專利名稱：棗樹水通道蛋白基因及在提高植物耐旱性和耐鹽性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉 及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種棗樹水通道蛋白基因及在提高植物耐 旱性和耐鹽性中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
公知，水通道蛋白(aquaporin，AQP)大量存在于植物、動物、微生物等多種生物體 內(nèi)。植物水通道蛋白是一類在植物體內(nèi)形成水選擇性運(yùn)輸通道的蛋白質(zhì)，它在植物種子萌 發(fā)、細(xì)胞伸長、氣孔運(yùn)動等過程中調(diào)節(jié)水分的快速跨膜運(yùn)輸，它使植物能快速靈敏地調(diào)節(jié)細(xì) 胞內(nèi)與細(xì)胞間的水分流動。有些水通道蛋白是組成型表達(dá)的，而多數(shù)水通道蛋白則受環(huán)境 因子，如干旱、鹽害、激素、光質(zhì)等誘導(dǎo)表達(dá)，因此研究水通道蛋白與植物抗逆性的關(guān)系備受 人們關(guān)注。第一個植物水通道蛋白Y-TIP是從模式植物擬南芥中分離出來的，它位于液泡 膜上，因此被命名為TIP(tonoplast intrinsic protein)。通過爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分 析確認(rèn)了 Y-TIP蛋白運(yùn)輸水的專一性功能。到目前為止，科學(xué)家已經(jīng)在擬南芥、豌豆、煙 草、玉米、水稻等多種植物中都發(fā)現(xiàn)了 AQP。另外，從蛋白數(shù)據(jù)庫中也發(fā)現(xiàn)了大量AQP的同源 物，它們廣泛存在于單子葉和雙子葉植物以及C3和C4代謝植物中，通過氨基酸序列同源性 分析推測它們可能也是AQP。越來越多的研究表明，大多數(shù)植物中都存在著多個AQP及其 同源物且含量豐富。如擬南芥中，PIPl蛋白占葉與根質(zhì)膜蛋白的以上；菠菜葉肉細(xì)胞 中含豐富的質(zhì)膜AQP，占其質(zhì)膜總蛋白的20% ；菜豆子葉中含豐富的a-TIP同源物，約占細(xì) 胞可抽提總蛋白的2%。根據(jù)水通道蛋白氨基酸序列同源性及結(jié)構(gòu)特征，可將其分為4類 質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(plasma membrane intrinsic protein，PIPs)、液泡膜內(nèi)在蛋白(tonoplast intrinsic protein,TIPs)、類nodulin26膜內(nèi)蛋白(nodulin26_like intrinsic protein, NIPs)和小分子堿性內(nèi)在蛋白(small and basic intrinsic protein，SIPs)。植物水通道蛋白的發(fā)現(xiàn)是植物水分生理學(xué)研究的重大進(jìn)展，將水分代謝的研究引 入了一個全新的階段。目前，科學(xué)家們已經(jīng)在擬南芥、豌豆、玉米、煙草、向日葵、含羞草等多 種植物中發(fā)現(xiàn)了 AQP，并對它們中的某些蛋白進(jìn)行了分類、功能、亞細(xì)胞定位等方面的研究。 但是對于中國古老的、重要的經(jīng)濟(jì)樹種——棗樹的水通道蛋白的研究還沒有相關(guān)的報(bào)道， 到目前為止，還未見有從棗樹中分離出AQP基因并用于提高植物耐旱性和耐鹽性方面的報(bào) 道。棗樹原產(chǎn)于我國黃河流域，是我國特有的經(jīng)濟(jì)林樹種之一，棗樹耐寒，抗旱，抵御各種 外界不良因子的能力強(qiáng)，尤其是對土壤瘠薄、干旱有很強(qiáng)的忍耐力，在晉西北、太行山、陜北 等黃土高原地區(qū)，棗樹一般生長在土壤相當(dāng)貧瘠、少雨干旱的丘陵山坡、高崖邊等不良環(huán)境 下，且都能正常生長結(jié)果。這種極其耐旱、耐瘠薄的特點(diǎn)顯著優(yōu)于其它農(nóng)作物，因此棗樹的 抗逆性基因是非常寶貴的遺傳資源，了解具有優(yōu)良抗性的棗樹的抗逆機(jī)制，逆境相關(guān)基因 的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能及調(diào)控，可充分利用這些優(yōu)良抗性基因提高植物的抗逆性提供一定 的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和奠定理論基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種棗樹水通道蛋白基因，該基因來自于棗樹，可作為目 的基因?qū)胫参铮岣咧参锬秃敌院湍望}性，進(jìn)行植物品種改良。本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種棗樹水通道蛋白基因，該基因的核苷酸 序列具有如SEQ ID NO 1所示的序列。由所述一種棗樹水通道蛋白基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，該氨基酸序列 具有如SEQ ID NO :2所示的序列。一種棗樹水通道蛋白基因在提高植物耐旱性和耐鹽性中的應(yīng)用。本發(fā)明從壺瓶棗樹(Ziziphus jujuba Mill. HUPING)的結(jié)果枝(棗吊)，利用CTAB 法提取總RNA，根據(jù)mRNA純化試劑盒方法從提取到的總RNA中分離純化mRNA，構(gòu)建cDNA文 庫，然后通過Blast分析與比對，從中克隆到一個cDNA序列為棗樹中的水通道蛋白基因全 序列，將其命名為 ZjPIP2 (Zizyphus jujuba Mill plasma membrane intrinsic protein)。 根據(jù)該基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成引物，上游引物WP3序列為5' —ATGGATCC]ΑΤ<^'GCAAAAGACCCTG-3‘，包含 BamH I 限制性酶切位點(diǎn)(即有下
