淀用醇洗滌，最后，沉淀用低濃度鹽溶液溶解。這些純化方法的步驟繁雜、費(fèi)時(shí)長、回收率低，且提取過程中使用酚、氯仿、異丙醇等有毒有害物質(zhì)，影響人體健康。
[0004]磁珠分離純化技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新方法，是一種簡單有效的核酸提純方法，主要原理是在具有超順磁性的磁核上均勻包被二氧化硅，二氧化硅連接能特異性吸附核酸的功能基團(tuán)，在有特定鹽如PEG8000等存在的樣本裂解溶液中特異性地吸附目標(biāo)核酸，隨后通過分離磁珠達(dá)到分離提取核酸的目的。磁珠法克服了傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，具有簡便、快捷、高效等特點(diǎn)，很容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，因此，該方法已廣泛應(yīng)用于病毒、動(dòng)物組織等的DNA和RNA的提取中，也出現(xiàn)了各種相應(yīng)試劑盒。
[0005]植物細(xì)胞與動(dòng)物細(xì)胞相比，除有細(xì)胞壁外，還含有大量的多糖、脂質(zhì)、色素和酚類物質(zhì)，利用現(xiàn)有的磁珠法提取DNA試劑盒對植物組織的基因組DNA進(jìn)行提取，所得產(chǎn)物的回收率和純度都比較低，不能滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速磁珠法提取植物組織基因組DNA的試劑盒。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種快速磁珠法提取植物組織基因組DNA的方法。
[0008]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):一種快速磁珠法提取植物組織基因組DNA的試劑盒，其特征在于:包括Lysis A液、Lysis B液、Lysis C液、磁珠懸液、結(jié)合液、wshingl液、wshing2液、洗脫液。
[0009]優(yōu)選的，LysisA 液為 I ~2% CTAB, 0.1 ~0.2mol/L 氯化鈉，10 ~20mmol/LEDTA, 80 ~120mmol/L Tris-HCL，ρΗ=7.5 ~8.5 ；Lysis B 液為 10 ~20% β -巰基乙醇；LysisC液為10~30mg/mL蛋白酶K ;磁珠懸浮液由磁珠和含有10~20mmol/L氯化鈉及0.01~0.05% NaN3的水溶液按1:30~50的重量比組成；結(jié)合液為5~10% PEG8000(聚乙二醇 8000)，2 ~4M GITC(異硫氰酸胍);washingl 液為 0.5 ~lmol/L GITC, 0.1 ~0.2mol/L 氯化鈉，5 ~10mmol/L EDTA，20 ~40mmol/L Tris-HCL , 0.2% trionx-100, ρΗ=5.5 ~6.5 ；washing2 液為 5 ~10mmol /T, EDTA, 20 ~40mmo1 /T, Tris-HCL , 0.1 ~0.2mol/L 氣化鈉，ρΗ=5.5 ~6.5 ;洗脫液為 0.5 ~1.5mmol/L EDTA，5 ~15mmol/L Tris-HCL,PH=7.5 ~
8.5ο
[0010]優(yōu)選的，LysisA 液為 1.6% CTAB, 0.12mol/L 氯化鈉，15mmol/L EDTA, 80mmol/LTris-HCL ，pH=7.8 ；Lysis B 液為 20% β -巰基乙醇；LysisC 液為 20mg/mL 蛋白酶 K ;磁珠懸浮液由磁珠和含有20mmol/L氯化鈉及0.03% NaN3的水溶液按1:35的重量比組成；結(jié)合液為 10% PEG8000 (聚乙二醇 8000)，3.5M GITC (異硫氰酸胍)；washingl 液為 0.5mol/LGITC，0.14mol/L 氯化鈉，8mmol/L EDTA, 25mmol/L Tris-HCL , 0.2% trionx-100, pH=5.8 ；washing2 液為 8mmol/L EDTA, 25mmol/L Tris-HCL，0.14mol/L 氯化鈉,pH=5.8 ;洗脫液為
0.lmmol/L EDTA,5mmol/L Tris-HCL, PH=8.2。
[0011]優(yōu)選的，所述磁珠的直徑為0.5~2 μ m。
[0012]本發(fā)明的一種技術(shù)方案為提供一種植物基因組DNA的提取方法，其特征在于:包括如下步驟:
1)將25~IOOmg預(yù)處理后的新鮮植物組織加入到權(quán)利要求1所述的Lysis溶液(LysisA: Lysis B: Lysis C=150 ~200: 2: 5) 207 μ l 中，60 ~7(TC溫浴 15 ~30min ;
2)12000r離心10min,取上清液100 μ l,加入權(quán)利要求1或4所述的結(jié)合液100~150 μ l和權(quán)利要求1或3所述的5 μ l磁珠懸液，混合均勻；
3)將磁珠轉(zhuǎn)移到washingl液中清洗；
4)將磁珠轉(zhuǎn)移到washing2液中清洗；
5)清洗后的磁珠用洗脫液進(jìn)行洗脫，得到純化的DNA。
[0013]優(yōu)選的，步驟1)中，樣品與Lysis液的質(zhì)量體積比為25~IOOmg: 150~250μ1。
[0014]優(yōu)選的，步驟2)中，上清液與結(jié)合液的體積比為1:1~2。
[0015]優(yōu)選的，步驟3)中，參與核酸提取的磁珠與washingl液的體積比為5~10:200^400，優(yōu)選的，步驟4)中，參與核酸提取的磁珠與washing2液的體積比為5~10:400~600 。
[0016]優(yōu)選的,步驟I)中，樣品與Lysis液的質(zhì)量體積比為30mg: 207μ1;步驟2)中，上清液與結(jié)合液的體積比為I =1.5 ;步驟(3)中，參與核酸提取的磁珠與washingl液的體積比為5: 300 ;步驟4)中，參與核酸提取的磁珠與washing2液的體積比為5: 500。
[0017]優(yōu)選的，所述植物組織包括新鮮植物葉片、干植物葉片、大豆種子、小麥種子、玉米種子等。
[0018]本發(fā)明的有益效果在于:I)利用本發(fā)明試劑盒提取的基因組DNA回收率高、純度高、片段完整、無PCR抑制物質(zhì)，使用本試劑提取30mg干燥大豆、小麥、玉米葉片組織，分別純化得到了約8 μ g、15 μ g和7μ g的高純度基因組DNA，純度A260/280 = 1.7-1.9之間。
[0019]2)本發(fā)明的DNA提取方法僅需4個(gè)步驟，分別是裂解、沉淀、清洗、洗脫，從裂解、純化到收集產(chǎn)物的全過程均可由儀器完成，自動(dòng)化程度高，實(shí)驗(yàn)過程中完全無需人工干預(yù)和檢測，且提取所使用的試劑高效安全，最大程度的避免對人體的傷害。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1:不同方法提取大豆、小麥及玉米基因組DNA的PCR檢測結(jié)果圖；
其中:1-4:大豆；5-8:小麥；9-12:玉米。1、5、9本發(fā)明試劑盒3 ; 2、6、10索萊寶植物DNA提取試劑盒；3、7、11金麥格植物DNA提取試劑盒；4、8、12天根植物DNA提取試劑盒；M =Marker I 100，200，300，400，500，600
圖2:本發(fā)明試劑盒3提取大豆、小麥、玉米結(jié)果圖；
其中:1、2:大豆，3、4:小麥，5、6 玉米，M:marker λ DNA/Hind III 125，564，2027，2322，4361,6557,9416,23130
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0022]實(shí)施例1
一種快速磁珠法提取植物組織基因組DNA的試劑盒1，包括Lysis A液、Lysis B液、Lysis C液、磁珠懸液、結(jié)合液、wshingl液、wshing2液、洗脫液。
[0023]其中，LysisA 液為 1% CTAB, 0.lmol/L 氯化鈉，10mmol/L EDTA,80mmol/LTris-HCL , pH=7.5 ；Lysis B 液為 10%β -巰基乙醇；LysisC 液為 10mg/mL 蛋白酶 K ;磁珠懸浮液由磁珠和含有l(wèi)Ommol/L氯化鈉及0.01% NaN3的水溶液按1:30的重量比組成；結(jié)合液為5% PEG8000 (聚乙二醇8000)，2M GITC (異硫氰酸胍)；washingl液為0.5mol/LGITC，0.lmol/L 氯化鈉，5mmol/L EDTA, 20mmol/L Tris-HCL , 0.2% trionx-100, pH=5.5 ；washing2 液為 5mmol/L EDTA, 20mmol/L Tris-HCL , 0.lmol/L 氯化鈉,pH=5.5 ;洗脫液為0.5mmol/L EDTA, 5mmol/L Tris-HCL，PH=7.5。
