專利名稱：特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
CYP2E1是細(xì)胞色素氧化酶(cytochrome，CYP)超家族重要成員之一，占CYP總量7%。CYP2E1的代謝底物很廣泛，現(xiàn)已知代謝底物有70余種，主要包括三氯乙烯、四氯乙烯、乙醇、苯胺、亞硝酸類化合物等環(huán)境污染物，這些環(huán)境污染物大部分是前致癌物，經(jīng)過CYP2E1催化代謝轉(zhuǎn)化為最終致癌活性物質(zhì)。許多研究表明，CYP2E1介導(dǎo)了多種化合物致肝損傷，如三氯乙烯、乙醇、氯仿等。CYP2E1介導(dǎo)化合物代謝產(chǎn)生細(xì)胞損傷的方式有兩 種①CYP2E1代謝分解底物產(chǎn)生的中間代謝物與核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)結(jié)合，引起細(xì)胞損傷對還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)具有較高的氧化活性，不依賴配體產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致DNA損傷、基因突變。RNA干擾(RNAi)是大部分生物體存在的一種普遍現(xiàn)象，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)，廣泛應(yīng)用于特異抑制基因的表達(dá)及其功能研究。現(xiàn)有技術(shù)中，徐蕓等將siRNA連接到載體pmU6上，形成重組載體，轉(zhuǎn)染E47細(xì)胞，構(gòu)建了抑制CYP2E1基因轉(zhuǎn)錄位點的siRNA表達(dá)載體，雖然該siRNA表達(dá)載體可以在短時間內(nèi)沉默CYP2E1基因的表達(dá)，但其存在干擾效果不夠明顯，轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞毒性大，且無法實現(xiàn)長效穩(wěn)定干擾的缺點。RNA干擾基因表達(dá)功能的實現(xiàn)依賴于siRNA序列的選擇與高效表達(dá)載體的構(gòu)建，但現(xiàn)有技術(shù)中尚無轉(zhuǎn)染效率高且可長效穩(wěn)定表達(dá)、特異抑制CYP2E1基因表達(dá)的shRNA表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，發(fā)明人在干擾序列的選擇以及載體的選擇、重組構(gòu)建方法等方面進(jìn)行了大量的探索研究，預(yù)料不到地發(fā)現(xiàn)，將包含Age I酶切位點和EcoR I酶切位點的shRNA寡核苷酸序列插入PLKO. 1-puro表達(dá)載體的多克隆位點中可成功構(gòu)建靶向CYP2E1基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體，從而完成本發(fā)明。本發(fā)明提供一種特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體，包括PLKO. 1-puro表達(dá)載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列和靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列；所述多克隆位點包括Age I酶切位點和EcoR I酶切位點，所述shRNA寡核苷酸序列由Age I酶切位點+靶核苷酸序列+莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列+靶核苷酸序列互補序列+終止位點序列+EcoR I酶切位點組成，所述shRNA寡核苷酸序列正向插入所述多克隆位點中。采用上述技術(shù)方案,本發(fā)明提供的shRNA寡核苷酸序列插入PLKO. 1-puro表達(dá)載體構(gòu)建得到的shRNA慢病毒表達(dá)載體具有轉(zhuǎn)染效率高，用量少，可持續(xù)、高效、穩(wěn)定、特異地抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的優(yōu)點，抑制效果好，可作為有力工具應(yīng)用于制備治療CYP2E1基因表達(dá)異常相關(guān)疾病的藥物。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述靶核苷酸序列為5 ’ -GCTCCAGCTTTACAATAAT-3 ’(SEQ ID NO :1)，所述shRNA寡核苷酸序列包括正義鏈序列和反義鏈序列，所述正義鏈序列為5’ -CCGGTGCTCCAGCTTTACAATAATTTCAAGAGAATTATTGTAAAGCTGGA
GCmTTTG-3’ (SEQ ID NO :2)，所述反義鏈序列為5’ -AATTCAAAAAAGCTCCAGCTTTACAATAATTCTCTTGAAATTATTGTAAAGCTGGAGCA-3’ (SEQ ID NO :3)。采用上述序列，shRNA寡核苷酸可成功插入至PLKO. 1-puro表達(dá)載體中，對CYP2E1基因表達(dá)的抑制效果顯著、持續(xù)且穩(wěn)定。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述靶核苷酸序列為5 ’ -GACCTCAGCCCTATACATA-3 ’(SEQ ID NO :4)，所述shRNA寡核苷酸序列包括正義鏈序列和反義鏈序列，所述正義鏈序列為5’ -CCGGTGACCTCAGCCCTATACATATTCAAGAGATATGTATAGGGCTGAGGTCmTTTG-3’ (SEQ ID NO :5)，所述反義鏈序列為5’ -AATTCAAAAAAGACCTCAGCCCTATACATATCTCTTGAATATGTATAGGGCTGAGGTCA-3，(SEQ ID NO :6)。采用上述序列，shRNA寡核苷酸可成功插入至PLKO. 1-puro表達(dá)載體中，對CYP2E1基因表達(dá)的抑制效果顯著、持續(xù)且穩(wěn)定。作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述靶核苷酸序列為5 ’ -GCCAGAACACTTCCTGAAT-3 ’(SEQ ID NO :7)，所述shRNA寡核苷酸序列包括正義鏈序列和反義鏈序列，所述正義鏈序列為5’ -CCGGTGCCAGAACACTTCCTGAATTTCAAGAGAATTCAGGAAGTGTTC