劃線部分)，兩個保護(hù)堿基AT，及水通道蛋白ZjPIP2基因的起始密碼子ATG。下游引物WP6 序列為5' —ATACCCGGGjTCA]AACATGAGGGTT-3‘，包含Sam I 限制性酶切位點(diǎn)(即有下劃 線部分)，三個保護(hù)堿基ATA，及水通道蛋白Z jPIP2基因的終止密碼子TGA (反向序列)。引 物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。然后使用PCR技術(shù)成功擴(kuò)增出ZjPIP2的目 的基因片段，電泳分析ZjPIP2基因的cDNA序列全長為846bp，編碼281氨基酸，其中包含有 16個酸性氨基酸，19個堿性氨基酸，蛋白質(zhì)的相對分子量為29. 87KD，理論等電點(diǎn)為8. 77。 多重比對表明ZjPIP2與其他水通道蛋白有非常高的同源性，特別是與菜豆PIP2的同源性 達(dá)到88%。而且，ZjPIP2蛋白序列當(dāng)中含有MIP家族典型的保守氨基酸序列“HINPAVIFG” 和兩個“NPA”保守肽段。進(jìn)化樹分析表明棗樹ZjPIP2和茄科煙草屬的粉藍(lán)煙草親緣關(guān)系 最近。特別是三級結(jié)構(gòu)的分析暗示著ZjPIP2跟菠菜水通道蛋白相似，推測其功能有著類似 性。上述同源性分析、氨基酸序列特性分析以及氨基酸序列的進(jìn)化樹分析、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測等 分析手段是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的常規(guī)驗(yàn)證手段，通過上述多重對比分析，即可證 明本發(fā)明克隆得到的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列即為本發(fā)明所述的棗樹水通道蛋 白基因的序列，而且其蛋白功能也被唯一確定。本發(fā)明在PCR克隆得到ZjPIP2基因后，經(jīng)限制性內(nèi)切酶修飾后連接到植物表 達(dá)載體PBI121上，經(jīng)含卡納霉素的LB平板篩選、PCR、酶切、測序等方法證明植物表達(dá)載 體pBII21-ZjPIP2構(gòu)建成功。通過凍融法將植物表達(dá)載體pBI121_ZjPIP2轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿 菌LBA4404的感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)含卡納霉素的YEB平板篩選、PCR鑒定等方法證明工程菌 pBI121-ZjPIP2-L構(gòu)建成功。農(nóng)桿菌介導(dǎo)ZjPIP2基因轉(zhuǎn)化擬南芥，經(jīng)含卡納霉素的1/2MS 培養(yǎng)基篩選獲得含有目的基因ZjPIP2的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，然后對轉(zhuǎn)基因植物及其Tl代 進(jìn)行耐鹽性評價及耐旱性性評價，經(jīng)在0. IM NaCl溶液連續(xù)處理3天(鹽處理)或是不澆 任何液體(干旱處理)，觀察其生長表現(xiàn)，均能夠在正常生長條件下恢復(fù)。
此外，本發(fā)明為了進(jìn)一步研究ZjPIP2基因在棗樹體內(nèi)的表達(dá)，分別對盆栽壺瓶棗 樹苗進(jìn)行干旱、NaCl脅迫處理，并以未作任何處理的正常壺瓶棗樹苗為對照，研究逆境因素 對ZjPIP2基因表達(dá)的影響，當(dāng)處理過的樹苗出現(xiàn)嚴(yán)重卷葉、枯黃現(xiàn)象時，立即采樣并速凍 保存于-80°C冰箱。用CTAB法提取所采集到的對照及脅迫處理過的植物材料的總RNA，經(jīng) OD260值的測定、甲醛變性膠電泳等方法檢測證明所提RNA純度高、無降解，質(zhì)量合格。反轉(zhuǎn) 錄所提總RNA，RT-PCR分析得Z jPIP2基因在植物莖、葉中的表達(dá)比較穩(wěn)定，同時證實(shí)ZjPIP2 可受干旱、NaCl脅迫等逆境因素誘導(dǎo)表達(dá)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并從棗樹中克隆出棗樹水通道蛋白基因 ZjPIP2，該基因可作為目的基因?qū)胫参?，提高植物耐鹽性和耐旱性，以進(jìn)行植物品種改 良，明確了具有優(yōu)良抗性的棗樹的抗逆機(jī)制，逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能及調(diào)控， 為進(jìn)一步充分利用這些優(yōu)良抗性基因提高植物的抗逆性提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，奠定了一 定的理論基礎(chǔ)。


圖1為目的基因ZjPIP2的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；圖2為pBI121載體及目的基因ZjPIP2的雙酶切圖譜；圖3為重組質(zhì)粒pBI121_ZjPIP2的酶切圖譜；圖4為植物表達(dá)載體pBI121_ZjPIP2的構(gòu)建過程示意圖；圖5為工程菌pBI121-ZjPIP2_L的PCR鑒定圖譜；圖6(a)為棗樹不同環(huán)境、組織器官中內(nèi)參基因ZjH3的差異性表達(dá)圖譜一；圖6(b)為棗樹不同環(huán)境、組織器官中內(nèi)參基因ZjH3的差異性表達(dá)圖譜二 ；圖7為ZjPIP2基因在不同環(huán)境、組織器官的差異性表達(dá)圖譜。
