專利名稱：修飾高等植物基因組的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于基于同源重組的修飾高等植物基因組的基因構(gòu)建體，及其利用攜帶該基因構(gòu)建體的植物轉(zhuǎn)化載體來(lái)生產(chǎn)具有基因組被修飾的高等植物的方法。本發(fā)明涉及一種有效的和可重復(fù)的方法，其中以植物的內(nèi)源基因組序列為靶標(biāo)來(lái)產(chǎn)生沒(méi)有改變其原始基因座的同源重組體。
相關(guān)
背景技術(shù)：
在高等植物中，將基因?qū)氲诫p子葉植物中通常使用的方法是以Ti質(zhì)粒中的T-DNA在細(xì)胞間進(jìn)行轉(zhuǎn)移和染色體整合為基礎(chǔ)的，這發(fā)生在病原菌根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的侵染過(guò)程中。為了實(shí)現(xiàn)該目的，構(gòu)建了比較小型的雙元載體，被設(shè)計(jì)成只含有Ti質(zhì)粒上的為轉(zhuǎn)移基因所需要的那些區(qū)域，并且能夠在E.coli與根癌農(nóng)桿菌之間進(jìn)行穿梭。在單子葉植物中，經(jīng)常采用電穿孔法或其它技術(shù)直接將DNA導(dǎo)入到原生質(zhì)體中，但也有一些成功利用農(nóng)桿菌侵染法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的報(bào)道。
然而，這些策略沒(méi)有能夠控制所導(dǎo)入的基因在染色體上的位置和拷貝數(shù)，因而很難獲得導(dǎo)入基因的預(yù)期表達(dá)，這是由于多種現(xiàn)象包括導(dǎo)入的外源基因的位置效應(yīng)、共抑制和基因沉默等的存在。
另一方面，也有利用反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座的基因破壞法，其中植物基因被TOS17所破壞(Applications of retrotransposons as genetic tools in plant biology.2001Trends in Plant Science 6127-134)。該方法可以對(duì)基因組修飾，但由于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在基因組上的轉(zhuǎn)座位置不具有特異性，因而要獲得具有預(yù)期修飾基因的整株植物要求大量的勞動(dòng)。而且，該方法雖也可以進(jìn)行基因破壞，但不能隨意的對(duì)任何位點(diǎn)進(jìn)行突變或取代。
T-DNA標(biāo)記(tagging)法涉及通過(guò)農(nóng)桿菌感染將T-DNA插入而產(chǎn)生基因破壞(Plant tagnology.1999 Trends in Plant Science 490-96)。與利用TOS17的情況一樣，該方法也要求大量的勞動(dòng)以獲得預(yù)期修飾的基因的整株植物，因?yàn)門(mén)-DNA在插入到基因組上的位置也不具有特異性。而且，該法雖也可以進(jìn)行基因破壞，但不能隨意的對(duì)任何位點(diǎn)進(jìn)行突變或取代。
Zhu T等報(bào)道了利用嵌合RNA/DNA寡聚核苷酸技術(shù)，其中嵌合RNA/DNA寡聚核苷酸被用于對(duì)玉米基因組的基因中引入單核苷酸取代，因而賦予了玉米對(duì)除草劑的抗性(Targeted manipulation of maize genes in vivousing chimeric RNA/DNA oligonucleotides.Proc Natl Acad Sci USA 199996(15)8768-8773)。該技術(shù)可以對(duì)內(nèi)源基因的非常小的區(qū)域中導(dǎo)入突變，但不能適用于對(duì)大區(qū)域的修飾。
就上面所述而言，基于同源重組的基因組修飾方法已發(fā)展成為用于表達(dá)預(yù)期外源基因的潛在方法。這種方法的特征是被插入的外源基因是夾在同源區(qū)域的中間以在外源基因兩側(cè)誘導(dǎo)同源重組。同源重組是指兩個(gè)同源DNA鏈之間的交換。
另一方面，植物基因組結(jié)構(gòu)包含比動(dòng)物更多的重復(fù)序列。尤其是，已認(rèn)為同源重組在植物體細(xì)胞中是受到抑制的。在擬南芥和煙草中，用人為插入到基因組的標(biāo)記基因作為同源重組的靶標(biāo)，其同源重組的頻率估計(jì)在10-4到10-6之間(Gene targeting in plants.EMBO J 1988 74021-4026.Extrachromosomal homologous recombination and gene targeting in plant cellsafter Agrobacterium mediated transformation.EMBO J 1990 93077-3084，Nonreciprocal homolgous recombination between Agrobacterium transferredDNA and a plant chromosomal locus.Proc Natl Acad Sci 1993 907346-7350)。
然而，這些基于同源重組的修飾高等植物基因組的策略中，如下所述，只有關(guān)于初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果的少數(shù)報(bào)道。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以分成下述兩種情況i)利用人為插入的遺傳標(biāo)記和ii)以植物的內(nèi)源基因組序列為靶標(biāo)。
對(duì)利用人為插入的遺傳標(biāo)記基因第i)種情況，下面列出的報(bào)道是已知的。
據(jù)報(bào)道，通過(guò)表達(dá)大腸桿菌的RecA或RuvC基因或者通過(guò)導(dǎo)入提高同源重組的頻率的酵母HO或I-SceI內(nèi)切核酸酶基因的方式進(jìn)行DNA雙鏈斷裂來(lái)增強(qiáng)人為插入到煙草或擬南芥的標(biāo)記基因的同源重組(RecA proteinstimulates homologous recombination in plants.Proc Natl Acad Sci USA 1996933094-3098，Stimulation of homologous recombination in plants by expressionof the bacterial resolvase RuvC.Proc Natl Acad Sci USA 1999 967398-7402，Enhancement of somatic intrachromosomal homologous recombination inArabidopsis by the HO endonuclease.The Plant Cell 1996 82057-2066，Homologous recombination in plant cellis enhanced by in vivo induction ofdouble strand breaks into DNA by a site-specific endonuclease.Nucleic AcidResearch 1993 215034-5040)。
Paszkowski J等報(bào)道了在煙草原生質(zhì)體中通過(guò)同源重組成功地對(duì)基因組進(jìn)行修飾。這是第一個(gè)在植物中成功的例子，使通過(guò)同源重組對(duì)植物基因組進(jìn)行修飾成為了可能。該報(bào)道采用了一個(gè)選擇體系，首先將缺失的不具有功能的卡那霉素抗性基因(正選擇標(biāo)記)導(dǎo)入到基因組中，然后用基因的再次導(dǎo)入所獲得的細(xì)胞中以恢復(fù)所缺失的區(qū)域，繼而進(jìn)行對(duì)卡那霉素的抗性篩選(Gene targeting in plants.EMBO J 1988 74021-4026)。
Risseeuw E等報(bào)道了通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生同源重組的一煙草培養(yǎng)細(xì)胞系。他們首先將GUS和codA基因整合到基因組，然后對(duì)所獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞用基因進(jìn)行再次轉(zhuǎn)化，其能夠通過(guò)同源重組造成GUS基因的部分缺失和codA基因的全部缺失并重新整合進(jìn)卡那霉素抗性基因。他們通過(guò)對(duì)5-氟胞嘧啶的敏感性、對(duì)卡那霉素的抗性、GUS活性和PCR等進(jìn)行篩選來(lái)選擇同源重組體，接著進(jìn)行Southern印跡進(jìn)一步驗(yàn)證(Gene targeting andinstability of Agrobacterium T-DNA loci in the plant genome.Plant J 1997，11(4)717-728)。
Offringa R等報(bào)道了通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化而獲得了一個(gè)發(fā)生同源重組的煙草培養(yǎng)細(xì)胞系。這使得農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化應(yīng)用于通過(guò)同源重組的對(duì)植物基因組進(jìn)行修飾的成為可能。但沒(méi)有關(guān)于該方法的可重復(fù)性的討論。他們先將部分缺失的卡那霉素抗性基因整合到基因組中，然后對(duì)所得到的細(xì)胞再次用彌補(bǔ)了缺失區(qū)的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化。他們也通過(guò)卡那霉素抗性和PCR和進(jìn)一步Southern印跡的確證而獲得了同源重組體(Extrachromosomalhomologous recombination and gene targeting in plant cells after Agrobacteriummediated transformation.EMBO J 1990，9(10)3077-3084)。
