專利名稱：非線性振幅介電電泳波形用于細胞融合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物細胞之間融合的方法和裝置。更具體地，本發(fā)明涉及提供用電場處理生物細胞的方法和裝置，使生物細胞排列(align)并在進行細胞融合前提高細胞膜的接觸。
背景技術(shù)：
如果一個天然帶電的生物細胞放置于均勻電場中，如由一對平面的電極提供的電場，生物細胞并不向一個或另一個電極移動，因為來自于兩個電極的吸引力是相同的。
另一方面如果天然帶電的生物細胞放置于非均勻電場，如由一對非平面的電極提供的電場，如圖1現(xiàn)有技術(shù)，生物細胞形成偶極(dipole)，被相比另一個具有更大吸引力的電極所吸引，向具有更大吸引力的電極移動。
這樣的非均勻電場用于介電電泳(dielectrophoresis)，使用介電電泳排列活的細胞，然后融合/電穿孔脈沖以融合細胞已自七十年代早期見于文獻中。此方法用于產(chǎn)生用于醫(yī)療目的的兩種不同細胞類型的雜種，用于生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤生產(chǎn)，用于核融合，用于生產(chǎn)其它雜種細胞。介電電泳是對天然帶電的顆粒，如活細胞，施加電場力的方法。該電場力來自于非均勻電場，其在細胞內(nèi)分別加電形成偶極。偶極形成后，非均勻電場使細胞向最低或最高電場強度移動。該移動取決于生物細胞或顆粒，介質(zhì)的相對電導(dǎo)率和介電常數(shù)。該雙向電場力是電場平方的函數(shù)，所以電場極性并不重要。該力是生物細胞或顆粒，介質(zhì)的相對電導(dǎo)率和介電常數(shù)的函數(shù)。典型地，AC電壓波，如正弦波，施加于電極間以產(chǎn)生交替電場。正弦波電壓，頻率，持續(xù)時間(duration)根據(jù)特定細胞類型優(yōu)化。施加AC以排列細胞后，施加一或多個融合/電穿孔脈沖以在細胞膜上形成通道，在此來自兩個細胞的細胞膜混合。這樣的通道使多個細胞的成分混合以形成雜種細胞。融合脈沖后，可施加另一AC電場以保持細胞在一起從而使融合細胞穩(wěn)定。在某些情況下，AC電壓線性增加或減少以阻止由于電場的突然施加而對細胞的損害。
細胞融合的應(yīng)用實例包括雜交瘤生產(chǎn)和細胞核傳遞。電融合的最近應(yīng)用是生產(chǎn)用于癌癥免疫治療的治療雜種。這些雜種產(chǎn)生自體外(ex-vivo)方法的癌癥腫瘤細胞和免疫系統(tǒng)樹突狀細胞。每一治療需要大量活雜種，這提出了對高效生產(chǎn)雜種的方法的要求。
有很多技術(shù)可用于進行細胞融合(電的，機械的，化學的)。本發(fā)明涉及電的方法。現(xiàn)今的電技術(shù)使用與電極裝置相連的電壓波形發(fā)生器。根據(jù)相關(guān)的已知電的，機械的，化學的技術(shù)，下列文獻引用作為參考4,326,934 April 27，1982 Pohl4,441,972 April 10，1982 Pohl4,764,473 Augustl′6，1988 Matschke等4,784,954 November 15，1988 Zimmermann5,304,486 April 19，1994 Chang6,010,613 January 4，2000 Walters等WO00/60065 October 12，2000 Walters等根據(jù)上述，已知使用具有固定振幅(amplitude)，參見圖3現(xiàn)有技術(shù)，或線性增加振幅，參見圖4現(xiàn)有技術(shù)，的融合前電場波形(pre-fusionelectric field waveform)。圖5表示了現(xiàn)有技術(shù)進行電場波的細胞融合整體方案，其中融合前電場波形后是融合/電穿孔脈沖，然后是融合后電場波(post-fusion electric field waveform)。