具體實(shí)施例方式一、棗樹水通道蛋白基因ZjPIP2的獲得春天采集壺瓶棗樹(Ziziphus jujuba Mill.HUPING)長度約2mm的結(jié)果枝(棗 吊)，利用CTAB法提取總RNA，根據(jù)mRNA純化試劑盒(貨號:Z5200)購自Promega (美國) 方法從提取到的總RNA中分離純化mRNA。利用cDNA文庫構(gòu)建試劑盒(貨號18248_039) 購自Invitrogen (美國)構(gòu)建cDNA文庫。將獲得的文庫中的cDNA與克隆載體pSPORTl連 接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素抗性的平皿37°C培 養(yǎng)過夜，藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒，并隨機(jī)挑選部分質(zhì)粒委托上海生工測序。將測序結(jié)果利用NCBI (www, ncbi. nlm. nih. rov/)在線分析軟件進(jìn)行Blast分 析，結(jié)果表明其中的一個cDNA序列為棗樹中的水通道蛋白同源基因全序列。將其命名為 ZjPIP2 (Zizyphus jujuba Mill plasma membrane intrinsic nrotein)。根據(jù)上述已經(jīng)獲得的棗樹水通道蛋白基因的精確核苷酸序列設(shè)計(jì)并委托上海生 工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成如下引物，用于ZjPIP2基因的克隆。上游引物WP3序 列為5' -ATGGATCCATGGCAAAAGACCCTG-3 ‘，包含BamH I限制性酶切位點(diǎn)(即有下劃線部 分)，兩個保護(hù)堿基AT，及水通道蛋白ZjPIP2基因的起始密碼子ATG。下游引物WP6序列為 5 ‘ -ATACCCGGGTCAAACATGAGGGTT-3 ‘，包含Sam I限制性酶切位點(diǎn)(即有下劃線部分)，三個保護(hù)堿基ATA，及水通道蛋白ZjPIP2基因的終止密碼子TGA。引物由上海生工生物工程 技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以克隆載體pSP0RTl_ZjPIP2為模板，以WP3和WP6為引物，擴(kuò)增獲得含完整 開放閱讀框的棗樹水通道蛋白基因。PCR反應(yīng)體系組成為5 μ L 10XPCR buffer, 1 μ L 2. 5MmdNTPs, IOpmol WP3, IOpmol WP6,1. 5U Taq DNA聚合酶，50ng 的模板，去離子水補(bǔ)充體 IRM 50 μ L0 PCR 擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性 5min，94°C 30s、54°C 30s,72°C Imin 35 個循環(huán)， 最后72°C延伸5min。取5yL PCR產(chǎn)物，1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析確認(rèn)片段大小。按照DNA純化試劑 盒說明操作，純化PCR產(chǎn)物。二、ZJPIP2基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建
1、材料、試劑與儀器1.1載體和菌株植物表達(dá)載體PBI121均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心園藝作物研究室 保存，大腸桿菌(E. coli)DH5a、含ZjPIP2基因的重組質(zhì)粒pSP0RTl_ZjPIP2。1. 2酶與試劑盒限制性內(nèi)切酶 BamH I、Sma I、Xba I、Sac I、DNA Ligation Kit、RNA 酶、 PrimeScript RT reagent Kit、 Taq _、 dNTP Mixture> DNA Marker(15000bp>2000bp ladder)均購自大連TaKaRa (寶生物)工程有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 QIAquick 購自 QIAGEN 公司。1. 3常用試劑及培養(yǎng)基卡那青霉素(100mg/mL)，酚氯仿異戊醇(V V V = 25 24 1)葡萄糖溶液(IM)EDTA (0. 5M, ρΗ8· 0)10ΧΤΒΕ電泳緩沖液硼酸55.2g/LTris108g/LEDTA (0. 5M, ρΗ8· 0) 40mL10% SDS (pH7. 2)NaOH (2M)Tris-HCl (1M, pH8. 0)醋酸鈉(3M，pH5.2)TE 溶液(IOmM Tris-Hcl, IMm EDTA, pH8. 0)LB培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基加瓊脂0. 15g/L)蛋白胨0. lg/L酵母提取物 0.05g/LNaCl0. 05g/L2實(shí)驗(yàn)方法2. 1大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制作
用CaCl2法制備大腸桿菌(E.Coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞，具體方法見精編分子生物 學(xué)實(shí)驗(yàn)指南。2. 2PCR引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)棗樹水通道蛋白基因cDNA編碼的序列，設(shè)計(jì)帶有Ba mH I和Sam I酶切位點(diǎn) 的特異性引物，并委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用于ZjPIP2基因及組蛋 白基因的克隆。ZjPIP2 基因的上游引物 WP3 序列為5 ‘ -ATGGATCCATGGCAAAAGACCCTG-3 ‘，包含 BamH I限制性酶切位點(diǎn)(即有下劃線部分)，兩個保護(hù)堿基AT，及水通道蛋白ZjPIP2基因 的起始密碼子ATG。下游引物WP6 的序列為5' -ATACCCGGGTCAAACATGAGGGTT-3 ‘，包含 Sam I 限制 性酶切位點(diǎn)(即有下劃線部分)，三個保護(hù)堿基ATA，及水通道蛋白ZjPIP2基因的終止密碼 子 TGA。2. 3質(zhì)粒pBI121和pSP0RTl_ZjPIP2的少量制備及目的基因ZjPIP2的擴(kuò)增2. 3. 1 載體 pBI121、pSP0RTl-ZjPIP2 的少量制備pSP0RTl-ZjPIP2質(zhì)粒的DH5 α菌液用2mL的LB液體培養(yǎng)基加1 μ 1氨芐青霉素 (100mg/mL)接菌后37°C過夜培養(yǎng)所得。含pBI121質(zhì)粒的DH5 α菌液則用2mL的LB液體 培養(yǎng)基加1 μ L卡那青霉素(100mg/mL)接菌后37°C過夜培養(yǎng)所得。堿裂解法快速提取質(zhì)粒pBI121、pSP0RTl_ZjPIP2的具體步驟見精編分子生物學(xué)