Halfter U等報(bào)道通過(guò)PEG的方法對(duì)擬南芥(Arabidopsis)原生質(zhì)體進(jìn)行遺傳修飾而獲得了發(fā)生同源重組的4個(gè)克隆。他們先將部分缺失的潮霉素抗性基因整合到基因組中，然后用彌補(bǔ)了缺失區(qū)的基因再次轉(zhuǎn)化所得到的細(xì)胞。他們也通過(guò)潮霉素抗性和PCR及進(jìn)一步Southern印跡的證實(shí)而選擇同源重組體(Gene targeting in Arabidopsis thaliana..Mol Gen Genet 1992，231(2)186-193)。
相反，只有如下所述的兩篇報(bào)道是關(guān)于第ii)情況的，即以植物內(nèi)源基因組序列為靶標(biāo)通過(guò)同源重組來(lái)獲得對(duì)基因組的修飾。
Miao ZH等通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥的根而從2580個(gè)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中獲得發(fā)生了同源重組的一個(gè)細(xì)胞系。他們將卡那霉素抗性基因通過(guò)同源重組而插入到基因組的TGA3基因座。這是第一次通過(guò)同源重組而達(dá)到修飾植物內(nèi)源基因組的成功例子。除了對(duì)卡那霉素抗性的篩選外，他們還嘗試了在細(xì)胞中表達(dá)通過(guò)非同源重組而整合外源基因的β-葡糖酸醛酶，因而提高了選擇效率。此外，用PCR和Southern印跡以驗(yàn)證同源重組。然而，這個(gè)細(xì)胞系沒(méi)有能夠再生成完整的植株，因而未能得到對(duì)于同源重組區(qū)是純合的個(gè)體(Targeted disruption of the TGA3 locus in Arabidopsis thaliana.Plant J 1995，7(2)359-365)。
Yanofsky MF等報(bào)道在對(duì)擬南芥進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化時(shí)以獲得了發(fā)生同源重組的一個(gè)細(xì)胞系。他們將卡那霉素抗性基因插入到基因組的AGL5基因中，并用卡那霉素抗性和PCR選擇而從750個(gè)卡那霉素抗性系中獲得了一個(gè)系，繼而通過(guò)Southern印跡和PCR進(jìn)行了最終的驗(yàn)證(Targeteddisruption in Arabidopsis.Nature 1997，389(6653)802-803)。
同時(shí)，如下所述的報(bào)道表明，利用同源重組企圖獲得發(fā)生了同源重組的細(xì)胞，但沒(méi)有成功。
Thykjaer T等企圖用農(nóng)桿菌來(lái)使Lotus japonigus中發(fā)生同源重組。為了達(dá)到這個(gè)目的，他們用codA基因作為負(fù)選擇標(biāo)記而制備了數(shù)個(gè)載體，例如設(shè)計(jì)成在T-DNA的一側(cè)或兩側(cè)攜帶該標(biāo)記。然而，他們未能獲得發(fā)生了同源重組的細(xì)胞(Gene targeting apoproaches using positive-negative selectionand large flanking regions.Plant Mol Biol 1997，35(4)523-530)。
Gallego ME等在擬南芥的轉(zhuǎn)化中利用了卡那霉素抗性基因作為正選擇標(biāo)記，codA基因作為負(fù)選擇標(biāo)記。然而，他們也沒(méi)有從1×105個(gè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中獲得同源重組的細(xì)胞(Positive-negative selection and T-DNA stability inArabidopsis transformation.Plant Mol Biol 1999，39(1)83-93)。
發(fā)明概述如上所述，基于同源重組的基因組修飾具有許多優(yōu)點(diǎn)。然而，由于在高等植物中的同源重組率非常低，如上所提及的只有兩篇關(guān)于在高等植物中通過(guò)同源重組對(duì)其內(nèi)源基因組序列修飾成功的報(bào)道(Miao ZH等和Yanofsky MF等)。而且這兩篇均沒(méi)有提出一種可重復(fù)和可靠的同源重組方法。此外，也沒(méi)有關(guān)于在單子葉植物上成功的報(bào)道，雖然單子葉植物對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是非常重要的。因此，非常需要研究出一種在高等植物中可以重復(fù)的并且可靠的同源重組方法。
考慮到以往的技術(shù)，本發(fā)明的目的是克服高等植物細(xì)胞包括單子葉植物(如水稻(rice))細(xì)胞的常規(guī)轉(zhuǎn)化中的各種問(wèn)題。這些問(wèn)題包括與外源基因轉(zhuǎn)移相關(guān)的問(wèn)題，如導(dǎo)入的外源基因的拷貝數(shù)和位置效應(yīng)或由于共抑制、基因沉默等導(dǎo)致的表達(dá)不穩(wěn)定。因此，本發(fā)明提供一種基因構(gòu)建體和用于對(duì)植物基因組進(jìn)行修飾的載體，意在將其用于這樣一種方法，即除了要被修飾的基因區(qū)域外并不導(dǎo)致基因組中的任何其它改變，以及用上述方法得到的轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生整個(gè)轉(zhuǎn)化植株的方法。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示用水稻W(wǎng)axy基因作為例子來(lái)說(shuō)明的對(duì)高等植物基因組進(jìn)行修飾的概念性圖解。圖1a是所導(dǎo)入的基因和Waxy基因之間進(jìn)行同源重組的示意圖，圖1b是同源重組之后Waxy位點(diǎn)的示意圖。
圖2顯示基因組修飾載體的示意圖。圖2a、2b和2c分別是對(duì)照載體、pINA134基本載體和用于Waxy基因修飾的載體的示意圖。在圖2中，縮寫(xiě)的定義分別如下pUbi為玉米遍在蛋白1啟動(dòng)子；iUbi玉米遍在蛋白1的第一內(nèi)含子；DT為白喉毒素蛋白A鏈；lox為噬菌體Cre/lox重組體系的lox序列；pAct為水稻激動(dòng)蛋白啟動(dòng)子；iAct為水稻激動(dòng)蛋白的第一內(nèi)含子；hph為潮霉素抗性基因；t35S為花椰菜花葉病毒35S終止子；En/Spm為En/Spm型轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)；iCat為蓖麻子過(guò)氧化氫酶基因的第一內(nèi)含子；p35S為花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子；tNos為胭脂堿合成酶終止子。
圖3是pUbip-int-DT-A、p35Sp-int-DT-A和pUbip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A(ΔHindIII)的示意圖。
圖4為pGS-SalI和pGS-SalI-Ubip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A(ΔHindIII)的示意圖。
圖5顯示pINA134載體的構(gòu)建即pAch1-En/Spm和pAch1-En/Spm2的示意圖。
圖6為Waxy基因座、靶向載體以及同源重組之后的物理圖譜。
圖7顯示對(duì)同源重組體的分析。圖7a顯示利用HIF和W2R引物進(jìn)行的PCR分析。除此之外，圖7還表明了Southern分析結(jié)果，其中DNA是從PCR一陽(yáng)性克隆所再生出的整株植株的綠葉中分離的，并用HindIII或MunI進(jìn)行消化。圖7b顯示利用HindIII的基因組的Southern分析。圖7c顯示利用MunI基因組的Southern分析。在圖7中，RCV表示陽(yáng)性對(duì)照載體，N表示的是非重組體，而A1、A2、B、C、E和F分別表示從A-I、A-II、B、C、E和F系再生出的完整植株。
圖8顯示碘染色結(jié)果。
圖9顯示同源重組體的再生過(guò)程。圖9a顯示潮霉素抗性愈傷組織，圖9b顯示再生水稻植株，圖9c顯示穗期后的再生水稻植株。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供一種用于通過(guò)同源重組來(lái)修飾高等植物基因組的基因構(gòu)建體，其在T-DNA的BR(右邊界序列)和BL(左邊界序列)之間以下述的方向自BR包含如下元件(1)可表達(dá)狀態(tài)的，優(yōu)選是可高效表達(dá)狀態(tài)的第一負(fù)選擇標(biāo)記基因；(2)第一克隆位點(diǎn)，用于整合欲與宿主基因組中靶基因發(fā)生同源重組的基因的5`區(qū)；(3)可表達(dá)狀態(tài)的，優(yōu)選是可高效表達(dá)狀態(tài)的正選擇標(biāo)記基因；(4)第二克隆位點(diǎn)，用于整合欲與宿主基因組中靶基因發(fā)生同源重組的基因的3`區(qū)；及(5)可表達(dá)狀態(tài)的，優(yōu)選是可高效表達(dá)狀態(tài)的第二負(fù)選擇標(biāo)記基因，可與第一負(fù)選擇標(biāo)記基因相同。本發(fā)明也提供包含上述基因構(gòu)建體的植物轉(zhuǎn)化載體。
本發(fā)明的基因構(gòu)建體設(shè)計(jì)為，在T-DNA的BR和BL之間，位于可表達(dá)的正選擇標(biāo)記(優(yōu)選為可高度表達(dá)狀態(tài))5`上游和3`下游具有可表達(dá)的負(fù)選擇標(biāo)記(優(yōu)選為可高度表達(dá))，并且在正選擇標(biāo)記和負(fù)選擇標(biāo)記之間具有克隆位點(diǎn)(優(yōu)選為多克隆位點(diǎn))以用于整合欲進(jìn)行同源重組的序列。該構(gòu)建體還進(jìn)一步整合進(jìn)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化的載體中，所得到的載體在本發(fā)明中被稱為“基本載體”(圖2b)。