然而，融合前電場波形固定振幅或線性增加振幅后的細胞融合的效率不能達到應(yīng)用于癌癥免疫治療的治療雜種生產(chǎn)所需的較高效率。因此，需要提供融合前電場波形，其可相對用固定振幅或線性增加振幅融合前電場波形，提高生物細胞的細胞融合效率。
更具體地，根據(jù)Chang的U.S.5,304,486，其中圖2E公開了線性低電壓presine AC波形，高電壓線性電穿孔AC波形，和低電壓線性后穿孔AC波形。Chang的發(fā)明僅局限在融合/電穿孔脈沖。Chang只公開了線性低電壓presine AC波形。Chang沒有公開非線性低電壓presine AC波形。Chang沒有關(guān)注presine AC波形，而只是泛泛提及。
細胞融合系統(tǒng)的第一步是將細胞接觸。在任何情況下，必須對細胞施加足夠的力以克服負表面電荷。只施加均勻電場將不會移動細胞，因為細胞的靜電荷是零。因此，從電場的定義沒有施加力力＝(電場)*(電荷)然而，非均勻電場在細胞內(nèi)移動正離子到一側(cè)，負離子到另一側(cè)而產(chǎn)生偶極，如圖1現(xiàn)有技術(shù)所示。一旦誘導(dǎo)產(chǎn)生了偶極，因為在一側(cè)的電場強度大于另一側(cè)，對細胞就會產(chǎn)生凈余的力。細胞在一個方向的移動引起細胞在某一區(qū)域集中。由于細胞現(xiàn)在是偶極，細胞的負電側(cè)會吸引另一細胞的正電側(cè)以克服負表面電荷，如圖2現(xiàn)有技術(shù)所示。由電極裝置產(chǎn)生非均勻電場。非均勻性是電極參數(shù)的函數(shù)，如圖1和2現(xiàn)有技術(shù)所示。
通常，要融合的細胞類型放置于低電導(dǎo)介質(zhì)(低于0.01S/m)以最小化電阻加熱(ohmic heating)，其可能損害細胞并引起擾動(turbulence)而減少融合雜種數(shù)。因此，需要要進行細胞融合的生物細胞被處理以降低細胞排列和細胞膜接觸過程中的熱量。
波形發(fā)生器具有兩個功能。第一個是產(chǎn)生AC電壓波，其通過電極裝置轉(zhuǎn)化為AC電場。此AC電場然后使細胞排列/接觸。第二個功能是產(chǎn)生脈沖電壓，其電穿孔細胞膜，融合細胞。在某些情況下，AC電壓在融合脈沖后產(chǎn)生以保持細胞成列，直到融合產(chǎn)物成活或穩(wěn)定。
成功融合的因素之一是相鄰細胞間的膜接觸。融合脈沖施加前的此接觸越接近，融合效率越高。在U.Zimmermann等，″Electric Field-InducedCell to-Cell Fusion”，J.Membrane Biol.67，165-182(1982)中，Zimmermann指出提高融合脈沖前AC波電場強度可能是優(yōu)選方法。明顯地，需要待融合生物細胞用融合前電場波形預(yù)處理，其產(chǎn)生增加的細胞膜接觸而沒有擾動或加熱。
此外，為什么不希望馬上提供高振幅排列波形給待融合細胞有幾方面的原因。第一個原因是機械原因。馬上施加高振幅排列波形會引起極端力在細胞上，引起細胞向電極快速移動。該快速移動會在細胞周圍介質(zhì)引起擾動力。此擾動力使不會形成細胞的完整串珠鏈(pearl chains)，擾動力會引起已經(jīng)形成的細胞串珠鏈破裂。
第二個原因是這樣的高振幅排列波形會引起細胞懸浮于其中的介質(zhì)加熱。加熱也會引起擾動，從而使排列細胞的完整的串珠鏈不能形成，并引起已經(jīng)形成的細胞串珠鏈破裂。介質(zhì)中的熱量也會降低細胞存活力。
如上所述，希望避免由于馬上施加高振幅排列波形給待融合生物細胞而引起的機械力，擾動，加熱。