GTGCmTTTG-3’ (SEQ ID NO :8)，所述反義鏈序列為5’-AAITCAAAAAAGCCAGAACACTTCCTGAATTCTCTTGAA ATTCAGGAAGTGTTCGTGCA-3’(SEQ ID NO :9)。采用上述序列，shRNA寡核苷酸可成功插入至PLKO. 1-puro表達(dá)載體中，對CYP2E1基因表達(dá)的抑制效果顯著、持續(xù)且穩(wěn)定。相應(yīng)的，本發(fā)明還提供特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟
A)shRNA寡核苷酸序列的設(shè)計根據(jù)CYP2E1的mRNA全序列，經(jīng)BLAST同源性比對證實特異性后應(yīng)用RNA structure 4. 4軟件對祀mRNA序列的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行評估得到祀核苷酸序列，設(shè)計并合成靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列；
B)shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定將合成的shRNA寡核苷酸單鏈等量混合，退火形成雙鏈的shRNA，提取質(zhì)粒PLKO. 1-puro，用限制性內(nèi)切酶Age I ,EcoR I雙酶切，電泳、切膠回收載體，再用T4 DNA Iigase分別將雙鏈shRNA連接到PLKO. 1-puro表達(dá)載體中，得到連接產(chǎn)物；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌JM107中，均勻涂布到含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基平板上，挑取陽性單克隆菌落培養(yǎng)保存并進(jìn)行PCR鑒定，將初步鑒定結(jié)果說明shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液進(jìn)行測序鑒定；
C)shRNA慢病毒表達(dá)載體的抽提將測序結(jié)果證實shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液擴增培養(yǎng)，進(jìn)行大量抽提重組質(zhì)粒，得到特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體。本發(fā)明利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建靶向肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)鑒定構(gòu)建成功后，包裝成病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)入L-02肝細(xì)胞，嘌呤霉素篩選細(xì)胞后，使用實時熒光定量PCR和Western Blot技術(shù)分別從mRNA和蛋白水平驗證CYP2E1基因表達(dá)的抑制效果，實驗結(jié)果證明本發(fā)明提供的shRNA寡核苷酸可成功插入至PLKO. 1-puro表達(dá)載體中，且對CYP2E1基因表達(dá)的抑制效果顯著、持續(xù)且穩(wěn)定。酶切和傳統(tǒng)菌落PCR是重組載體是否構(gòu)建成功的初步鑒定方法，然后將鑒定結(jié)果為陽性的菌液測序就可以證實重組載體的構(gòu)建成功。本發(fā)明所采用的起始載體全長為7032bp，而插入的雙鏈shRNA只有59bp ;傳統(tǒng)菌落PCR鑒定重組載體是在插入片段上設(shè)計引物，而本發(fā)明中插入的雙鏈shRNA形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，因此，酶切和傳統(tǒng)菌落PCR都不適合用來鑒定RNAi載體是否構(gòu)建成功。長期以來，只能依靠測序的鑒定RNAi載體是否構(gòu)建成功，而在載體構(gòu)建過程中存在的假陽性菌落會增加實驗的費用，延長實驗的時間。本發(fā)明在PLKO. 1-puro載體雙鏈shRNA插入位點兩端設(shè)計引物，通過重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物和原質(zhì)粒PCR產(chǎn)物大小的比較鑒定重組載體是否構(gòu)建成功，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、快捷且成本低等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用于RNAi載體構(gòu)建的鑒定。本發(fā)明還提供特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體在制備治療CYP2E1基因表達(dá)異常相關(guān)疾病的藥物中的用途。 另一方面，本發(fā)明還提供一種特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的沉默細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括如下步驟
A)培養(yǎng)293FT細(xì)胞并接種到六孔板中，每孔IO6個細(xì)胞，使用如權(quán)利要求I至4中任一項所述的shRNA慢病毒表達(dá)載體，與pCMV-VSV-G、pCMV_dR8. 91共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞；