[0024]一種快速磁珠法提取植物組織基因組DNA的試劑盒2，包括Lysis A液、LysisB液、Lysis C液、磁珠懸液、結(jié)合液、wshingl液、wshing2液、洗脫液。其中，Lysis A液為 2% CTAB, 0.2mol/L 氯化鈉，20mmol/L EDTA, 120mmol/L Tris-HCL，pH= 8.5 ；Lysis B液20%β -巰基乙醇；LysisC液為30mg/mL蛋白酶K ;磁珠懸浮液由磁珠和含有20mmol/L氯化鈉及0.05% NaN3的水溶液按1: 50的重量比組成；結(jié)合液為10% PEG8000 (聚乙二醇 8000)，4M GITC (異硫氰酸胍)；washingl 液為 lmol/L GITC，0.2mol/L 氯化鈉，IOmmol/L EDTA, 40mmol/L Tris-HCL ,0.2% trionx-100, pH=5.5 ~6.5 ；washing2 液為 5 ~IOmmoI/L EDTA, 20 ~40mmol/L Tris-HCL，0.I ~0.2mol/L 氯化鈉，ρΗ=5.5 ~6.5 ;洗脫液為 0.5 ~1.5mmol/L EDTA, 5 ~ 15mmol/L Tris-HCL, PH=7.5 ~8.5。
[0025]一種快速磁珠法提取植物組織基因組DNA的試劑盒3，包括Lysis A液、Lysis B液、Lysis C液、磁珠懸 液、結(jié)合液、wshingl液、wshing2液、洗脫液。經(jīng)過正交試驗(yàn)測試優(yōu)選的其各成分的組成為，Lysis A液為1.6% CTAB, 0.12mol/L氯化鈉，15mmol/L EDTA,80mmol/L Tris-HCL ，pH=7.8 ；Lysis B 液為 20% β -疏基乙醇；LysisC 液為 20mg/mL 蛋白酶K ;磁珠懸浮液由磁珠和含有20mmol/L氯化鈉及0.03% NaN3的水溶液按1:35的重量比組成；結(jié)合液為10% PEG8000 (聚乙二醇8000)，3.5M GITC (異硫氰酸胍)#ashingl液為0.5mol/L GITC, 0.14mol/L氯化鈉，8mmol/L EDTA, 25mmol/L Tris-HCL , 0.2% trionx-100,ρΗ=5.8 ;washing2 液為 8mmol/L EDTA, 25mmol/L Tris-HCL，0.14mol/L 氯化鈉,pH=5.8 ；洗脫液為 0.lmmol/L EDTA, 5mmol/L Tris-HCL, PH=8.2。
[0026]分別利用上述3種試劑盒提取大豆基因組DNA，包括如下步驟:
1.取30mg粉碎的大豆干燥葉片,加入到207μ I lysis液(Lysis A: Lysis B: LysisC=150: 2: 5，使用前混勻)中，65°C孵化30min。
[0027]2.常溫12000rpm，離心10min，觀察樣品沉淀完全，吸取上清液備用。
[0028]3.轉(zhuǎn)移100 μ I上清液，加入到與NP968核酸儀配套的96深孔板的第一、七列孔內(nèi)，再向第一、七列孔內(nèi)中加入150 μ I結(jié)合液和5μ I磁珠懸液；第二、八列孔中加入300 μ I washingl液；第三、九列孔中加入500 μ I washing2液,第六、十二列孔加100 μ I洗脫液；第四、五、十、十一列孔空置，不加任何試劑。
[0029]4.將加好的深孔板及攪拌套裝入核酸提取儀，運(yùn)行程序，程序步驟如下:
【權(quán)利要求】
1.一種快速磁珠法提取植物組織基因組DNA的試劑盒，其特征在于:包括Lysis A液、Lysis B液、Lysis C液、磁珠懸液、結(jié)合液、wshingl液、wshing2液、洗脫液。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:其中，LysisA液為I~2% CTAB, 0.1~0.2mol/L氯化鈉，10 ~20mmol/L EDTA，80 ~120mmol/L Tris-HCL，ρΗ=7.5 ~8.5 ；LysisB液為10~20%β -巰基乙醇；LysisC液為10~30mg/mL蛋白酶K ;磁珠懸浮液由磁珠和含有10~20mmol/L氯化鈉及0.01~0.05% NaN3的水溶液按1:30~50的重量比組成；結(jié)合液為5~10% PEG8000 (聚乙二醇8000)，2~4M GITC (異硫氰酸胍)；washingl液為0.5 ~lmol/L GITC，0.1 ~0.2mol/L氯化鈉，5 ~10mmol/L EDTA，20 ~40mmol/L Tris-HCL,0.2% trionx-100, ρΗ=5.5 ~6.5 ;washing2 液為 5 ~10mmol/L EDTA,20 ~40mmo1 /T,Tris-HCL，0.1 ~0.2mol/L 氯化鈉，ρΗ=5.5 ~6.5 ;洗脫液為 0.5 ~1.5mmol/L EDTA, 5 ~15mmol/L Tris-HCL, PH=7.5 ~8.5。