因此，現(xiàn)有技術(shù)中指出在采用電穿孔脈沖進行細胞融合前，使用融合前電場波形是已知的，上述技術(shù)沒有教導(dǎo)或提示用于細胞融合的介電電泳波形，其具有下列特征組合(1)提供融合前電場波形給生物細胞，其提高用固定振幅或線性增長振幅融合前電場波形的生物細胞的細胞融合效率；(2)避免了由于馬上施加高振幅排列波形給待融合生物細胞而引起的機械力，擾動，加熱；(3)降低了用于在細胞融合前提高細胞排列和細胞膜接觸的用融合前電場波形處理的生物細胞的加熱；(4)在進行細胞融合前，提高了用融合前電場波形處理的生物細胞間的細胞膜接觸。上述希望的特征由用于本發(fā)明細胞融合的獨特的非線性介電電泳波形提供，下面將予以說明。本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)的其它優(yōu)勢是顯而易見的。
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發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是現(xiàn)有技術(shù)的改進。根據(jù)本發(fā)明，在施加一或多個融合/電穿孔脈沖前，對生物細胞施加在振幅上具有非線性改變的非線性電壓波形。本發(fā)明的施加非線性電壓波形的結(jié)果，是首先引起或迫使相鄰細胞的切向細胞接觸和排列。然后，作為進一步應(yīng)用非線性電壓波形的結(jié)果，本發(fā)明引起或迫使相鄰細胞間的靠近細胞膜接觸。在此，由于振幅上非線性變化的波形的影響，生物細胞10相互之間被壓縮。生物細胞可以是相似的真核細胞，或是不相似的真核細胞。
振幅上非線性變化的融合前非線性電壓波形，可以是非線性AC電壓波形。AC電場波形可包括正弦波。波形的振幅的非線性變化的參數(shù)可設(shè)定為使融合過程可根據(jù)細胞類型優(yōu)化。由于AC波形的振幅隨時間而非線性改變，可以較低能量(較少加熱)和較高融合效率進行生物細胞排列和融合。
優(yōu)選地，融合前電場波形包括相對低的振幅，長的持續(xù)時間的電場波形，然后是相對短的持續(xù)時間，高振幅電場波形。更具體地，相對低的振幅，長持續(xù)時間電場波形慢慢有利于生物細胞串珠鏈形成和排列，而不會引起擾動或細胞死亡。一旦細胞排列和成串珠鏈，相對高的振幅，短的持續(xù)時間融合前電場波形施加于生物細胞。這些細胞已經(jīng)排列較短的時間，在加熱發(fā)生前，沒有擾動發(fā)生細胞壓縮。
融合前電場波形振幅能根據(jù)時間，以階段式(stepped)的非線性方式改變。融合前電場波形振幅能根據(jù)時間，以連續(xù)的非線性方式改變。
融合前電場波形包括AC電場波形，其在振幅上以非線性根據(jù)時間改變。AC電場波形的振幅可按照非線性算法(algorithm)根據(jù)時間以非線性改變。
優(yōu)選的，AC電場波形具有AC波形電場強度10volts/cm～1000volts/cm。
非線性階梯式(step-wise)振幅提高波形可以作為融合前電場波形以相鄰梯級或不相鄰梯級施加。
施加振幅以非線性方式改變的融合前電場波形后，對生物細胞進行細胞融合脈沖。此外，細胞融合脈沖后可以用非線性AC電場波形處理生物細胞。
有多個非線性波形的實施方式，其振幅根據(jù)時間以非線性改變，如其中AC振幅的融合前類型根據(jù)時間改變?？捎糜谡穹S時間非線性改變的算法實例包括指數(shù)，對數(shù)，多項式，冪函數(shù)，階躍函數(shù)，s形曲線函數(shù)(sigmoidfunction)，一般非線性算法(non-linear algorithm generally)等。
如上所述，本發(fā)明的一個目的是提供新的，改進的非線性融合前電場波形，其作為細胞融合前的介電電泳波形，振幅根據(jù)時間以非線性改變。
本發(fā)明另一方面是提供細胞融合用的非線性介電電泳波形，其中AC電場波形施加與生物細胞，提高用固定振幅或線性增加振幅融合前電場波形處理的生物細胞細胞融合效率。