實(shí)驗(yàn)指南。最后將干燥的質(zhì)粒溶于20 μ 1 TE中，-20°C保存?zhèn)溆谩?. 3. 2目的基因序列的擴(kuò)增以克隆載體pSPORTl (攜帶目的片段)為模板，用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增 以獲得含完整開放閱讀框的棗水通道蛋白基因。先利用梯度PCR技術(shù)設(shè)置不同的退火溫 度，找出最佳退火溫度為54°C。PCR擴(kuò)增 ZjPIP2 基因的反應(yīng)體系10 X PCRbuffer 5 μ 1 (含Mg 離子)，dNTP 1 μ 1, 上下游引物各1μ l(20pmol/L)，rTaq聚合酶0. 3 μ 1，模板DNA 1 μ 1 (2. 3 μ g/μ 1)，滅菌超 純水加40. 7 μ 1至總體積為50 μ 1。擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，54°C退 火lmin，72°C延伸2min，共40個循環(huán)，最后72°C延伸5min。2. 4目的基因ZjPIP2和載體pBI121的準(zhǔn)備因?yàn)镻CR擴(kuò)增獲得的目的基因片段兩端及PBI121載體的多克隆位點(diǎn)都具有BamH I和Sma I限制性酶切位點(diǎn)，利用BamH I和Sma I分別雙酶切目的基因Z jPIP2的PCR產(chǎn)物 及載體PBI121，使它們都具有相同的粘性末端，為連接載體做準(zhǔn)備。PCR產(chǎn)物的酶切反應(yīng)體系 注PCR產(chǎn)物的體積依據(jù)其濃度而定，最少酶切1 2 μ g目的基因片段。最后加 超純水至總體積為50 μ 1。載體pGEX-4T-l的酶切反應(yīng)體系 酶切后分別取5μ 1雙酶切產(chǎn)物，1. 0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，確認(rèn)片段大小 都與預(yù)期相吻合。2. 5酶切產(chǎn)物的純化及連接按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒QIAquick 里的說明書進(jìn)行操作，純化雙酶切后 的目的基因片段和載體。用T4DNA連接酶將純化后的pBI121載體與ZjPIP2基因片段進(jìn)行連接。將載體 PBI121的DNA與欲插入的目的基因ZjPIP2的DNA片段混合制備成體積為5 μ L左右的DNA 溶液(載體DNA和插入DNA的摩爾數(shù)比一般為0. 03pmol 0. 1 0. 3pmol)，向上述DNA溶 液中加入等體積的DNA Ligation Kit中的Solution I，充分混勻。連接反應(yīng)體系總體積為 10 μ 1左右，16°C反應(yīng)過夜。采用設(shè)計(jì)構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-ZjPIP2。2. 6連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將100 μ 1的新鮮或保存于_70°C的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α加入到上面的連接 產(chǎn)物中，輕輕混勻，冰上放置30min。放入預(yù)加溫到42°C的循環(huán)水浴中熱休克90s，快速將 管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻3 5min。加400 μ L的LB培養(yǎng)基，將管轉(zhuǎn)移到37°C的搖床 上，溫浴40min使細(xì)菌復(fù)蘇，復(fù)蘇期應(yīng)溫和的搖動細(xì)胞(轉(zhuǎn)速低于225轉(zhuǎn)/min)。將適當(dāng)體 積的已轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到LB平板(含氨芐青霉素)，涂勻。將平板置于室溫直至液體 被吸收，倒置平板，37°C靜置培養(yǎng)過夜。2. 7轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的鑒定2. 7. IPCR 鑒定待轉(zhuǎn)化菌在含有卡那霉素抗性的LB平板上長出菌落后，用無菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化單菌落至50 μ L超純水中，沸水浴5min使菌裂解。取1 μ 1作為模板進(jìn)行PCR陽性鑒定，反應(yīng)體 系為10 XPCR buffer 1. 5 μ 1 (含 Mg 離子)，dNTP 0. 2 μ 1，上下游引物各 0. 5 μ 1 (20pmol/ L)，rTaq聚合酶0. 1 μ 1，模板DNA 1μ 1 (2. 3 μ g/ μ 1)，滅菌超純水加11. 2 μ 1至總體積為 15μ 1。擴(kuò)增條件同前，將鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化體劃線培養(yǎng)。2. 7. 2酶切鑒定將PCR鑒定為陽性的克隆子用堿裂減法提取質(zhì)粒DNA后，質(zhì)粒pBI121_ZjPIP2用 XbaI和Sac I進(jìn)行雙酶切鑒定，再用Sma I和Sac I進(jìn)行雙酶切鑒定。