T-DNA是農(nóng)桿菌的內(nèi)源Ti質(zhì)粒的一部分。當(dāng)植物受到農(nóng)桿菌感染時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞本身并沒(méi)有進(jìn)入到植物細(xì)胞，但作為細(xì)菌細(xì)胞中的Ti質(zhì)粒的部分的T-DNA區(qū)被轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物細(xì)胞。T-DNA由BR(右邊界序列)和BL(左邊界序列)所界定。每一個(gè)邊界序列由約25bp的不完全重復(fù)序列所組成。
本發(fā)明的基因構(gòu)建體包含負(fù)和正選擇標(biāo)記。這是由于高等植物中非同源重組介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率很高，因此有必要從這些非同源重組體中有效的選擇出同源重組體。為了這個(gè)目的，這些標(biāo)記被用作負(fù)和正選擇。
正選擇是在基因轉(zhuǎn)移之后，在允許只有表達(dá)基因產(chǎn)物的細(xì)胞存活條件下選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的技術(shù)。例如，如果導(dǎo)入的是新霉素抗性基因，則可基于對(duì)新霉素的類似物，G418的抗性來(lái)選擇導(dǎo)入基因的細(xì)胞。
在基因轉(zhuǎn)移之后選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的負(fù)選擇技術(shù)中，只要表達(dá)了基因產(chǎn)物即導(dǎo)致細(xì)胞死亡。例如，如果導(dǎo)入的是人皰疹病毒的胸(腺嘧啶脫氧核)苷激酶基因，則可用9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥(niǎo)嘌呤(它是一種胸(腺嘧啶脫氧核)苷的類似物)進(jìn)行篩選，那些表達(dá)了胸(腺嘧啶脫氧核)苷激酶基因的細(xì)胞被殺死。
在本發(fā)明中，正—負(fù)選擇(即將正和負(fù)選擇結(jié)合起來(lái))用作篩選程序。該篩選程序涉及基于正選擇標(biāo)記的第一選擇轉(zhuǎn)化體，然后除去非同源重組體而選擇性挑選出同源重組體，這基于負(fù)選擇標(biāo)記可以導(dǎo)致通過(guò)非同源重組所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體的死亡來(lái)達(dá)到。該程序達(dá)到了提高選擇效率之目的。
負(fù)選擇標(biāo)記應(yīng)當(dāng)對(duì)植物細(xì)胞有毒性，但對(duì)用于載體操作的大腸桿菌和農(nóng)桿菌沒(méi)有毒性。這樣的標(biāo)記優(yōu)選的是白喉毒蛋白A鏈基因。除此之外，可用作負(fù)選擇標(biāo)記的包括codA基因、細(xì)胞色素P-450基因和芽孢桿菌RNA酶(barnase)基因。
下面是已知的關(guān)于負(fù)選擇標(biāo)記的報(bào)道。Koprek T等報(bào)道codA基因和細(xì)菌P-450基因在大麥中可以用作負(fù)選擇標(biāo)記(Negative selection systems fortransgenic barley(Hordeum vulgare L.)comparison of bacterial codA-andcytochrome P450 gene-mediated selection.Plant J 1999，19(6)719-726)。Terada等報(bào)道白喉毒蛋白基因(DxT-A)在水稻中用作負(fù)選擇標(biāo)記(Negative selectioneffects of the diphtheria toxin protein(DxT-A)gene in rice and its application togene targeting.22ndAnnual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan，1999，2P-0343)。
優(yōu)選的正選擇標(biāo)記實(shí)例包括潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、咪唑啉(imidazoline)抗性基因、草甘膦抗性基因、殺稻瘟菌素S抗性基因、bar基因和glyphosinate抗性基因。
本發(fā)明的特點(diǎn)是在同源重組率非常低的高等植物中，確保正和負(fù)選擇標(biāo)記的表達(dá)(優(yōu)選為高水平表達(dá))以有效的選擇出發(fā)生了同源重組的植物細(xì)胞。如在圖2b和2c中所示，為了增強(qiáng)負(fù)選擇標(biāo)記的表達(dá)，可以將啟動(dòng)子(花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子)連接內(nèi)含子以達(dá)到增強(qiáng)表達(dá)的目的，或者，可以使用在單子葉植物中能夠啟動(dòng)強(qiáng)表達(dá)的遍在蛋白啟動(dòng)子。同樣的，正選擇標(biāo)記的增強(qiáng)表達(dá)也是所希望的。為了該目的，當(dāng)潮霉素抗性基因被用作正選擇標(biāo)記時(shí)，期望使用激動(dòng)蛋白啟動(dòng)子，它能夠啟動(dòng)潮霉素抗性基因強(qiáng)表達(dá)。為了保證這些選擇標(biāo)記的高水平表達(dá)，也可以使用其它的一些元件，包括玉米遍在蛋白啟動(dòng)子、水稻PLD內(nèi)含子和蓖麻子過(guò)氧化氫酶內(nèi)含子。
本發(fā)明的另一個(gè)特點(diǎn)是，在BL和BR每側(cè)均使用了負(fù)選擇標(biāo)記基因。它們可以是不同的基因，但優(yōu)選的是相同的基因。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)對(duì)在高等植物中為什么通過(guò)同源重組進(jìn)行基因組修飾不能成功的原因進(jìn)行了分析，尤其是對(duì)單子葉植物，并且得出結(jié)論認(rèn)為有相當(dāng)數(shù)量的以不完全形成整合負(fù)選擇標(biāo)記的非同源重組體的存在而導(dǎo)致負(fù)選擇的效率低下。在本發(fā)明中，使用兩個(gè)相互分開(kāi)的負(fù)選擇標(biāo)記有效的減少了在篩選步驟中非同源重組體存活下來(lái)的可能性。
本發(fā)明的基因構(gòu)建體包含兩個(gè)克隆位點(diǎn)，一個(gè)是位于正選擇標(biāo)記基因和第一負(fù)選擇標(biāo)記基因之間，另一個(gè)位于正選擇標(biāo)記基因和第二負(fù)選擇標(biāo)記基因之間。只要克隆位點(diǎn)適合于欲與靶標(biāo)基因進(jìn)行同源重組的基因的5`區(qū)或3`區(qū)的整合，任何克隆位均可選用。多克隆位點(diǎn)作為優(yōu)選的克隆點(diǎn)是因?yàn)樗捎糜谡先魏位?。多克隆位點(diǎn)可以通過(guò)合適的設(shè)計(jì)和合成具有預(yù)期的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的寡聚DNA序列來(lái)制備得到。
欲用于同源重組的基因的5`區(qū)整合進(jìn)第一克隆位點(diǎn)，而基因的3`區(qū)整合進(jìn)第二克隆位點(diǎn)。
欲用于同源重組的基因可以是編碼特定蛋白的結(jié)構(gòu)基因或其它影響植物表型的基因。這些基因可以用作提供植物基因組功能性缺陷的靶基因或用作改變靶基因以獲得修飾的重組植物。對(duì)于靶基因的選擇并沒(méi)有任何限制，包括Waxy基因和EPSPS基因。
對(duì)于如何選擇欲用于同源重組的基因的“5`區(qū)”和“3`區(qū)”之間的邊界沒(méi)有特別的限制。例如，為了完全阻止靶基因的功能，欲用于同源重組的基因可能是被平分成兩段或按7∶3到3∶7的比例分開(kāi)。所得的上游和下游部分可分別用作“5`區(qū)”和“3`區(qū)”，但通常每一個(gè)區(qū)域優(yōu)選具有較長(zhǎng)的長(zhǎng)度。為了保證同源重組，每一個(gè)區(qū)域優(yōu)選的長(zhǎng)于至少1000個(gè)堿基，至少500個(gè)堿基。
相比較地，為了獲得對(duì)靶基因功能的修飾，欲用于同源重組的基因被分成“5`區(qū)”和“3`區(qū)”并且插入各自的克隆位點(diǎn)。如果欲用于同源重組的基因有合適的內(nèi)含子，可在內(nèi)含子內(nèi)將其分成5`區(qū)和3`區(qū)。此外，“5`區(qū)”應(yīng)當(dāng)理解為具有欲進(jìn)行同源重組的基因的表達(dá)需要的所有功能的序列，而它的下游側(cè)翼區(qū)可用作“3`區(qū)”?；蛘?，“3`區(qū)”可以具有欲進(jìn)行同源重組的基因表達(dá)需要的所有功能的序列，而它的上游側(cè)翼區(qū)即可用作“5`區(qū)”。
為了將正選擇標(biāo)記能夠從轉(zhuǎn)化植株的后代中切除而使用了位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，基因構(gòu)建體可進(jìn)一步設(shè)計(jì)為含有重組酶識(shí)別序列，稱元件(7)(例如，Cre/lox重組系統(tǒng)的lox序列、R/RS重組系統(tǒng)的RS序列、或者FLP-FRT重組系統(tǒng)的FRT序列)，該元件在正選擇標(biāo)記基因的上游區(qū)和下游區(qū)(圖2b和2c)。Cre/lox重組系統(tǒng)涉及利用Cre重組酶與lox的結(jié)合來(lái)切除不必要的部分。R/RS重組系統(tǒng)涉及利用R基因編碼的重組酶與RS序列的結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)夾在兩個(gè)RS序列之間的DNA區(qū)域進(jìn)行切除。同樣的，F(xiàn)LP-FRT重組酶系統(tǒng)涉及利用FLP重組酶與FRT序列的結(jié)合以誘導(dǎo)夾在兩個(gè)FRT序列之間的DNA區(qū)域的切除。