本發(fā)明另一方面是提供新的，非線性用于細胞融合的非線性介電電泳波形，其降低用融合前電場波形處理的生物細胞細胞的加熱，在細胞融合前用于提高細胞排列和細胞膜接觸。
本發(fā)明另一方面是提供新的，改進的非線性介電電泳波形用于細胞融合，其避免機械力，擾動，加熱，這些都是當生物細胞進行細胞融合馬上時間高振幅排列波形給待融合生物細胞而產(chǎn)生的。
本發(fā)明的另一方面是提供新的改進的非線性介電電泳波形用于細胞融合，其提高用融合前電場波形在進行細胞融合前處理的生物細胞間的細胞膜接觸。
這些連同其它本發(fā)明目標，在說明書中予以指出，并形成本發(fā)明的一部分。為更好理解本發(fā)明，其運行優(yōu)勢和具體目標，參考要與附圖和說明部分同時，其中有本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。


參考附圖，更有利于理解本發(fā)明。以下為

圖1表示了非對稱電極產(chǎn)生的非均勻電場影響下，生物細胞中現(xiàn)有技術(shù)偶極的形成。
圖2表示了非對稱電極產(chǎn)生的非均勻電場中，生物細胞的移動的現(xiàn)有技術(shù)通道，也表示了生物細胞串珠鏈排列和形成。
圖3表示了現(xiàn)有技術(shù)固定振幅融合前電場波形圖4表示了現(xiàn)有技術(shù)線性增長振幅融合前電場波形。
圖5表示了整體現(xiàn)有技術(shù)方式，用于采用電場波形進行細胞融合，其中融合前電場波形后是融合/電穿孔脈沖，其是融合后電場波形。
圖6表示了施加本發(fā)明的非線性介電電泳波形前的獨立的生物細胞。
圖7表示了應(yīng)用本發(fā)明相對低振幅，長持續(xù)時間融合前電場波形期間，串珠鏈排列中切向接觸生物細胞。
圖8表示了在圖7所應(yīng)用的相對低振幅，長持續(xù)時間融合前電場波形后，應(yīng)用本發(fā)明相對高振幅，短持續(xù)時間融合前電場波形期間，緊密接觸并壓縮的生物細胞。
圖9表示采用冪函數(shù)在應(yīng)用于生物細胞的融合前電場波形中的變化，其在冪函數(shù)的常數(shù)“k”上有變化。每一次選擇的常數(shù)“k”，有相對低振幅，長持續(xù)時間融合前電場波形部分，然后是相對高振幅，短持續(xù)時間融合前電場波形部分。
圖10表示了選擇的“k”可調(diào)整的非線性增長連續(xù)的AC波形，其作為采用圖9所示挑選的冪函數(shù)常數(shù)“k”的冪函數(shù)的融合前電場AC波形應(yīng)用，顯示相對低振幅，長持續(xù)時間融合前電場波形后跟相對高振幅，短持續(xù)時間融合前電場波形。
圖11表示了作為融合前電場波形應(yīng)用的非線性S形(sigmoidallyshaped)波形，其中從相對低振幅，長持續(xù)時間融合前電場波形到相對高振幅，短持續(xù)時間融合前電場波形的轉(zhuǎn)換相對慢。
圖12表示了作為融合前電場波形應(yīng)用的非線性S形波形，其中從相對低振幅，長持續(xù)時間融合前電場波形到相對高振幅，短持續(xù)時間融合前電場波形的轉(zhuǎn)換相對快。
圖13表示了作為融合前電場波形應(yīng)用的非線性階梯式增長波形，其中提供的融合前電場波形是非相鄰階梯，其中第一融合前電場波形是相對低振幅，長持續(xù)時間融合前電場波形，其中提供關(guān)閉時間(off-time)，其中第二融合前電場波形是相對高振幅，短持續(xù)時間融合前電場波形。
圖14表示了作為融合前電場波形應(yīng)用的非線性階梯式增長波形，其中提供的融合前電場波形是相鄰階梯，其中第一融合前電場波形是相對低振幅，長持續(xù)時間融合前電場波形，其中提供關(guān)閉時間(off-time)，其中第二融合前電場波形是相對高振幅，短持續(xù)時間融合前電場波形并且緊接在第一融合前電場波形之后應(yīng)用。
具體實施例方式