載體pBI121_ZjPIP2的Xba I和Sac I雙酶切反應(yīng)體系 載體pBI121_ZjPIP2的Sma I和Sac I雙酶切反應(yīng)體系 S. D. W 6 μ 1瓊脂糖凝膠電泳酶切液，驗(yàn)證片段的大小，保存有目的片段的陽性菌落。并將陽性 菌株送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，驗(yàn)證重組質(zhì)粒讀碼框的正確性。3、ZJPIP2基因植物表達(dá)載體構(gòu)建的結(jié)果與分析3. lZjPIP2cDNA 的擴(kuò)增利用設(shè)計(jì)的特異性上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物在1. 0%瓊脂糖中電泳，經(jīng)EB 染色后在紫外燈下觀測到一條約850bp的條帶，如圖1所示，圖中M :DL2000Marker ；1,2 PCR產(chǎn)物，與所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增目的片段大小吻合。3. 2目的基因片段及載體片段的制備將PCR產(chǎn)物和pBI121質(zhì)粒用BamH I和Sma I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，結(jié) 果如圖 2 所示，圖中，Ml :DL15000Marker ；1 :pBI121 酶切產(chǎn)物；M2 :DL2000Marker ；2 目的 基因酶切產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物大小約為850bp，pBI121載體片段分別約為14. 7Kb，與預(yù)期結(jié)果相 符。分別用試劑盒純化目的片段與載體片段，用于連接。3. 3重組質(zhì)粒的鑒定從含有卡那霉素的培養(yǎng)基上挑取陽性單菌落進(jìn)行PCR鑒定，如圖3所示，圖中，M DL2000Marker ；1,2 陽性克隆，與預(yù)期結(jié)果相符；初步推斷重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，且重組質(zhì)粒 的大小約為15. 6Kb。測序結(jié)果表明該轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒中確實(shí)含有目的片段，且讀碼框正確，重 組質(zhì)粒構(gòu)建成功。3. 4構(gòu)建ZjPIP2基因植物表達(dá)載體小結(jié)通過PCR技術(shù)克隆得到目的基因ZjPIP2的cDNA片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I 和Sma I修飾并純化后連接到植物表達(dá)載體PBI121中；用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中；用含有卡那霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子，最后經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定及 測序證明植物表達(dá)載體pBI121-ZjPIP2構(gòu)建成功，如圖4所示，為載體的構(gòu)建圖譜，為探討 ZJPIP2基因在植物體內(nèi)的功能奠定了基礎(chǔ)。三、農(nóng)桿菌介導(dǎo)ZjPIP2基因轉(zhuǎn)化擬南芥1、材料、試劑及儀器
1.1植物材料野生型擬南芥種子來源于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心園藝作物研究室， 培養(yǎng)基質(zhì)購自山西省農(nóng)科院園藝作物研究所。1.2載體和菌株根癌農(nóng)桿菌LBA4404、植物表達(dá)載體PBI121均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究 中心園藝作物研究室保存。1-3 試劑卡那霉素購自上海生工生物工程服務(wù)有限公司；YEB、1/2MS培養(yǎng)基中所用試劑均 購自天津天大化工。1.4培養(yǎng)基及試劑配方1.4. IYEB 培養(yǎng)基蛋白胨0. 05g/L，酵母膏 0. 01g/L，蔗糖 0. 05g/L，硫酸鎂 0. 005g/L。注固體培養(yǎng)基需加終濃度為1. 0%的瓊脂粉。1.4. 21/2MS 培養(yǎng)基按配制MS培養(yǎng)基配制1/2MS培養(yǎng)基，大量元素、微量元素、有機(jī)元素、鐵鹽的量各 減半，蔗糖30g/L，瓊脂粉6g/L。其他試劑配方與ZjPIP2基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建中所用到的試劑一樣。2實(shí)驗(yàn)方法2.1擬南芥的培養(yǎng)將擬南芥種子先在95%乙醇浸泡30 60s ；再轉(zhuǎn)入2. 65%次氯酸鈉滅菌5min，其 間上下顛倒洗，5000rpm離心2min。滅菌水洗三次。然后將種子懸浮于0. 的瓊脂粉溶膠 中。用槍頭吸上懸浮液將種子點(diǎn)播于1/2MS固體培養(yǎng)基上，封口。4°C黑暗春化2d后，將擬 南芥種子在22°C，16h/8h光周期條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)擬南芥長出2片真葉時，移栽到營養(yǎng)
基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)。2. 2根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的制作，為本領(lǐng)域公知技術(shù)。2. 3工程菌pBI121-ZjPIP2_L的構(gòu)建及篩選通過凍融法將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，然后提取陽性克隆 的質(zhì)粒DNA，并通過PCR鑒定重組質(zhì)粒載體是否轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。