例如，利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的含有Cre/lox重組系統(tǒng)的基因構(gòu)建體，當(dāng)Cre重組酶在同源重組之后得到表達(dá)時(shí)，它可能切除包含正選擇標(biāo)記基因的序列，在基因組的同源重組區(qū)域中其夾在兩個(gè)lox序列之間。在Cre重組酶表達(dá)而切除夾在基因組中的兩個(gè)lox序列之間的區(qū)域后，通過(guò)同源重組導(dǎo)入到植物基因組中的基因的5`區(qū)和3`區(qū)可以連接成天然的原始形式。這種切除可以通過(guò)PCR或Southern印跡來(lái)確證。
為了使Cre重組酶在愈傷組織中得到表達(dá)以切除lox序列之間的區(qū)域，這種切除也可以通過(guò)與另一種導(dǎo)入有Cre重組酶基因的植物雜交或通過(guò)將Cre重組酶基因?qū)氲酵粗亟M植物中來(lái)實(shí)現(xiàn)。
Cre和lox的結(jié)合可以用于對(duì)lox位點(diǎn)之間序列的修飾和缺失。為了修飾的目的，同源重組體與導(dǎo)入有Cre重組酶基因的重組體植物進(jìn)行雜交以切除lox位點(diǎn)之間序列，然后與另一種既具有Cre重組酶基因也具有將要整合進(jìn)lox位點(diǎn)之間的基因的重組體進(jìn)行雜交，因此要整合進(jìn)lox位點(diǎn)之間的基因被插入到在切除后保留下來(lái)的lox序列位點(diǎn)。修飾的例子包括但不限于除草劑抗性基因的插入。或者，為了調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，也可將所述基因構(gòu)建體設(shè)計(jì)成具有轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，優(yōu)選的是En/Spm類型轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，作為元件(6)以確保抑制效果(圖2b和2c)。
利用常規(guī)的遺傳工程技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地將上述元件(1)至(5)，及如果存在以及(6)和/或(7)按事先確定的順序連接起來(lái)以獲得本發(fā)明的基因構(gòu)建體。而且，當(dāng)利用標(biāo)準(zhǔn)的遺傳重組技術(shù)時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言選擇與植物基因組中靶標(biāo)基因進(jìn)行同源重組的基因，以及將該基因的5`區(qū)和3`區(qū)分別插入到第一和第二克隆位點(diǎn)也是很容易做到的。
本發(fā)明的基因構(gòu)建體在合適的內(nèi)切酶位點(diǎn)連接到用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化的載體上，從而該基因構(gòu)建體替代T-DNA區(qū)域或載體的BR和BL之間的區(qū)域。所獲得的載體對(duì)應(yīng)于本文所用的基本載體。當(dāng)將欲用于同源重組的基因的5`區(qū)和3`區(qū)分別整合到基本載體的第一和第二克隆位點(diǎn)，本發(fā)明所述基因修飾載體可衍生于該基本載體。
例如，將水稻W(wǎng)axy基因和其側(cè)翼區(qū)域插入到基本載體中以構(gòu)建成水稻W(wǎng)axy基因修飾載體(圖2c)。
本發(fā)明也提供一種經(jīng)同源重組而具有修飾基因組的高等植物制備方法，包含如下步驟(a)將本發(fā)明的基因修飾載體導(dǎo)入到含有Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株中；(b)讓所述農(nóng)桿菌菌株感染植物細(xì)胞、組織或愈傷組織；(c)通過(guò)負(fù)和正選擇標(biāo)記以篩選出發(fā)生過(guò)同源重組的細(xì)胞、組織或愈傷組織；(d)當(dāng)選擇是針對(duì)細(xì)胞或組織時(shí)，培養(yǎng)所述細(xì)胞或組織以產(chǎn)生愈傷組織；(e)在再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述愈傷組織以產(chǎn)生植株個(gè)體，其對(duì)于基因組中同源重組而言是雜合的；和(f)所述植株通過(guò)雜交以產(chǎn)生同源重組純合的高等植物。
如上所述，由于高等植物中同源重組率很低，上述步驟(a)和(b)最好是通過(guò)轉(zhuǎn)化效率高的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法?；蛐揎椵d體可通過(guò)高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法而導(dǎo)入例如水稻愈傷組織中，繼而通過(guò)正-負(fù)選擇系統(tǒng)而篩選出潛在的發(fā)生了同源重組的愈傷組織。高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法可選用Terada等所提出的對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移到水稻的改進(jìn)方法。該轉(zhuǎn)化程序達(dá)到的基因轉(zhuǎn)移效率比傳統(tǒng)程序要高5倍至10倍(Develpomentof′Agrobacterium mediate rice transformation with a high level of transformationefficiency，96thLecture Meeting of Japanese Society of Breeding，1999，212)。該轉(zhuǎn)化基于雙元載體系統(tǒng)，并且利用了高度可表達(dá)狀態(tài)的潮霉素基因。
正-負(fù)選擇可按如下方式來(lái)操作。從步驟(d)培養(yǎng)所得到的愈傷組織培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到正選擇培養(yǎng)基中，所述正選擇培養(yǎng)基可以是添加正選擇所需要物質(zhì)的常規(guī)用愈傷組織的培養(yǎng)基。
在利用對(duì)抗生素抗性作為正選擇的情況下，培養(yǎng)基中進(jìn)一步增加相應(yīng)的抗性素，其濃度足以使選擇標(biāo)記基因沒(méi)有轉(zhuǎn)化的愈傷組織不能成活或至少不能生長(zhǎng)。在使用潮霉素作為抗生素的情況下，在每升培養(yǎng)基中加入10到200mg潮霉素。
愈傷組織在黑暗、15℃到40℃下生長(zhǎng)2到3周。每個(gè)存活下來(lái)的即被認(rèn)為是候選的已成功進(jìn)行同源重組的愈傷組織，它具有正選擇標(biāo)記基因且不含負(fù)選擇標(biāo)記基因。從愈傷組織的顏色和繁殖上的區(qū)別來(lái)確定培養(yǎng)基上的愈傷組織是否存活。
此外，可以用PCR分析來(lái)確證這些候選愈傷組織是否攜帶有預(yù)期的基因修飾。
從愈傷組織細(xì)胞中提取的DNA進(jìn)行PCR分析時(shí)，引物可如此設(shè)計(jì)，即一條是可結(jié)合插入基因區(qū)域的引物，而另一條是可結(jié)合插入片段邊界之外的任何基因的部分序列。在沒(méi)有發(fā)生基因插入事件或發(fā)生非同源重組的細(xì)胞中，PCR不能產(chǎn)生擴(kuò)增片段，這是因?yàn)檫@兩條引物的位置相互不接近。相反，在發(fā)生了同源重組的細(xì)胞中，進(jìn)行PCR可以產(chǎn)生預(yù)期大小的擴(kuò)增片段，這是由于兩條引物的結(jié)合區(qū)相互靠近。若檢測(cè)出該片段則表明在相應(yīng)的細(xì)胞群中包含了同源重組基因的可能性非常大。所述細(xì)胞群可分成亞群并再次用PCR進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)這種循環(huán)篩選重復(fù)至分離出發(fā)生同源重組的細(xì)胞為止。
不用上述的PCR分析或在上述PCR分析之后，更詳盡的分析可以采用Southern印跡來(lái)確證基因是否被修飾。
本發(fā)明的方法使得可以在單子葉植物如水稻中達(dá)到高效的同源重組。如下面所述的例子，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，6個(gè)實(shí)驗(yàn)中平均每一個(gè)實(shí)驗(yàn)中在進(jìn)行正-負(fù)選擇之后，可從400個(gè)種子的基礎(chǔ)上產(chǎn)生100多個(gè)愈傷組織，且在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)的這些愈傷組織中至少獲得了基因修飾的一個(gè)植株?；谶@些事實(shí)可知，本發(fā)明所述方法的可重復(fù)性和可靠性非常高。
被確證含有預(yù)期修飾基因的每一個(gè)愈傷組織可在再生培養(yǎng)基如MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)以獲得單株，該單株就基因組中的同源重組而言是雜合。在花粉和種子中，修飾基因的表達(dá)和結(jié)構(gòu)可以通過(guò)PCR和/或Southern印跡來(lái)確證在靶基因座發(fā)生的同源重組是否是雜合性。
由于所獲得的個(gè)體可以再生和授粉，因而它們可通過(guò)自花授粉而產(chǎn)生對(duì)于同源重組是純合的基因修飾的高等植物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)基于前述分析，根據(jù)本發(fā)明，甚至在同源重組率非常低而非同源重組介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移頻率非常高的高等植物中，當(dāng)被連接于同源區(qū)域兩側(cè)的負(fù)選擇標(biāo)記與正選擇標(biāo)記一起被用于正-負(fù)選擇時(shí)，以該植物內(nèi)源基因組序列作為靶標(biāo)可在每100個(gè)所得愈傷組織中重復(fù)獲得一個(gè)同源重組體而沒(méi)有改變它們的原始基因座。