提供非線性介電電泳波形用于細胞融合的方法和裝置，參考附圖，如下提供。
本發(fā)明是現(xiàn)有技術(shù)的改進。根據(jù)本發(fā)明，在應(yīng)用一或多個細胞融合脈沖前，非線性電壓波形，其振幅以非線性方式改變，應(yīng)用于生物細胞。分離的生物細胞10如圖6所示。作為應(yīng)用非線性電壓波形的結(jié)果，本發(fā)明首先引起或迫使相鄰細胞間的膜切向接觸，如圖7所示。然后，作為應(yīng)用非線性電壓波形的結(jié)果，本發(fā)明首先引起或迫使相鄰細胞間的膜緊密接觸，如圖8所示。如圖8所示，在非線性電壓波形影響下，生物細胞10相互之間壓縮。
非線性電壓波形，其振幅以非線性方式改變，可以是非線性AC電壓波形。波形的非線性參數(shù)可以設(shè)定，以使根據(jù)細胞類型優(yōu)化融合過程。由于AC波形的振幅隨時間非線性改變，可以較低能量(較少加熱)和更高效率進行生物細胞排列和融合。
更具體地，根據(jù)圖10，采用非線性AC電壓波形，優(yōu)選非線性AC電壓波形在波形的第一部分具有相對低的AC電壓振幅，其引起生物細胞密切接近和排列。正好在用施加融合脈沖前，波形的第二部分然后提高振幅。此振幅的提高產(chǎn)生短期的，密集的，非均勻電場，其迫使生物細胞緊密接觸。由于排列所需較低的電壓和較短的持續(xù)時間強度AC部分，加熱被減少。
有多種AC振幅隨時間改變的類型，例如指數(shù)，對數(shù)，多項式，冪函數(shù)，階躍函數(shù)，s形曲線函數(shù)(sigmoid function)，一般非線性算法等。
此非線性波形的一個實施方式是冪函數(shù)，其可有下列的數(shù)學式或算法表示。
作為時間的函數(shù)AC波形的振幅＝[(時間/總的AC持續(xù)時間)k×(停止振幅-起始振幅)]-起始振幅總的AC波形持續(xù)時間，AC起始振幅，AC停止振幅和冪指數(shù)“k”都根據(jù)所用細胞類型優(yōu)化。
圖9中的圖說明了改變冪指數(shù)“k”的效果。圖10表示了具體的冪指數(shù)圖，其中“k”是2。因此，本發(fā)明提供了相對低振幅，長持續(xù)時間融合前電場波形，其產(chǎn)生相對低強度電場以排列生物細胞，然后正好在AC波結(jié)束和細胞融合/電穿孔脈沖前開始提供了相對高振幅，短持續(xù)時間融合前電場波形以使細胞密切接觸。本發(fā)明的振幅方法中的非線性改變也產(chǎn)生較少的加熱和較少的擾動，其進一步可提供細胞雜種產(chǎn)量和生產(chǎn)效率升高。
如上所述，圖10中表示了作為融合前電場波形應(yīng)用的非線性，振幅增加的連續(xù)波形，其是冪函數(shù)采用冪指數(shù)“k”為2。
圖11表示了作為融合前電場波形應(yīng)用的非線性S形波形，其振幅以非線性改變，其中從相對低振幅，長持續(xù)時間融合前電場波形到相對高振幅，短持續(xù)時間融合前電場波形的轉(zhuǎn)換相對慢。
圖12表示了作為融合前電場波形應(yīng)用的非線性S形波形，其振幅以非線性改變，其中從相對低振幅，長持續(xù)時間融合前電場波形到相對高振幅，短持續(xù)時間融合前電場波形的轉(zhuǎn)換相對快。
圖13表示了作為融合前電場波形應(yīng)用的非線性階梯式增長波形，其振幅以非線性改變，其中提供的融合前電場波形是非相鄰階梯，其中第一融合前電場波形是相對低振幅，長持續(xù)時間融合前電場波形，其中提供關(guān)閉時間(off-time)，其中第二融合前電場波形是相對高振幅，短持續(xù)時間融合前電場波形。
圖14表示了作為融合前電場波形應(yīng)用的非線性階梯式增長波形，其振幅以非線性改變，其中提供的融合前電場波形是相鄰階梯，其中第一融合前電場波形是相對低振幅，長持續(xù)時間融合前電場波形，其中提供關(guān)閉時間(off-time)，其中第二融合前電場波形是相對高振幅，短持續(xù)時間融合前電場波形并且緊接在第一融合前電場波形之后應(yīng)用。