從28°C培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化有重組質(zhì)粒pBI121_ZjPIP2的篩選平板上隨機(jī)挑選生長良好 的若干單菌落，各取二分之一菌落至50 μ 1超純水中，沸水浴5min使菌裂解，取1 μ 1作為 模板進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定出的陽性工程菌重新劃線保存一份，備用。2. 4農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥2. 4. 1 工程菌 pBI121-ZjPIP2_L 的培養(yǎng)挑選鑒定的陽性克隆于IOmLYEB液體培養(yǎng)基(含終濃度為50 μ g/mL的卡納抗生 素)過夜培養(yǎng)后。6000rpm離心5min收集菌體，用培養(yǎng)基懸浮菌體至OD6tltl值為0. 8左右， 用于轉(zhuǎn)化擬南芥植株。2. 4. 2農(nóng)桿菌侵染擬南芥 當(dāng)擬南芥植株形成花蕾時，即可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。將含農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化介質(zhì)倒入燒 杯，將擬南芥植株的花蕾部分浸入轉(zhuǎn)化介質(zhì)3 5S后，把浸染過的植株放到塑料盤中，用薄 膜覆蓋，暗處放置過夜。然后揭開薄膜，在正常條件下，繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株。當(dāng) 擬南芥的角果枯黃、欲開裂時，收獲種子。2. 4. 3轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選將消毒的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的TO代種子播種于1/2MS篩選培養(yǎng)基(含終濃度為 50 μ g/mL的卡那抗生素)，4°C黑暗春化2d后在22°C，16h/8h光周期下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化成功的 擬南芥種子長出來的幼苗生長正常，未轉(zhuǎn)化成功的幼苗葉子發(fā)黃，生長緩慢。生長正常的擬 南芥長出2片真葉時，移栽到營養(yǎng)基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng)。3ZJPIP2基因轉(zhuǎn)化擬南芥的結(jié)果與分析3.1農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化結(jié)果將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pBI121-ZjPIP2轉(zhuǎn)人農(nóng)桿菌LBA4404，在YEB固體培養(yǎng)基 (含終濃度為50 μ g/mL的卡那霉素上篩選轉(zhuǎn)化子，從篩選平板上隨機(jī)挑選生長良好的若干 單菌落，進(jìn)行PCR檢測，PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示，圖中M:DL2000Marker :1、4、5、12、13 陽 性克隆，產(chǎn)生一條大小約為850bp的特異條帶，表明這些菌落為陽性轉(zhuǎn)化子，重組植物表達(dá) 載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404。3. 2轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得按上述方法侵染擬南芥后，將消毒的轉(zhuǎn)基因擬南芥的Ttl代種子播種于1/2MS篩選 培養(yǎng)基(含終濃度為50 μ g/mL的卡那霉素)，4°C黑暗春化2d后在22°C，16h/8h光周期下 培養(yǎng)。經(jīng)觀察，抗卡那霉素的擬南芥幼苗生長正常，且有真葉形成，而不抗卡那霉素的擬南 芥幼苗比較小，葉子發(fā)黃，也沒有真葉形成。對轉(zhuǎn)基因擬南芥植物及其Tl代進(jìn)行耐鹽性評價及耐旱性性評價，選取對照、干旱 處理、NaCl處理的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物及其Tl代。每天下午給對照澆充足的水，NaCl處理的 苗各澆0. IM NaCl溶液500ml，干旱處理的苗不澆任何液體。連續(xù)處理3天后，觀察其生長 表現(xiàn)，結(jié)果表明，經(jīng)過兩種脅迫處理的轉(zhuǎn)基因擬南芥及其Tl代均能夠在正常生長條件下恢 復(fù)，而對照則死亡。3. 3轉(zhuǎn)ZjPIP2基因擬南芥小結(jié)通過凍融法將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pBI121_ZjPIP2轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài) 細(xì)胞中，經(jīng)含卡納霉素的YEB平板篩選、PCR鑒定成功構(gòu)建工程菌pBI121-ZjPIP2-L;工程 菌介導(dǎo)ZjPIP2基因侵染擬南芥，經(jīng)含有卡納霉素的1/2MS培養(yǎng)基篩選獲得含有目的基因ZJPIP2的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，并對轉(zhuǎn)基因擬南芥植物進(jìn)行耐鹽性評價及耐旱性性評價，為 研究ZjPIP2基因在植物體內(nèi)的表達(dá)定位、功能及調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
