一株煙堿高效降解菌及培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物應用【技術領域】，公開了一株煙堿高效降解菌及其培養(yǎng)方法。菌株為噬組氨醇節(jié)桿菌EA-17（Arthrobacter?histidinolovorans），保藏號為CCTCC?NO：M2013405。在煙堿初始濃度為2g/L的培養(yǎng)基中，噬組氨醇節(jié)桿菌EA-17在12小時內對煙堿的降解率達到87.71%；對于煙堿初始濃度為4g/L時，菌株在24小時內對煙堿降解率達95.64%。本發(fā)明優(yōu)化了噬組氨醇節(jié)桿菌EA-17的培養(yǎng)方法，在本發(fā)明公布的培養(yǎng)方法下培養(yǎng)10h～16h，噬組氨醇節(jié)桿菌EA-17的菌量可達9×108CFU/mL～109CFU/mL。
【專利說明】一株煙堿局效降解菌及培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及一株煙堿高效降解菌及培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]煙堿即尼古丁，是煙草中含量最多的一種生物堿，約占煙草生物堿的95%和煙草干重的0.5%-6%。煙堿對人體和環(huán)境都有一定的危害作用。煙堿是香煙中的一種主要有害物質，對人體的危害已得到大量揭示，會引起人體心率加快、血管收縮、血壓升高等，長期吸煙會增大人患呼吸道疾病和心血管疾病的幾率；我國每年因種植煙草產生煙草廢棄物，大量煙草廢棄物沒有被及時處理而被堆放在田間，在堆放的過程中煙堿會從煙桿中釋放溶入土壤中，造成土壤的污染；卷煙廠在生產的過程中，在清洗、蒸煮、制絲等過程中會產生大量廢水，這些廢水中含有一定濃度的煙堿，直接排放會對水體造成嚴重的污染。
[0003]降解煙堿的方法有很多，微生物降解煙堿被認為是高效、安全環(huán)保，而且低成本的方法。早在上個世紀就有微生物降解煙堿的科研報道，研究者陸續(xù)篩選出多種可降解煙堿的真菌、細菌等，主要包括節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)等。其中節(jié)桿菌屬和假單胞菌屬是降解煙堿優(yōu)勢菌種。
[0004]但目前篩選出的降解煙堿微生物存在降解效率較低或降解不夠充分等問題。丁懷宇等(2012)從白肋煙和烤煙中篩選出幾株煙堿降解菌，24h內對4g/L煙堿的最高降解率為50.25% ;彭宇等(2011)報道摩氏摩根氏菌F4 (Morganellamorganii F4)對煙草廢棄物浸提液中煙堿的降解率可達84 ~96%，但需要5~IOd的降解周期。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一株具有高效降解煙堿能力的降解菌及其培養(yǎng)方法。
[0006]為實現上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案為:
[0007]一株煙堿高效降解菌，所述降解菌分類命名為噬組氨醇節(jié)桿菌(Arthrobacterhistidinolovorans)EA-17，已于2013年9月10日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為 CCTCC N0:M2013405o
[0008]上述煙堿高效降解菌的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基的各組分為:K2HP04lg/L~14g/L，KH2PO41 g/L ~5g/L,煙堿 0.lg/L ~5g/L,葡萄糖 5g/L ~20g/L,蛋白胨 5g/L ~15g/L,玉米衆(zhòng)干粉 lg/L ~10g/L,硫酸銨 lg/L ~15g/L, MgSO40.lg/L ~0.3g/L, FeSO40.lg/L ~0.3g/L ;培養(yǎng)條件為:30°C~37°C，pH6~8，種齡18~24h，接種量0.1~10%。
[0009]本發(fā)明的有益效果:
[0010](I)采用本發(fā)明所述培養(yǎng)方法對噬組氨醇節(jié)桿菌(Arthrobacterhistidinolovorans)EA-17進行培養(yǎng)，培養(yǎng)10~16h后，菌體生物量可以達至Ij 9X108CFU/mL ~109CFU/mL。
[0011](2)本發(fā)明所述卩遼組氨醇節(jié)桿菌(Arthrobacter histidinolovorans) EA-17具有高效降解煙堿的能力，對于煙堿初始添加濃度為2g/L，所述菌株12h對煙堿的降解率達到87.71% ;對于煙堿初始添加濃度為4g/L，所述菌株24h對煙堿的降解率達95.64%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明所述卩遼組氨醇節(jié)桿菌(Arthrobacter histidinolovorans)EA_17在LB培養(yǎng)基上的生長形態(tài)。
[0013]圖2為本發(fā)明所述卩遼組氨醇節(jié)桿菌(Arthrobacter histidinolovorans)EA-17的革蘭氏染色鏡檢結果。