本發(fā)明可以通過能輸送如上所述的波形的融合前電場波形進行。在此，可以對Cyto Pulse PA-4000系統(tǒng)進行軟件改變，其采用了PA-101 AC波形發(fā)生器。該Cyto Pulse Sciences，Inc.PulseAgile(Reg.U.S.Pat.AndTm.Off.)系統(tǒng)軟件現(xiàn)在可以產(chǎn)生該波形(參見US6010613)。用戶輸入非線性波形參數(shù)，計算機產(chǎn)生AC波形(融合前電場波形)和融合脈沖波形(電穿孔波形)。
采用階段式(stepped)融合前電場波形進行試驗，記錄細胞融合改善，所述波形振幅以非線性改變。
A549細胞購買自ATCC。溶解細胞，放置于組織培養(yǎng)燒瓶中，采用ATCC推薦培養(yǎng)基。制備自處于細胞因子7天的外周血單核細胞培養(yǎng)液的樹突狀細胞參與融合。
每一細胞類型8百萬細胞/ml相同混合以產(chǎn)生混合物中每一細胞類型4百萬/ml的終濃度。3ml細胞懸浮液體積用于每一融合。
由以下步驟組成。細胞離心，重懸于10ml Cyto Pulse市售Cytofusion培養(yǎng)基(配方C)中。同一培養(yǎng)基中沖洗兩次，沖洗后重懸于Cytofusion培養(yǎng)基中。細胞計數(shù)，調(diào)細胞濃度為8百萬/ml?；旌舷嗤w積的A549細胞和樹突狀細胞。3ml細胞懸浮液放置于6ml容量同軸細胞融合電極中，其具有3.9cm直徑的內(nèi)部圓柱陽極，與陰極間隙4mm。采用下述細胞融合方法。
兩個試驗和對照組參數(shù)如下A組(本發(fā)明)第一融合前電場波形45V到45V，20秒，0.8MHz第二融合前電場波形75V到75V.10秒，0.8MHz融合/電穿孔脈沖1×800V，40微秒融合后/電穿孔脈沖(Post fusion/electroporation pulse)45V to 45V，50秒，0.8MHzB組(現(xiàn)有技術(shù))第一融合前電場波形75V to 75V.10秒，0.8MHz融合/電穿孔脈沖1×800V，40微秒融合后/電穿孔脈沖45V到45V，50秒，0.8MHzC組(對照—不采用電)融合后，細胞靜置30分鐘使融合成熟(fusionmaturation)。具有10％胎牛血清的3ml組織培養(yǎng)基加入細胞融合電極中的細胞懸浮液中。15分鐘后收獲細胞進行分析。
采用市售Cytospin(Shandon)離心，將細胞等分樣放置到silinized顯微鏡載玻片上。采用免疫組化鑒定細胞。A549細胞采用抗角蛋白單克隆抗體鑒定，采用抗人HLA-DR單克隆抗體鑒定樹突狀細胞。Meyershema toxylain用于核復(fù)染色。人工計數(shù)具有棕色角蛋白染色或紅色HLA-DR染色或兩者都有的細胞。
結(jié)果在下表中表示，其中顯示了A組中混合A549和樹突狀細胞(其在細胞融合前用本發(fā)明的融合前電場波形處理)的融合細胞百分比，B組中混合A549和樹突狀細胞(其在細胞融合前用現(xiàn)有技術(shù)融合前電場波形處理)的融合細胞百分比，C組中混合A549和樹突狀細胞(其在細胞融合前沒有用任何融合前電場波形處理)的融合細胞百分比。
表

上表第一列列出了進行融合處理的A549和樹突狀細胞的各自組別。第二列列出了A549細胞和另一個A549細胞融合形成的融合細胞百分比。第三列表示樹突狀細胞和另一個樹突狀細胞融合形成的融合細胞百分比。第四列表示樹突狀細胞和A549細胞形成的融合細胞百分比。
注意到每一類型的細胞融合(A549/A549，樹突狀細胞/樹突狀細胞，樹突狀細胞/A549)，融合細胞的百分比A組(采用本發(fā)明的融合前電場波形)大于B組(采用現(xiàn)有技術(shù)的融合前電場波形)或C組(不采用融合前電場波形)。更具體地，7.2％大于6.8，大于2.2％。5.4％大于4.0％，大于2.2％。22.7％大于18.1％，大于10.8％。總之，采用本發(fā)明融合前電場波形提供了比現(xiàn)有技術(shù)和不采用融合前電場波形都高的融合效率。