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:其中，LysisA液為1.6% CTAB, 0.12mol/L 氯化鈉，15mmol/L EDTA, 80mmol/L Tris-HCL，pH=7.8 ；Lysis B 液為 20%β -巰基乙醇；LysisC液為20mg/mL蛋白酶K ;磁珠懸浮液由磁珠和含有20mmol/L氯化鈉及0.03% NaN3的水溶液按1:35的重量比組成；結(jié)合液為10% PEG8000 (聚乙二醇8000)，3.5M GITC (異硫氰酸狐)；washingl 液為 0.5mol/L GITC, 0.14mol/L 氯化鈉，8mmol/L EDTA, 2Smmol /I,Tris-HCL , 0.2% trionx-100, ρΗ=5.8 ;washing2 液為 8mmol/L EDTA, 25mmol/L Tris-HCL,0.14mol/L 氯化鈉，ρΗ=5.8 ;洗脫液為 0.lmmol/L EDTA,5mmol/L Tris-HCL, PH=8.2。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于:所述磁珠的直徑為0.5~2 μ m。
5.一種利用權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的試劑盒快速提取植物組織基因組DNA的方法，其特征在于:包括如 下步驟: 1)將25~IOOmg預(yù)處理后的新鮮植物組織加入到Lysis溶液(LysisA: Lysis B:Lysis C=150 ~200: 2: 5)中，60 ~7(TC溫浴 15 ~30min ; 2)12000r離心10min，取上清液100μ 1，加入結(jié)合液100~150μ I和5μ I磁珠懸液，混合均勻； 3)將磁珠轉(zhuǎn)移到washingl液中清洗； 4)將磁珠轉(zhuǎn)移到washing2液中清洗； 5)清洗后的磁珠用洗脫液進(jìn)行洗脫，得到純化的DNA。
6.如權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于:步驟I)中，樣品與Lysis液的質(zhì)量體積比為 25 ~IOOmg: 150 ~250μ1。
7.如權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于:步驟2)中，上清液與結(jié)合液的體積比為1:1~2。
8.如權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于:步驟3)中，參與核酸提取的磁珠與washingl液的體積比為5~10: 200^400 ,優(yōu)選的,步驟4)中，參與核酸提取的磁珠與washing2液的體積比為5~10: 400~600。
9.如權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于:步驟I)中，樣品與Lysis液的質(zhì)量體積比為30mg: 207μ I ;步驟2)中，上清液與結(jié)合液的體積比為1:1.5 ;步驟(3)中，參與核酸提取的磁珠與washingl液的體積比為5: 300 ;步驟4)中，參與核酸提取的磁珠與washing2液的體積比為5: 500。
10.如權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于:所述植物組織包括新鮮植物葉片、干植物葉片、大豆種子、小麥種子、玉米種子等。
【文檔編號】C12N15/10GK103898092SQ201410039630
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】李紅東, 高宏偉, 苗保剛, 李明, 彭年才, 李政 申請人:西安天隆科技有限公司, 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心