此外，本發(fā)明使得可以產(chǎn)生其特定基因被修飾而不會(huì)受到任何限制的轉(zhuǎn)化植物。例如，本發(fā)明的方法用于修飾水稻中參與淀粉合成的Waxy基因時(shí)，可能獲得調(diào)節(jié)Waxy基因表達(dá)的水稻植株。這種基因修飾水稻植株也可進(jìn)一步通過(guò)位點(diǎn)特異性重組介導(dǎo)進(jìn)行基因組修飾，因?yàn)槲稽c(diǎn)特異性重組所要求的序列被整合到相同基因座。本發(fā)明有利于基因功能分析以及在基因組動(dòng)力學(xué)中的變化相關(guān)聯(lián)的基因表達(dá)機(jī)制的分析。
此外，還可以將同源重組體再生成完整的植株，所得的這些植株能夠是可育的，進(jìn)而因此可產(chǎn)生對(duì)于同源重組基因是純合的單株。
實(shí)施例實(shí)施例1對(duì)照載體和Waxy靶載體利用衍生自pVS1的載體pGSGluc(Saalbach I et al.(1994)A chimericgene encoding the methionine-rich 2S albumin of the Brazil nut(Betholletiaexcelsa H.B.K.)is stably expressed and inherited in transgenic grain legumes.Mol Gen Genet 242226-236)中的rep和sta區(qū)域以及壯觀霉素抗性基因構(gòu)建載體pRIT(圖2a)、pINA134(圖2b)和pRW(圖2c)。
實(shí)施例1-1pRIT的構(gòu)建用SalI消化pGSGluc獲得約9.4kbp的片段，然后自連接構(gòu)建pGS-SalI。再用HindIII消化pGS-SalI并與HindIII消化的pIG221相連(TanakaA etal.(1990)Enhancement of foreign gene expression by a dicot intron in rice butnot in tobacco is correlated with an increased level of mRNA and an efficientsplicing of the intron.Nucleic Acids Res.186767-6770)，進(jìn)而用EcoRI和BglII進(jìn)行消化而產(chǎn)生了12.4kbp片段。利用具有EcoRI、NotI和BglII位點(diǎn)的合成接頭使該片段自連接而獲得pGSIG。從pAch1(Bilang R et al.(1991)The3`-terminal region of the hygromycin-B-resistance gene is important for itsactivity in Escherichia coli and Nicotiana tabacum.Gene 100247-250)中切出含有水稻激動(dòng)蛋白1(Actin 1)的啟動(dòng)子及其第一內(nèi)含子、hph基因和CaMV35S終止子的2.6kbp片段，然后插入到pGSIG的EcoRI位點(diǎn)而得到構(gòu)建體pRIT，在該載體的左右邊界序列之間，具有其中在水稻激動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子及第一內(nèi)含子的控制之下hph基因(Actp-int-hph基因)，和在CaMV35S的控制之下gusA基因。
實(shí)例1-2pINA134的構(gòu)建白喉毒素A鏈基因(DT-A基因)是利用pMC1DpA作為模板進(jìn)行PCR獲得的片段(Yagi T et al.(1990)Homologous recombination at c-fyn locus ofmouse embryonic stem cells with use of diphtheria toxin A-fragment gene innegative selection.Proc Natl Acad Sci USA 879918-9922)，用于取代pCKR138中hph基因編碼區(qū)(Izawa T et al.(1991)Introduction andtransposition of the maize transposable element Ac in rice(Oriza sativa L.).MolGen Genet 227391-396)而連接成CaMV35S啟動(dòng)子、DT-A和CaMV 35S終止子，而構(gòu)建成質(zhì)粒p35Sp-DT-A。蓖麻子過(guò)氧化氫酶基因(Ohta S et al.(1990)Construction and expression in tobacco of a β-glucuronidase(GUS)reporter gene containing an intron within the coding sequence.Plant Cell Physiol31805-813)被插入到CaMV35S啟動(dòng)子和DT-A基因之間而構(gòu)建成p35Sp-int-DT-A。欲插入的片段可通過(guò)PCR來(lái)獲得。p35Sp-DT-A的CaMV35S啟動(dòng)子用包含玉米遍在蛋白1的啟動(dòng)子及其第一內(nèi)含子的2.0kb片段進(jìn)行取代而構(gòu)建成了質(zhì)粒pUbip-int-DT-A，其是用PstI消化pAHC27(Takimoto T et al.(1994)Non-systemic expression of a strss-responsive maize polyubiquitin gene(Ubi-1)in transgenic rice plants.Plant Mol Biol 261007-1012)而得到的。衍自Tn930(Grindley NDF和Joyce CM(1981)Analysis of the structure and functionof the kanamycin-resistance transposon Tn930.Cold Spring Harb.Symb.Quant.Biol.45125-133)的卡那霉素抗性基因以與DT-A相同方向插入到pUbip-int-DT-A的CaMV35S終止子的3`末端，繼而以相反的方向?qū)⒏采wp35Sp-int-DT-A上啟動(dòng)子到終止子的片段插入到卡那霉素抗性基因的3`末端，這樣就構(gòu)建成了pUbip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A。該載體用HindIII進(jìn)行消化和末端鈍化后進(jìn)行自連接以去除卡那霉素中的HindIII位點(diǎn)，因而構(gòu)建成 pUbip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A(ΔHindIII)。然后用HindIII切割pUbip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A(ΔHindIII)得到夾在遍在蛋白1啟動(dòng)子和CaMV35S啟動(dòng)子之間的區(qū)域，再將其插入到pGS-SalI的HindIII位點(diǎn)構(gòu)建成pGS-SalI-Ubip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A。所得到的構(gòu)建體用HindIII部分消化后插入接頭(5`-AGC TGG GAT CCC-3`)以去除兩個(gè)HindIII位點(diǎn)，因而得到構(gòu)建體pGS-SalI-Ubip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A(ΔHindIII)。
玉米En/Spm轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(Gierl A et al.(1985)Molecularinteractions between the components of the En-I transposable element system ofzea mays.EMBO J.4579-583)是通過(guò)PCR合成，長(zhǎng)為1.0kb片段，將其插入到pAch1的CaMV35S終止子的3`末端以構(gòu)建成pAch1-En/Spm。每個(gè)攜帶衍生自噬菌體P1中的Cre/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)中l(wèi)oxP序列片段(Kanegae Y et al.(1995)Efficient gene activation in mammalian cells by usingrecombinant adenovirus expressing site-specific Cre recombinase.Nucl AcidsRes 233816-3821)和在構(gòu)建靶向載體時(shí)同源序列的插入所需克隆位點(diǎn)也是用PCR來(lái)合成的。這些合成的片段被插入到pAch1-En/Spm中的Actp-int-hph-En/Spm2基因的5`和3`末端以構(gòu)建成pAch1-En/Spm2。得到的構(gòu)建體用以取代pGS-SalI-Ubip-int-DT-A/35Sp-int-DT-A(ΔHindIII)中的卡那霉素抗性基因的區(qū)域而構(gòu)建成pINA134。
實(shí)施例1-3pRW的構(gòu)建包含iaponica水稻品種“Shimokita”的Waxy基因和它的側(cè)翼區(qū)(67kb)的BAC克隆(123-D4)用HindIII進(jìn)行消化，獲得包含Waxy基因的14.7kb片段并插入到pBC(Stratagene Co.)的HindIII位點(diǎn)。在用XbaI消化后，得到的6.3kb和6.8kb片段分別插入pBluescript SK-(Stratagene Co.)的XbaI位點(diǎn)構(gòu)建成pBluescript-Waxy 6.3kb和pBluescript-Waxy 6.8kb。將AscI接頭插入到pBluescript-Waxy 6.8kb的3`-末端多克隆位點(diǎn)中的NotI位點(diǎn)，繼而用SmaI和AscI進(jìn)行消化以得到6.8kb的片段。該片段插入pINA134的PmeI和AscI位點(diǎn)之間構(gòu)建成pINA-Waxy 6.8kb。攜帶了包含Waxy基因啟動(dòng)子區(qū)的6.3kb片段的pBluescript，用HindIII消化，得到6.3kb片段并插入到pINA-Waxy6.8kb的HindIII位點(diǎn)構(gòu)建成Waxy靶向載體pRW.