四、ZjPIP2在棗樹體內(nèi)的表達(dá)1材料、試劑及儀器1.1植物材料壺瓶棗(Ziziphus jujuba Mill hupingzao)樹苗由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù) 研究中心園藝作物研究室提供。1.2試劑及儀器設(shè)備NaCl購自天津天大化工；飽和酚、DEPC及RNA提取過程中所用到的試劑均購自上 海生工生物工程有限公司。1.3試劑配方與ZjPIP2基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建中所用到的試劑一樣。2實(shí)驗(yàn)方法2. 1材料的準(zhǔn)備及采集將壺瓶棗樹苗移栽到直徑為50厘米的大花盆中。放置戶外正常培養(yǎng)，對照、干旱 處理、NaCl處理的棗苗各三盆。每天下午給對照棗苗澆充足的水，NaCl處理的棗苗各交 0. IM NaCl溶液500ml，干旱處理的棗苗不澆任何液體。連續(xù)處理3天后，經(jīng)過脅迫處理的 早樹苗開始出現(xiàn)卷葉癥狀。兩周后，兩種脅迫處理的棗苗卷葉、枯黃現(xiàn)象嚴(yán)重，然后進(jìn)行取 樣。取每盆植株的根、莖、葉、結(jié)果枝莖段到50mL離心管中，液氮速凍后保存于-80°C冰箱， 用于RNA的提取。2. 2植物RNA的抽提和質(zhì)量檢測2. 2. 1植物材料RNA的提取CTAB法提取植物材料的總RNA。2. 2. 2RNA 質(zhì)量檢測采用甲醛變性膠電泳法來檢驗(yàn)RNA是否降解，同時用分光光度計(jì)檢測其純度和濃度。(1)測所抽提RNA的0D260值取1μ 1 RNA 力卩到 99 μ 1 RNA-free water 中，用分光光度計(jì)(印pendorf BioPhotometer)檢測RNA質(zhì)量，如果0D26(1/0D28(1 = 2.0那么RNA的質(zhì)量非常好，純度高，無 降解，可以用于反轉(zhuǎn)錄。(2)甲醛變性膠電泳RNA甲醛變性電泳液1XM0PS 500 600ml 用 DEPC 處理過的水稀釋 20XM0PS 20 倍。瓊脂糖變性膠配制方法如下水(經(jīng)DEPC 處理)44mL甲醛3. OmL20 X MOPS3. OmL瓊脂糖0.6g加熱溶解后再加水至總體積為60ml，使溶液冷卻。
注制膠時先將水、MOPS、瓊脂糖融化，室溫放置至冷卻到60°C，再加入甲醛，混勻 并置通風(fēng)櫥中15分鐘后倒入制膠器中。RNA變性Buffer配制方法如下 RNA樣品分別加3倍體積的RNA變性Buffer，混勻后在65°C水浴中溫浴lOmin，置 于冰水混合物上使之冷卻；點(diǎn)樣，電泳，EB染色40min，S. D. W洗三次，每次15min，紫外檢測 照相，能看到較分明的兩條帶，且前后兩條帶亮度比接近2 1，則RNA可用。2. 3RNA 的反轉(zhuǎn)錄及 RT-PCR2. 3. 1 反轉(zhuǎn)錄 RNA按試劑盒PrimeScrip RT reagent Kit說明將2. 6. 2. 2所提的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 反轉(zhuǎn)錄體系如下5XPrime Script Buffer8μ 1Prime Script Enzyme MixI 1 μ 1Oligo dT Primer1 μ 1Random 6mers1 μ 1Total RNA2 μ gS. D. Wup to 40 μ 1反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序?yàn)?7°C 15min (反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))，85°C 5sec (反轉(zhuǎn)錄酶的失活反 應(yīng))。2. 3. 2內(nèi)參基因ZjH3引物的設(shè)計(jì)與合成孫海峰等[66]研究表明棗樹ZjH3基因可作為內(nèi)參基因?qū)jPIP2基因進(jìn)行mRNA表 達(dá)水平的檢測。由序列號EU916201獲得ZjH3基因序列，根據(jù)所得序列設(shè)計(jì)內(nèi)參基因ZjH3 的特異性引物，并委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，用于ZjH3基因的克隆分 析。內(nèi)參基因Z jH3的上游弓丨物序列為Z1 5，-ATGGATCCATGGCACGGACAAAGCA-3，，包含 BamHI限制性酶切位點(diǎn)(即有下劃線部分)，兩個保護(hù)堿基AT，及組蛋白基因的起始密碼子 ATG。下游引物序列為Z2 :5，-TATACCCGGGCTAAGCCCTCTCGCC-3’,包含 Sam I 限制性酶切 位點(diǎn)(即有下劃線部分)，四個保護(hù)堿基TATA，及組蛋白基因的終止密碼子CTA。2. 3. 3RT-PCR 分析以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，WP3、WP6 ；Zl, Z2為引物，PCR鑒定棗樹水通道蛋白的表 達(dá)位置及各種脅迫處理后的表達(dá)情況。反應(yīng)體系為10XPCR buffer 1.5μ1(含Mg離 子)，dNTPO. 2 μ 1，上下游引物各 0. 5 μ 1 (20pmol/L)，rTaq 聚合酶 0. 1 μ 1，模板 cDNA 1 μ 1(2. 3 μ g/μ 1)，滅菌超純水加11. 2μ 1至總體積為15 μ 1。擴(kuò)增條件同2. 2. 3. 2，WP3 >WP6的退火溫度為54°c，Z1, Z2的退火溫度為56°C。3干旱、NaCI脅迫下ZjPIP2的表達(dá)分析結(jié)果