[0014]圖3為本發(fā)明所述卩遼組氨醇節(jié)桿菌(Arthrobacter histidinolovorans)EA_17基于16S rDNA基因序列的菌株系統進化樹。
[0015]圖4為本發(fā)明所述卩遼組氨醇節(jié)桿菌(Arthrobacter hi stidino lovorans )EA-17降解煙堿的特性圖。
【具體實施方式】
[0016]為了更好地理解本發(fā)明，下面結合實施例、附圖和附表進一步闡明本發(fā)明的內容，但本發(fā)明的內容不僅僅局限于下面的實施例。
[0017]一株煙堿高效降解菌，該菌株分類命名為噬組氨醇節(jié)桿菌(Arthrobacterhistidinolovorans) EA-17,已于2013年9月10日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M2013405o
[0018]實施例1
[0019]1、煙堿降解菌的篩選
[0020]1.1培養(yǎng)基
[0021]富集培養(yǎng)基=K2HPO4.3H2013.3g，KH2P044g, MgSO4.7H200.2g，0.5mL 微量元素溶液，加水至1L。培養(yǎng)基滅菌后，煙堿用0.22 μ m濾膜過濾除菌后按1.5g/L的含量加入。
[0022]分離培養(yǎng)基:富集培養(yǎng)基中添加1.5wt%含量的瓊脂粉。
[0023]微量元素溶液:0.05g CaCl2.2H20,0.05g CuCl2.2H20,0.008g MnSO4.H20,0.004gFeSO4.7H20，0.1 g ZnSO4,0.1g Na2MoO4.2H20 用少量 0.lmol/L HCl 溶解，再加水至 IL0
[0024]LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加水至1L，調節(jié)ρΗ7.2~7.4。
[0025]1.2煙堿降解菌的初篩
[0026]初篩菌株從三條途徑得到，它們的具體操作是:
[0027](I)煙草區(qū)土樣:在常年種植煙草的區(qū)域取Ig 土樣加入富集培養(yǎng)基中，30°C，180r/min培養(yǎng)三天，轉接ImL培養(yǎng)物到另一富集培養(yǎng)基中，30°C，180r/min再培養(yǎng)三天，稀釋涂布發(fā)酵液到分離培養(yǎng)基中。30°C，培養(yǎng)4-6天，將生長出的單菌落純化到分離培養(yǎng)基上，30°C，培養(yǎng)4-6天，保藏。
[0028](2)煙桿:將0.5g煙桿加入30mL生理鹽水中，30°C，180r/min，震蕩30min，取ImL
震蕩液加入富集培養(yǎng)基中，30°C，180r/min培養(yǎng)三天，稀釋涂布發(fā)酵液到分離培養(yǎng)基中，300C，培養(yǎng)4-6天，將生長出的單菌落純化到分離培養(yǎng)基上，300C，培養(yǎng)4-6天，保藏。
[0029](3)實驗室已保藏菌株:LB活化實驗室已保藏菌株，挑單菌落到分離培養(yǎng)基上，300C，培養(yǎng)4-6天，得到可以利用煙堿生長的菌株，保藏。[0030]通過以上方法，共得到81株可以降解煙堿的菌株，其中從土樣、煙桿、實驗室已保
藏菌株中分別篩選到26株、10株和45株。
[0031]1.3煙堿降解菌的復篩
[0032]將初篩到的81株菌株接種到含1.5g/L初始煙堿濃度的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)10h，
通過檢測，煙堿降解率達到50%以上的菌株有6株，其中一株從土樣富集篩選獲得的菌株
EA-17降解煙堿效率最高，其降解率為72.3%，發(fā)酵液呈藍紫色。實驗室保藏菌株、土樣、煙
桿中篩選到的降煙堿菌株的降解率分別如表1、表2、表3所示。
[0033]表1實驗室已保藏菌株煙堿降解率
【權利要求】
1.一株煙堿高效降解菌，其特征在于，所述菌株分類命名為噬組氨醇節(jié)桿菌(Arthrobacter histidinolovorans)EA_17,已于2013年9月10日保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2013405。
2.權利要求1所述煙堿高效降解菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，培養(yǎng)基的各組分為:K2HPO41g/L ~14g/L, KH2PO41g/L ~5g/L,煙堿 0.lg/L ~5g/L,葡萄糖 5g/L ~20g/L,蛋白胨 5g/L ~15g/L,玉米衆(zhòng)干粉 lg/L ~10g/L,硫酸銨 lg/L ~15g/L, MgSO40.lg/L ~0.3g/L,FeSO40.lg/L~0.3g/L ;培養(yǎng)條件為:30°C~37。。，pH6~8，種齡18~24h，接種量0.1~.10%。
【文檔編號】C12N1/20GK103789238SQ201410039634
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月27日 優(yōu)先權日:2014年1月27日
【發(fā)明者】陳守文, 王昌軍, 余君, 冀志霞, 伍良偉, 楊亮, 徐迪紅, 李進平, 祖秉橋, 楊樹 申請人:華中農業(yè)大學, 湖北省煙草科學研究院