將這些載體分別導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌菌株EHA101(Hood EE et al.Thehvper-virulence of Agrobacterium tumefaciens strain A281 on legumes.PlantPhysiol.83529-534)中，其可采用電激法(Sambook J et al.(1989)MolecularCloningA Laboratory，manual，2ndEdn.Cold Spring Harbor，NYCold Springharbor Laboratory Press)。
實(shí)施例2轉(zhuǎn)化采用的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基本上根據(jù)Hiei等的方法(Hiei Y et al.(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium andsequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal6271-282)，但使用Agarose Type I(Sigma Co.)而不是Gelrite來(lái)進(jìn)行水稻的細(xì)胞培養(yǎng)。水稻品種Nipponbare的成熟種子用于誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織。去除外殼后，種子在70％的乙醇中浸泡1分鐘后用2.5％次氯酸鈉滅菌20分鐘。滅菌的種子用滅菌水沖冼后，轉(zhuǎn)移到用Agarose Type I的2N6培養(yǎng)基中，并于黑暗條件下28？生長(zhǎng)3到4周。進(jìn)而將它們轉(zhuǎn)移到另一的2N6培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)3到7天。
攜帶有pRIT、pINT134或pRW的農(nóng)桿菌菌株EHA101，在附加125mg/l壯觀霉素的AB培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)3天(Chilton MD et al.(1974)Agrobacterium tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA notdetected in crown gall tumors.Proc Natl Acad Sci USA 713672-3676)。之后，收集培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)而懸浮于有400μm的乙酰丁香酮(acetosyringone)的AAM溶液中(Hiei Y et al.Efficient transformation ofrice(Oryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.ThePlant Journal 6271-282)，并于28℃以100rpm振蕩1至2小時(shí)。每個(gè)愈傷組織在濃度調(diào)節(jié)到OD600＝0.18的細(xì)菌懸浮液中浸泡3至4分鐘。用滅菌的紙巾將多余的細(xì)菌細(xì)胞去掉，再將每一個(gè)愈傷組織轉(zhuǎn)移到附加400μm乙酰丁香酮的含0.8％Agarose Type I的2N6-AS培養(yǎng)上，于28℃黑暗條件下生長(zhǎng)3天。每一個(gè)愈傷組織用含有500mg/l頭孢噻肟(cefotaxime)的滅菌水沖冼。用滅菌的紙巾去掉多余的滅菌水，將每一個(gè)愈傷組織轉(zhuǎn)移到附加50mg/l潮霉素和500mg/l頭孢噻肟(cefotaxime)的含0.8％Agarose Type I的2N6-CH上，于28？黑暗條件下生長(zhǎng)3-4周。對(duì)能夠連續(xù)生長(zhǎng)的愈傷組織進(jìn)行計(jì)數(shù)后，單個(gè)愈傷組織被轉(zhuǎn)移到含有2N6-CH溶液的多孔板上，以用于后面分析。
為了檢測(cè)用pRW進(jìn)行轉(zhuǎn)化的正-負(fù)選擇的轉(zhuǎn)化效率和“逃生(escape)”愈傷組織(對(duì)潮霉素有抗性但沒(méi)有發(fā)生同源重組)的數(shù)目，用pRIT或pINA134作轉(zhuǎn)化所獲得的愈傷組織與用pRW作轉(zhuǎn)化進(jìn)行了比較。這種比較是基于未感染愈傷組織的鮮重和所獲得愈傷組織的數(shù)目。在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，從400個(gè)成熟種子獲得了健康愈傷組織大約為40gFW(gram fresh weight)。1到5克鮮重的愈傷組織用pRIT和pINA134進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其余的用pRW進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在2N6-CH上進(jìn)行篩選后，計(jì)數(shù)潮霉素抗性愈傷組織。
愈傷組織的再分化是用MSRE培養(yǎng)基誘導(dǎo)的，MSRE培養(yǎng)基包含MS鹽(Murashige T and Skoog.F.(1962)A revised medium for rapid growth andbioassays with tobacco tissue cultures.Plant Physiol.15，473)、30g/l蔗糖、30g/l山梨醇、1mg/l NAA、2mg/l BAP、50mg/l潮霉素、500mg/l頭孢噻肟和0.8％Agarose Type I。分化的植株生長(zhǎng)于包含30g/l蔗糖、50mg/l潮霉素、500mg/l頭孢噻肟和0.8％Agarose Type I的MS培養(yǎng)基上，然后轉(zhuǎn)入溫室中生長(zhǎng)。
實(shí)施例3靶愈傷組織的檢測(cè)將每個(gè)愈傷組織(30mgFW)置于2ml的塑料管，并于0.5mlCTAB溶液(Plant DNA isolation kit.Kurabo Co.)和5陶瓷球(ceramic ballsdiameter3mm；Nikkato Co.)的存在下用FastPrep組織壓碎器(FP120；Bio 101 Co.)以6.5的速度壓碎20秒。將壓碎后產(chǎn)物于65℃下溫育0.5到2小時(shí)，用自動(dòng)DNA抽提器(automated DNA extractorNA2000.Kurabo Co.)進(jìn)行處理。如果使用葉片，10mgFW葉片置于管中用液氮速凍并強(qiáng)烈的壓碎，繼而用FastPrep組織壓碎器以6.5的速度進(jìn)一步碾壓10秒。接著，用處理愈傷組織相同的操作來(lái)提取其DNA。得到的DNA溶于10mM Tris-EDTA緩沖液(pH8.0)中并在260nm下測(cè)定其光吸收值。用LATaq(Takara Co.)進(jìn)行PCR分析。反應(yīng)條件是94℃處理1分鐘1個(gè)循環(huán)，以94℃1分鐘和60℃20分鐘處理進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，然后于72℃處理10分鐘1個(gè)循環(huán)。同源重組可用引物H1F5`-GTATAA TGT ATG CTA TAC GAA GTT ATG TTT-3`和W2R 5`-GTT TGG TCATAT TAT GTA CTT AAG CTA AGT-3`進(jìn)行驗(yàn)證。Waxy基因的原始啟動(dòng)子可用Pro15`-ACA CAA ATA ACT GCA GTC TC-3`和Ex2GAG CTG GGACGT GGT GAG AGC CGA CAT G-3`進(jìn)行驗(yàn)證。擴(kuò)增DNA片段在0.6％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳后通過(guò)溴乙錠染色來(lái)觀察。
實(shí)施例4胚乳和花粉的碘染色可用剃刀切出胚乳。在裂開(kāi)之前立即收集花藥并在染色前用固定液(醋酸∶乙醇＝1∶3 v/v)進(jìn)行處理。胚乳和花粉用碘液(0.18％(w/v)碘，1％(w/v)碘化鉀)進(jìn)行染色。
實(shí)施例5a.Southern印跡分析用CTAB法從Nipponbare和轉(zhuǎn)化體的綠葉中提取DNA，然后進(jìn)行純化(Murray MG，Thompson WF.(1980)Rapid isolation of high molecular weightplant DNA.Nucleic Acids Res 84321-4325)。分離BAC克隆123-D4的質(zhì)粒DNA采用核酸抽提試劑盒(Qiaprep Spin Maxiprep Kit.Qiagen Co.)。分離出的DNA用HindIII、KpnI、MunI或EcoRV進(jìn)行消化，用0.7％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，再將其轉(zhuǎn)移到Hybond N膜上(Amersham Co.)。用EcoRI消化質(zhì)粒Adh1-antiWx獲得的2.7kb片段用作cWx2.7探針。cWx2.7探針包含Waxy編碼區(qū)(2.3kb)和Waxy第一內(nèi)含子(約400bp)。用XhoI消化質(zhì)粒pBluescrip-Waxy 6.3kb所得到的4.1kbp用作pWx4.1探針。用地高辛(digoxigenin)標(biāo)記這些探針(Boehringer Mannheim Biochemica)。以F1Hm5`-GTA GGT AGA CCG GGG GCA ATG AG-3`和R2Hm5`-ACG CCC GACAGT CCC GGC TCC GG-3`作引物利用PCR DIG探針合成試劑盒(Roch Co.)制備針對(duì)hph基因的標(biāo)記探針。PCR反應(yīng)的條件是94℃，2分鐘，1個(gè)循環(huán)，以94℃30秒、60℃45秒和68℃45秒處理進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，然后于72℃處理3分鐘1個(gè)循環(huán)。轉(zhuǎn)移到每一張膜上的DNA片段在42℃下與標(biāo)記片段進(jìn)行雜交，所用溶液包含50％甲酰胺，5×SSC，2％封閉溶液(BoehringerMannheim Biochemica)，0.2％SDS和0.1％月桂肌磷酸(Lauryl Sarcosine)。雜交探針通過(guò)CDP-Star(Boehringer Mannheim)和抗-地高辛堿性磷酸酶(Boehringer Mannheim)進(jìn)行檢測(cè)。
b.重組區(qū)的核苷酸序列測(cè)定從每個(gè)轉(zhuǎn)化體的綠葉中提取DNA用作模板使用DNA聚合酶實(shí)施PCR，所用的DNA聚合酶是AmpliTaq Gold(Perkin Elmer)。反應(yīng)條件是94℃處理10分鐘1個(gè)循環(huán)后，以94℃0.5分鐘、55℃0.5分鐘和72℃1分鐘處理進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，然后于72℃處理10分鐘1個(gè)循環(huán)。