3. IRNA的質(zhì)量檢測結(jié)果3. 1. 1 測定所提 RNA 的 0D260 值將所提RNA按1 99與S. D. W配好后，分光光度計(jì)測得的RNA濃度見表1 表1棗苗處理后分子數(shù)據(jù)材料總RNA 濃260/280 260/230 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)度用量 物濃度(ug/ml)(ul) (ug/ml)對照根 1170.1 1.85 2.6311116.5蓮 316.9 1.83 2.4841343.8葉 1637.3 1.82 2.6911484.5結(jié) 1082.5 1. 79 2. 6611169.3干旱脅迫根31.9 1.99 1.7720 1595.8蓮 2393.3 2.06 2.4911796.1葉 1977.6 2.04 2.5311621.5結(jié) 2840.4 2.04 2. 5511516.8NaCl 脅迫根 172.2 1.95 2.1620 1078.2蓮 30. 3 3. 79 1. 6820 1433. 4葉 11894 1.99 2. 260.5 1459.7結(jié) 3863.6 2.00 2. 5211427. 73. 1.2甲醛變性膠電泳將所提RNA樣品處理后，進(jìn)行甲醛變性膠電泳，凝膠成像分析儀下觀察所提RNA質(zhì) 量，如果看到較分明的兩條帶，且前后兩條帶亮度比接近2 1，表明所提RNA純度高、無降 解、可用于反轉(zhuǎn)錄。3. 2ZJPIP2在不同脅迫下的RT-PCR分析結(jié)果按上述方法反轉(zhuǎn)錄所提RNA，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物濃度見表1 ；然后再分別以ZpZ2JP3JPe 為引物對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR分析，瓊脂糖凝膠電泳RT-PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖6 (a)、圖 6(b)所示，如圖7所示圖6(a)中，M :DL2000Marker ；1 質(zhì)粒對照；.2-5 干旱處理植株的根、莖、葉、結(jié)果 枝莖段；圖6(b)中，2-5 對照植株的根、莖、葉、結(jié)果枝莖段；6-9 =NaCl處理植株的根、莖、 葉、結(jié)果枝莖段，表明ZjH3基因在對照和處理所有植株的不同組織均有表達(dá)，進(jìn)一步表明 所提RNA可用。圖7中，M :DL2000Marker ；1 質(zhì)粒對照；2_5 對照植株的根、莖、葉、結(jié)果枝 莖段6-9 干旱處理植株的根、莖、葉、結(jié)果枝莖段；10-13 =NaCl處理植株的根、莖、葉、結(jié)果 枝莖段.顯示棗水通道蛋白在對照植株的莖和葉片中有表達(dá)，葉片中的表達(dá)量相對少一點(diǎn) 兒；在干旱處理過的植株的莖、葉、結(jié)果枝莖段中均有表達(dá)，結(jié)果枝莖段經(jīng)干旱脅迫表達(dá)了 目的基因，葉中的表達(dá)量現(xiàn)相對對照有所增加；在NaCl處理過的植株中，莖、葉、結(jié)果枝莖 段均有表達(dá)，而且莖、葉中的表達(dá)量比對照增加顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ZjPIP2蛋白在莖、葉中 的表達(dá)比較穩(wěn)定，證實(shí)逆境因素可誘導(dǎo)目的基因在結(jié)果枝中的表達(dá)。
3. 3ZJPIP2表達(dá)研究小結(jié)分別對盆栽壺瓶棗樹苗進(jìn)行干旱、NaCl脅迫處理，并以未作任何處理的正常壺瓶棗樹苗為對照，研究逆境因素對ZjPIP2基因表達(dá)的影響，當(dāng)處理過的樹苗出現(xiàn)嚴(yán)重卷葉、 枯黃現(xiàn)象時，立即采樣并速凍保存于-80°C冰箱。用CTAB法提取所采集到的對照及脅迫處 理過的植物材料的總RNA，經(jīng)OD26tl值的測定、甲醛變性膠電泳等方法檢測證明所提RNA純度 高、無降解，質(zhì)量合格。反轉(zhuǎn)錄所提RNA，RT-PCR分析得ZjPIP2基因在植物莖、葉中的表達(dá) 比較穩(wěn)定，并推測ZjPIP2可受干旱、NaCl脅迫等逆境因素誘導(dǎo)表達(dá)。
權(quán)利要求
一種棗樹水通道蛋白基因，其特征是該基因的核苷酸序列具有如SEQ ID NO1所示的序列。
2.由權(quán)利要求1所述一種棗樹水通道蛋白基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，其特 征是該氨基酸序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列。
3.一種棗樹水通道蛋白基因在提高植物耐旱性和耐鹽性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種棗樹水通道蛋白基因及在提高植物耐旱性和耐鹽性中的應(yīng)用，該基因的核苷酸序列以及氨基酸序列如序列表中所示SEQ ID NO1和SEQID NO2，本發(fā)明構(gòu)建植物表達(dá)載體，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，對其進(jìn)行耐鹽性評價及耐旱性性評價，證明其可用在提高植物耐旱性和耐鹽性中。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)并從棗樹中克隆出棗樹水通道蛋白基因ZjPIP2，該基因可作為目的基因?qū)胫参?，提高植物耐鹽性和耐旱性，以進(jìn)行植物品種改良，明確了具有優(yōu)良抗性的棗樹的抗逆機(jī)制，逆境相關(guān)基因的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)、功能及調(diào)控，為進(jìn)一步充分利用這些優(yōu)良抗性基因提高植物的抗逆性提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，奠定了一定的理論基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/29GK101880674SQ201010239449
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者孟玉平, 張潔, 曹秋芬, 顧蓉 申請人:山西省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心