B)48h、72h分別收集含病毒的上清培養(yǎng)基，過濾病毒液，檢測病毒的滴度；
C)培養(yǎng)L-02肝細(xì)胞并接種到六孔板中，每孔IO6個細(xì)胞，加入用RPMI-1640完全培養(yǎng)基以I :10稀釋的病毒液，再加入聚凝胺至終濃度為5 ii g/mL ；
D)培養(yǎng)24h后，棄去含病毒的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，加入新鮮的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后用嘌呤霉素篩選細(xì)胞，得到特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的沉默細(xì)胞。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明提供的shRNA慢病毒表達(dá)載體具有轉(zhuǎn)染效率高，用量少，可持續(xù)、高效、穩(wěn)定、特異地抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的優(yōu)點，可作為有力工具應(yīng)用于制備治療CYP2E1基因表達(dá)異常相關(guān)疾病的藥物；本發(fā)明提供的shRNA慢病毒表達(dá)載體以及沉默細(xì)胞的構(gòu)建方法，操作效果好，可排除假陽性菌落的干擾，避免了不必要的測序花費，可高效、特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)。


圖I為PLKO. 1-puro表達(dá)載體的質(zhì)粒圖譜。圖2為PLKO. 1-puro重組質(zhì)粒單克隆菌落示意圖；其中，A為pLK0_2EIshRNAc組，B 為 pLK0-2ElshRNAl 組，C 為 pLK0_2ElshRNA2 組，D 為 pLK0_2ElshRNA3 組。圖3 為菌落 PCR 鑒定結(jié)果示意圖；其中，M:DNA marker,0T03 pLK0-2EIshRNAc ；11 13 pLK0-2ElshRNAl ；+ 質(zhì)粒 PLKO. 1-puro ;21 23 :pLK0_2ElshRNA2 ;31 33 pLK0-2ElshRNA3。圖4為重組載體測序結(jié)果示意圖；其中，a pLK0-2EIshRNAc, b :pLK0_2ElshRNAl，c pLK0-2ElshRNA2, d :pLK0_2ElshRNA3。圖5為嘌呤霉素篩選細(xì)胞后熒光定量PCR檢測結(jié)果示意圖。圖6為嘌呤霉素篩選細(xì)胞后Western blot檢測結(jié)果示意圖。
圖7為嘌呤霉素篩選細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)20代后Western blot檢測結(jié)果示意圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖與具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。L-02肝細(xì)胞購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心，293FT細(xì)胞、Lipofectamine 2000均購自Invitrogen公司，慢病毒表達(dá)載體PLKO. 1-puro、包膜蛋白質(zhì)粒pCMV-VSV-G和包裝輔助質(zhì)粒pCMV_dR8. 91均購自Biovector公司,RNeasy Mini Kit購自Qiagen公司，Lenti-X GoStix試劑盒購自TAKARA生物技術(shù)公司。實施例一靶向肝細(xì)胞CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列的設(shè)計。在GenBank查找到CYP2E1的mRNA全序列(NM_000773. 3)，經(jīng)BLAST同源性比對證實特異性后應(yīng)用RNA structure 4. 4軟件對靶mRNA序列的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行評估，最后篩選出3條19nt靶核苷酸序列，具體序列見表I。 表I CYP2EI基因的3條特異性siRNA靶核苷酸序列
權(quán)利要求
1.一種特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的ShRNA慢病毒表達(dá)載體，其特征在于包括PLKO. Ι-puro表達(dá)載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列和靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列；所述多克隆位點包括Age I酶切位點和EcoR I酶切位點，所述shRNA寡核苷酸序列由Age I酶切位點+靶核苷酸序列+莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列+靶核苷酸序列互補序列+終止位點序列+EcoR I酶切位點組成，所述shRNA寡核苷酸序列正向插入所述多克隆位點中。