用于反應(yīng)的引物有如下12對(duì)WxR-F15`-AAG CTT CTA TTG ATGCAT AC-3`和WxR-R13915`-GAC AGG ACA AGAG CTG AGG GGAAC-3`；WxR-F12765`-TAT AAT GGC CCA GAG TAG TA-3`和WxR-R17885`-TTG CCC AGT TGC CCA AAG AA-3`；WxR-F17135`-CTC TCC CCTCCT CTC CCT TTC T-3`和WxR-R23965`-TCC TTG CAT TAT GTG ATGGA-3`；WxR-F23635`-CCA ATC CAA TCC AAT CCA TCA C-3`和WxR-R29255`-CCC TCT TCT CTC CCT TTT GAC C-3`；WxR-F28875`-TGG TGT TGT CCT TCT GTG GTC A-3`和WxR-R38315`-CGT CGT CGTCGG GGT TCA GGT A-3`；WxR-F35095`-GTC AGC CTC CCT CTC CCTTCT C-3`和WxR-R47015`-TAC AGC CGT GGG AGA GGA GAT A-3`；WxR-F44515`-AAG TCA AAT TAG CCA CGT AG-3`和WxR-R56255`-CGGCTT GGC GTA CGT TGC AT-3`；WxR-F54475`-CAC GCA CAC CCC AAACAG AC-3`和WxR-R78995`-CTT GGG TTA AAA TCT TGC GA-3`；WxR-F76755`-AAC TGT TCT TGA TCA TCG CA-3`和WxR-R98675`-ATTGTA TAC CGT TCC GTA TC-3`；WxR-F97095`-AGG AGA AGT ATC CGGGCA AG-3`和WxR-R124655`-TCT TGA CTT GTC CCG GAC CAT-3`；WxR-F146545`-CTT ATA TTG TGG GAC GGA GA-3`和WxR-R150225`-AGA AGC CTA ATA TAC CAC GA-3`；WxR-F-2845`-ATG CAA TGAGAA GAT CTG TA-3`和WxR-R2095`-TCT TAT AAG CCG GAG TCTTG-3`。用上述各自的引物對(duì)獲得12個(gè)片段，可用BigDyetm Terminator CycleSequencing Ready Reaction Kit V3.0(Applied Biosystem)、ABI PRISM377DNA測(cè)序儀和ABI PRISM3100 genetic Analyzer(均可從Applied Biosystem購(gòu)買(mǎi)得到)來(lái)進(jìn)行測(cè)序。
實(shí)施例6為了獲得有效的正-負(fù)選擇，潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)被選作正選擇標(biāo)記，白喉毒素A鏈基因(DT-A；Pappenheimer AM Jr(1977)Diphtheria toxin.Annu Rev Biochem 4669-94)用作負(fù)選擇標(biāo)記。DT-A對(duì)真核生物體包括植物具有毒性，因?yàn)樗ㄟ^(guò)催化延伸因子的ADP-核糖基化而抑制蛋白合成(YagiT et al.(1990)Homologous recombination at c-fyn locus of mouse embryonicstem cells with use of diphtheria toxin A-fragment gene in negative selection.Proc Natl Acad Sci USA 879918-9922；Czako M and An G(1991)Expressionof DNA coding for diphtheria toxin chain A is toxic to plant cells.Plant Physiol95687-692；Bellen HJ et al.(1991)Isolation of temperature-sensitive diphtheriatoxin in yeast and their effects on Drosophila cell.Development 114787-796)。為了檢測(cè)轉(zhuǎn)化率，用pRIT和pINA134分別作為正對(duì)照和負(fù)對(duì)照載體。如pRW一樣，pRIT和pINA134也攜帶hph作為正選擇標(biāo)記，并且利用水稻激動(dòng)蛋白1啟動(dòng)子和其第一內(nèi)含子來(lái)使轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最大。
從400個(gè)成熟的種子中，pRIT轉(zhuǎn)化證實(shí)得到有1500個(gè)單獨(dú)的愈傷組織。pINA134以同樣方式進(jìn)行轉(zhuǎn)化以研究負(fù)選擇的效果，結(jié)果顯示用pINA134進(jìn)行轉(zhuǎn)化導(dǎo)致超過(guò)99％的致死率。PCR分析表明每一個(gè)不能成活的愈傷組織中均含有DT-A基因。大多數(shù)用pINA134轉(zhuǎn)化的成活愈傷組織中的DT-A有部分或全部缺失。這些結(jié)果表明，DT-A基因連接于高活性啟動(dòng)子之下，在水稻中作為負(fù)選擇是有效的。也表明兩個(gè)DT-A基因位于分開(kāi)的位置則使產(chǎn)生兩個(gè)DT-A基因均缺失的重組體的概率非常低。
Waxy靶向載體pRW用于轉(zhuǎn)化。為了確證其轉(zhuǎn)化效率和正-負(fù)選擇的效果，pRIT和pINA134也用于轉(zhuǎn)化并分別測(cè)定所得到的潮霉素抗性愈傷組織的數(shù)目。如表1所示，對(duì)pRIT而言獲得了1500個(gè)，對(duì)pINA134而言獲得60個(gè)，對(duì)pRW而言獲得100個(gè)愈傷組織，這是對(duì)超過(guò)6次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的平均值。
利用H1F和W2R引物對(duì)進(jìn)行PCR以驗(yàn)證在Waxy基因座的同源重組。H1F引物編碼位于En/Spm序列的3`末端的loxP序列，而W2R引物編碼同源重組區(qū)外的任何序列。當(dāng)用于針對(duì)發(fā)生了同源重組的愈傷組織時(shí)，這些引物可以擴(kuò)增出大約8kb的片段。在6次實(shí)驗(yàn)中獲得的總數(shù)630個(gè)存活愈傷組織中，用這些引物分析發(fā)現(xiàn)6個(gè)單獨(dú)的陽(yáng)性愈傷組織系(A-I、A-II、B、C、E、F)。如表1中所示在每一個(gè)實(shí)驗(yàn)中獲得的愈傷組織中，顯示PCR陽(yáng)性平均是百分之一。在個(gè)別情況下，可以觀察到不同大小的片段被擴(kuò)增。這可歸因于非正常整合或整合了缺失的DT-A基因。
自PCR-陽(yáng)性系(A-I、A-II、B、C、E、F)的再生整個(gè)植株中，從其綠葉中提取DNA，然后用HindIII、MunI或EcoRV進(jìn)行消化以用于Southern雜交分析。Waxy片段在重組前為14.7kb長(zhǎng)，而在PCR-陽(yáng)性的重組體中變成了6.3kb和12.1kb片段。這是因?yàn)镠indIII位點(diǎn)通過(guò)同源重組插入到了第一內(nèi)含子中的原因。其6.3kb片段與Waxy啟動(dòng)子區(qū)域(pW4.1)雜交，而12.1kb的片段與hph基因(Hm0.9)和Waxy基因(cWx2.7)的編碼區(qū)雜交。類似的結(jié)果可以用MunI和EcoRV進(jìn)行分析得到。同樣，在所有重組體中，從所檢測(cè)到的信號(hào)強(qiáng)度估計(jì)同源重組只發(fā)生在所有重組體的一個(gè)等位基因上。
所有的同源重組體(A-I、A-II、B、C、E、F系)均能再生出完整的植株，并且可育而產(chǎn)生種子。在它們中間，對(duì)于A-I系，用碘染色和PCR分析其Waxy基因的分離。在含有Waxy基因的Nipponbare的花粉和種子中的淀粉是由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，因此在碘染色中被染成深藍(lán)色。相反，在含有Waxy基因的粘性水稻中的淀粉只由支鏈淀粉組成，因此被染成紅褐色。在A-I系中，花粉粒被染成深藍(lán)和紅褐色的比率是1∶1。此外，從A-I系獲得的53粒種子中有13個(gè)被染成紅褐色。對(duì)A-II、B、C、E和F系的種子進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，表明染色后的比率幾乎與A-I系的相同。這些結(jié)果表明從A-I、A-II、B、C、E和F系再生出的完整植株中，同源重組只發(fā)生在一個(gè)等位基因上。進(jìn)而，為了區(qū)分得到的種子的基因型，種子發(fā)芽后，從其綠葉中分離DNA進(jìn)行PCR分析。引物H1F和W2R被用于驗(yàn)證同源重組，而引物Prol和Ex2用于檢測(cè)原始Waxy基因座。引物Pro1和Ex2可擴(kuò)增出第一內(nèi)含子附近的1.3kb片段。從PCR分析結(jié)果可知，PCR分析所體現(xiàn)的基因型與用碘染色所體現(xiàn)的表型之間完全相符，其中被染成深藍(lán)的27個(gè)種子具有雜合基因型。也就是說(shuō)，F(xiàn)1代中基因型比率分離比為1∶2∶1，因此同源重組只發(fā)生在一個(gè)等位基因上。而且，也表明同源重組基因可以準(zhǔn)確的遺傳到下一代。
由于存在基因組基因的非期望重組而使Waxy基因失去功能的可能性，用Southern分析來(lái)驗(yàn)證hph-En/Spm基因是否正確的插入到了Waxy第一內(nèi)含子。為了用于分析，對(duì)于A-I系的后代的基因組DNA用HindIII、KpnI、MunI和EcoRV進(jìn)行消化，對(duì)于A-II、B、C、E和F系的后代用HindIII、MunI和EcoRV。在每一處理中用一株以上的完整植株進(jìn)行分析。選擇這些內(nèi)切酶的原因是它們?cè)贜ipponbare和Shimokita之間的Waxy位點(diǎn)間沒(méi)有多態(tài)性，而且也都存在于hph-En/Spm基因中。以pW4.1、Hm0.9和cWx2.7作為探針。結(jié)果，在F1代中均觀察到了所有預(yù)期大小的片段，這表明同源重組發(fā)生如預(yù)期一樣，并能正確的遺傳給后代。
在A-I、B和C系的后代植株中，對(duì)那些重組區(qū)域純合的進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定。分析純合體個(gè)體的基因組DNA以確定預(yù)期發(fā)生同源重組的Waxy區(qū)域的核苷酸序列，確證沒(méi)有突變或錯(cuò)誤，如非期望的缺失和插入。
因此，從6個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中獲得的6個(gè)轉(zhuǎn)化體的Southern分析，F(xiàn)1代的PCR分析、F1代的表型和基因型、Southern分析的F1代分離模式以及A-I、B和C系中重組區(qū)域的測(cè)序結(jié)果表明獲得的水稻植株顯示出正確的同源重組。而且，也表明這種基因修飾方法是可以重復(fù)的。
表1.靶向效率實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化體a負(fù)選擇存活正-負(fù)選擇存活 PCR-陽(yáng)性愈 靶效率的愈傷組織b的愈傷組織c傷組織 (×10-4)A2097 2292 29.5B1550 8015316.5