本發(fā)明的使用和操作方式，如上所述是明顯的，無需進一步的論述。
通過提供新的改進的非線性介電電泳波形用于細胞融合可以完成本發(fā)明的所有目標，其可有利的用于提供融合前電場波形，其可提高用固定振幅或線性增加振幅融合前電場波形處理的生物細胞的細胞融合效率。采用本發(fā)明，非線性介電電泳波形避免了由于立即施加高振幅排列波形到進行細胞融合的生物細胞而產(chǎn)生的機械力，擾動，加熱。采用本發(fā)明，非線性介電電泳波形減少了用融合前電場波形處理的生物細胞的加熱，以在細胞融合前提高細胞排列和細胞接觸。采用本發(fā)明，非線性介電電泳波形提高了細胞融合前用融合前電場波形處理的生物細胞間的細胞膜接觸。
因此，根據(jù)本發(fā)明公開，包括說明書，附圖的詳細說明，對本發(fā)明可以進行多種改變而不偏離本發(fā)明在此提出的原則和概念，這些改變包括，但不限于，尺寸，材料，形狀，樣式，操作的功能和方式，組成和使用等。
權(quán)利要求
1.在對生物細胞進行一或多個細胞融合/電穿孔脈沖前處理生物細胞的方法，包括如下步驟采用融合前電場波形處理細胞，所述波形振幅根據(jù)時間以非線性方式改變。
2.權(quán)利要求1的方法，其中生物細胞首先被排列，然后被壓縮，使細胞在融合前提高細胞膜接觸。
3.權(quán)利要求1的方法，其中融合前電場波形振幅包括相對低振幅，長持續(xù)時間電場波形，然后是相對高振幅，短持續(xù)時間電場波形。
4.權(quán)利要求1的方法，其中融合前電場波形振幅以階段式的非線性方式根據(jù)時間改變。
5.權(quán)利要求1的方法，其中融合前電場波形振幅以連續(xù)的非線性方式根據(jù)時間改變。
6.權(quán)利要求1的方法，其中融合前電場波形包括AC電場波形，其振幅以非線性方式根據(jù)時間改變。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述AC電場波形的振幅按照非線性算法以非線性方式隨時間改變。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述AC電場波形的AC波形電場強度在10伏特/cm到1000伏特/cm之間。
9.權(quán)利要求1的方法，其中融合前電場波形振幅包括非線性階梯式提高的波形，其作為融合前電場波形施加，并且其中所述波形以相鄰梯級或不相鄰梯級提供。
10.權(quán)利要求1的方法，其還包括如下步驟對生物細胞施加細胞融合脈沖，細胞融合脈沖后用AC電場波形處理生物細胞。
11.生物細胞融合前處理生物細胞的方法，包括采用電場振幅處理生物細胞，所述振幅根據(jù)時間以非線性方式改變，從而生物細胞排列并提高了細胞膜接觸，從而細胞融合前，生物細胞相互之間被壓縮。
全文摘要
本發(fā)明涉及提供在生物細胞融合脈沖前處理生物細胞的方法，其包括用融合前電場波形處理生物細胞，其振幅隨時間以非線性改變，從而采用相對低振幅，長持續(xù)時間融合前電場波形使生物細胞首先被排列，然后采用相對高振幅，短持續(xù)時間融合前電場波形壓縮，使細胞融合前細胞膜接觸提高。非線性融合前電場波形可以階段式，連續(xù)的，S形的方式改變，按照非線性算法，采用階梯式的提高相鄰梯級的波形，采用階梯式的提高非相鄰梯級的波形。
文檔編號C12N15/87GK1592787SQ02820027
公開日2005年3月9日 申請日期2002年4月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月31日
發(fā)明者理查德·E·沃爾特斯, 德林·C·沃爾特斯, 艾倫·D·金 申請人:塞托·帕爾斯科技公司