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體，其特征在于所述靶核苷酸序列為5’ -GCTCCAGCTTTACAATAAT-3’ (SEQ ID NO :1)，所述shRNA寡核苷酸序列包括正義鏈序列和反義鏈序列，所述正義鏈序列為5’ -CCGGTGCTCCAGCTTTACAATMTTTCMGAGMTTATTGTAAAGCTGGAGCTTTTTTG-3’(SEQ ID NO 2),所述反義鏈序列為5’ -AATTCAAAAAAGCTCCAGCTTTACAATAATTCTCTTGAAATTATTGTAAAGCTGGAGCA-3’ (SEQ ID NO :3)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體，其特征在于所述靶核苷酸序列為5’ -GACCTCAGCCCTATACATA-3’ (SEQ ID NO :4)，所述shRNA寡核苷酸序列包括正義鏈序列和反義鏈序列，所述正義鏈序列為5’ -CCGGTGACCTCAGCCCTATACATATTCAAGAGATATGTATAGGGCTGAGGTCTTTTTTG-3J(SEQ ID NO :5)，所述反義鏈序列為5’ -AATTCAAAAAAGACCTCAGCCCTATATCTCTTGAATATGTATAGGGCTGAGGTCA-3’ (SEQ ID NO :6)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體，其特征在于所述靶核苷酸序列為5’ -GCCAGAACACTTCCTGAAT-3’ (SEQ ID NO :7)，所述shRNA寡核苷酸序列包括正義鏈序列和反義鏈序列，所述正義鏈序列為5’ -CCGGTGCCAGAACACTTCCTGAATTTCAAGAGAATTCAGGAAGTGTTCGTGCTTTTT TG-3’ (SEQ ID NO :8)，所述反義鏈序列為5’-AATTCAAAAAAGCCAGAACACTTCCTGAATTCTCTTGAA ATTCAGGAAGTGTTCGTGCA-3’ (SEQ ID NO :9)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任ー項中所述的特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 A)shRNA寡核苷酸序列的設(shè)計根據(jù)CYP2E1的mRNA全序列，經(jīng)BLAST同源性比對證實特異性后應(yīng)用RNA structure 4. 4軟件對祀mRNA序列的ニ級結(jié)構(gòu)進(jìn)行評估得到祀核苷酸序列，設(shè)計并合成靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列； B)shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定將合成的shRNA寡核苷酸單鏈等量混合，退火形成雙鏈的shRNA，提取質(zhì)粒PLK0. Ι-puro，用限制性內(nèi)切酶Age I、EcoR I雙酶切，電泳、切膠回收載體，再用T4 DNA Iigase分別將雙鏈shRNA連接到PLKO. I-pur ο表達(dá)載體中，得到連接產(chǎn)物；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌JM107中，均勻涂布到含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基平板上，挑取陽性單克隆菌落培養(yǎng)保存菌液并進(jìn)行PCR初歩鑒定，將初步鑒定結(jié)果說明shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液進(jìn)行測序鑒定； C)shRNA慢病毒表達(dá)載體的抽提將測序結(jié)果證實shRNA寡核苷酸序列插入成功的菌液擴增培養(yǎng)，進(jìn)行大量抽提重組質(zhì)粒，得到靶向CYP2E1基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任ー項中所述的特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體在制備治療CYP2E1基因表達(dá)異常相關(guān)疾病的藥物中的用途。
7.一種特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的沉默細(xì)胞的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 A)培養(yǎng)293FT細(xì)胞并接種到六孔板中，每孔IO6個細(xì)胞，使用如權(quán)利要求I至4中任一項所述的shRNA慢病毒表達(dá)載體，與pCMV-VSV-G、pCMV_dR8. 91共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞； B)48h、72h分別收集含病毒的上清培養(yǎng)基，過濾病毒液，檢測病毒的滴度； C)培養(yǎng)L-02肝細(xì)胞并接種到六孔板中，每孔IO6個細(xì)胞，加入用RPMI-1640完全培養(yǎng)基以I :10稀釋的病毒液，再加入聚凝胺至終濃度為5 μ g/mL ； D)培養(yǎng)24h后，棄去含病毒的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，加入新鮮的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后用嘌呤霉素篩選細(xì)胞，得到特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的沉默細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種特異抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的shRNA慢病毒表達(dá)載體，包括PLKO.1-puro表達(dá)載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列和靶向CYP2E1基因的shRNA寡核苷酸序列，所述shRNA寡核苷酸序列正向插入所述多克隆位點中。本發(fā)明提供的shRNA慢病毒表達(dá)載體具有轉(zhuǎn)染效率高，用量少，可持續(xù)、高效、穩(wěn)定、特異地抑制肝細(xì)胞CYP2E1基因表達(dá)的優(yōu)點，可作為有力工具應(yīng)用于制備治療CYP2E1基因表達(dá)異常相關(guān)疾病的藥物。
文檔編號C12N15/66GK102703507SQ20121015550
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者彭朝瓊, 徐新云, 毛吉炎, 程錦泉 申請人:深圳市疾病預(yù)防控制中心