C1976176 11415.1D11591061 0_dE589 0 100117.0F17826111015.6平均1526 5810517.3a用pRIT轉(zhuǎn)化的1-5gFW愈傷組織獲得的潮霉素抗性愈傷組織數(shù)，被計(jì)算為用pRW轉(zhuǎn)化所用每重量愈傷組織(約40gFW)為基礎(chǔ)計(jì)數(shù)。
b用pINA134轉(zhuǎn)化的1-5gFW愈傷組織中獲得的潮霉素抗性愈傷組織數(shù)目，被計(jì)算為pRW轉(zhuǎn)化用每重量愈傷組織(約40gFW)。
cpRW轉(zhuǎn)化40gFW愈傷組織獲得的潮霉素抗性愈傷組織數(shù)目。
d＜8.6×10-4參考文獻(xiàn)除上述所提及的文獻(xiàn)外，下面這些文獻(xiàn)用作參考(1)Echt CS，Schwartz D(1981)Evidence for the inclusion of controllingelements within the structural gene at the waxy locus in maize.Genetics99275-284；(2)Hajdukiewicz P，Svab Z，Maliga P(1994)The small，versatile pPZPfamily of Agrobacterium binary vectors for plant transformation.Plant Mol Biol25989-994；(3)McElroy D，Blowers AD，Jenes B，Wu R(1991)Construction ofexpression vectors based on the rice action(Actl)5’region for use in monocottransformation.Mol Gen Genet 231150-160；(4)Nelson，OE(1962)The Wazy locus in maize.I.Intralocusrecombination frequency estimates by pollen and by conventional analyses.Genetics 47737-742；(5)Wessler，SR，Varagona，MJ(1985)Molecular basis of mutations in theWaxy locus of maizecorrelation with the fine Structure genetic map.Proc.Nail.Acad.Sci.usa 824177-4181；(6)美國(guó)專利號(hào)6187994，申請(qǐng)?zhí)?765613；
(7)Internationl Patent Public Disclosure WO 9925821，國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朩O98US24610；和美國(guó)專利號(hào)5464764，申請(qǐng)?zhí)?14083。
序列表<110>日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社(Japan Tabacco Inc.)<120>修飾高等植物基因組的方法<130>011248<160>7<210>1<211>12<212>DNA<213>
<400>1agctgggatc cc 12<210>2<211>30<212>DNA<213>
<400>2gtataatgta tgctatacga agttatgttt 30<210>3<211>30<212>DNA<213>
<400>3gtttggtcat attatgtact taagctaagt 30<210>4<211>20<212>DNA<213>
<400>4acacaaataa ctgcagcttc 20<210>5<211>28
<212>DNA<213>
<400>5gagctgggac gtggtgagag ccgacatg 28<210>6<211>23<212>DNA<213>
<400>6gtaggtagac cgggggcaat gag23<210>7<211>23<212>DNA<213>
<400>7acgcccgaca gtcccggctc cgg2權(quán)利要求
1.一種用于通過(guò)同源重組來(lái)修飾高等植物基因組的基因構(gòu)建體，其在T-DNA的BR(右邊界序列)和BL(左邊界序列)之間以下述的順序自BR包含如下元件(1)可表達(dá)狀態(tài)的第一負(fù)選擇標(biāo)記基因；(2)第一克隆位點(diǎn)，用于整合欲與宿主基因組中靶基因發(fā)生同源重組的基因的5`區(qū)；(3)可表達(dá)狀態(tài)的正選擇標(biāo)記基因；(4)第二克隆位點(diǎn)，用于整合欲與宿主基因組中靶基因發(fā)生同源重組的基因的3`區(qū)；和(5)可表達(dá)狀態(tài)的第二負(fù)選擇標(biāo)記基因，它可以與第一負(fù)選擇標(biāo)記相同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的基因構(gòu)建體，進(jìn)一步還包括(6)轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，優(yōu)選的是En/Spm類型轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，其位于第一克隆位點(diǎn)下游。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的基因構(gòu)建體，進(jìn)一步在正選擇標(biāo)記基因的上游和下游包括(7)重組酶識(shí)別序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其中用于整合欲與宿主基因組中靶基因進(jìn)行同源重組的基因的5`和3`區(qū)克隆位點(diǎn)的一個(gè)或兩個(gè)是多克隆位點(diǎn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其中可表達(dá)狀態(tài)的第一負(fù)選擇標(biāo)記基因位于玉米遍在蛋白1啟動(dòng)子(pUbi)和花椰菜花葉病毒35S終止子(t35S)之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其中正選擇標(biāo)記基因通過(guò)被置于水稻激動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(pAct)及水稻激動(dòng)蛋白的第一內(nèi)含子(iAct)與CaMV35S終止子(t35S)之間而處于可表達(dá)狀態(tài)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其中第二負(fù)選擇標(biāo)記基因通過(guò)被置于花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(p35S)及蓖麻子過(guò)氧化氫酶的第一內(nèi)含子與花椰菜花葉病毒35S終止子(t35S)之間而處于可表達(dá)狀態(tài)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其中第一和第二負(fù)選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄方向相反。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其中正選擇標(biāo)記基因選自潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因或除草劑抗性基因(例如，bar基因)，而負(fù)選擇標(biāo)記基因選自白喉毒素蛋白A鏈基因(DT-A)、codA基因、細(xì)胞色素P-450基因或芽孢桿菌RNA酶基因。
10.一種植物轉(zhuǎn)化載體，其包含權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的基因構(gòu)建體。
11.一種植物轉(zhuǎn)化載體，其包含如權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)的基因構(gòu)建體，其中欲與宿主基因組中靶基因發(fā)生同源重組的基因的5`區(qū)被整合到第一克隆位點(diǎn)，欲與宿主基因組中靶基因發(fā)生同源重組的基因的3`區(qū)被整合到第二克隆位點(diǎn)。
12.一種通過(guò)同源重組具有修飾基因組的高等植物(優(yōu)選為單子葉植物)的制備方法，包括如下步驟(a)將權(quán)利要求11的植物轉(zhuǎn)化載體導(dǎo)入到含有Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株；(b)讓所述農(nóng)桿菌菌株感染植物細(xì)胞、組織或愈傷組織；(c)進(jìn)行負(fù)選擇和正選擇以篩選出發(fā)生過(guò)同源重組的細(xì)胞、組織或愈傷組織；(d)在選擇是針對(duì)細(xì)胞或組織時(shí)，培養(yǎng)所述細(xì)胞或組織以形成愈傷組織；(e)在再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述愈傷組織以產(chǎn)生單植株，其在基因組中對(duì)于同源重組是雜合的；和(f)所述植株通過(guò)雜交以產(chǎn)生基因修飾的高等植物，其對(duì)于同源重組是純合的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，包括在步驟(d)、(e)或(f)之前或之后，從植物細(xì)胞基因組中的同源重組區(qū)缺失正選擇標(biāo)記基因及它的啟動(dòng)子和終止子的步驟，及如果存在的話，缺失轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中缺失步驟包括Cre/lox重組系統(tǒng)、R/RS重組系統(tǒng)或FLP-FRT重組系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明建立了基于同源性重組的基因組修飾技術(shù)，用于將基因組的部分序列改變?yōu)樗谕男蛄校@種技術(shù)曾經(jīng)被認(rèn)為在高等植物中很難達(dá)到高效，且可重復(fù)性不高。根據(jù)本發(fā)明，以高等植物的內(nèi)源基因組序列作為靶序列可以非常高效的和可重復(fù)性的產(chǎn)生同源重組體，而不改變它們的原始基因座。此外，本發(fā)明能生產(chǎn)出轉(zhuǎn)化植物，其中特定基因被修飾而沒(méi)有任何限制，而且也有利于對(duì)基因功能進(jìn)行分析和對(duì)基因組動(dòng)力學(xué)的變化相關(guān)聯(lián)的基因表達(dá)機(jī)制進(jìn)行分析。
文檔編號(hào)C12N15/84GK1610747SQ0282027
公開(kāi)日2005年4月27日 申請(qǐng)日期2002年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月28日
發(fā)明者飯?zhí)镒? 寺田理枝, 稻垣善茂 申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社, 欣根塔有限公司