專利名稱：基于轉(zhuǎn)座因子的用于檢測(cè)植物基因組多態(tài)性的標(biāo)志物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)植物基因組多態(tài)性的標(biāo)志物及其制備方法。
本申請(qǐng)要求2000年8月2日提交的日本專利申請(qǐng)?zhí)卦?000-234557號(hào)的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)的內(nèi)容已經(jīng)摻入本文。
背景技術(shù)：
遺傳的多態(tài)性同一物種中不同正常個(gè)體之間某些性狀或形態(tài)存在的多樣性稱為“多態(tài)性(polymorphism)”。特別是，由于遺傳差異導(dǎo)致的多態(tài)性稱為“遺傳多態(tài)性(genetic polymorphism)”。已有證據(jù)表明，天然種群攜帶眾多遺傳變異，如涉及染色體結(jié)構(gòu)和功能的、能通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)方法檢測(cè)的多態(tài)性，和涉及特定基因座的等位基因的多態(tài)性(生化學(xué)辭典，第3版，第835頁(yè)，1998年10月8日發(fā)行，株式會(huì)社東京化學(xué)同人)。
遺傳多態(tài)性的一個(gè)典型例子可見(jiàn)于異色瓢蟲(chóng)(Harmonia axyridis)的鞘翅斑中，它包括至少4個(gè)等位基因。物種中以倒位或其它染色體異常為特征的染色體多態(tài)性(chromosome polymorphism)在果蠅(Drosophila)的不同種屬內(nèi)得到深入研究。在各種染色體多態(tài)性中，“DNA多態(tài)性(DNApolymorphism)”是指在一個(gè)氨基酸位點(diǎn)或核苷酸位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的變異(巖波生物學(xué)辭典，第4版，第81頁(yè)，1996年3月21日發(fā)行，株式會(huì)社巖波書(shū)店)。
目前已在植物基因組中檢測(cè)出多種DNA多態(tài)性(例如，水稻、小麥、玉米等單子葉植物；擬南芥(Arabidopsis)和煙草等雙子葉植物；梨樹(shù)(pearwood)和日本雪松(Japanese cedar)等木本植物)。例如，利用基于DNA多態(tài)性的一種標(biāo)志物制備了水稻的連鎖圖譜，并將其用于遺傳分析或育種篩選(Harushima等，Genetics 148pp.479-494，January 1998)。
檢測(cè)DNA多態(tài)性的常規(guī)方法包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)；通過(guò)測(cè)序進(jìn)行的直接方法；或涉及用一種識(shí)別8-堿基的限制酶進(jìn)行切割，然后對(duì)末端進(jìn)行放射性標(biāo)記，用識(shí)別6-堿基和4-堿基的限制被切割并通過(guò)雙向電泳顯影的方法(RLGS限制性地標(biāo)基因組掃描(Restriction LandmarkGenome Scanning))。AFLP(擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度多態(tài)性P.Vos等，Nucleic AcidsRes.，Vol.23，pp.4407-4414(1995))分析也可以用于通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增/檢測(cè)RFLP。但每種方法都存在問(wèn)題，需要另一種能更有效檢測(cè)多態(tài)性的方法。
更具體地，常規(guī)方法依賴于通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)RFLP(將RFLP標(biāo)志物轉(zhuǎn)換成PCR標(biāo)志物)或依賴于通過(guò)PCR檢測(cè)微衛(wèi)星中的多態(tài)性(微衛(wèi)星標(biāo)志物)，例如以下所述。
(1)將RFLP標(biāo)志物轉(zhuǎn)換成PCR標(biāo)志物A.基于基因組區(qū)域多態(tài)性的PCR標(biāo)志物對(duì)應(yīng)于RFLP探針(D.E.Harry，B.Temesgen，D.B.Neale；Codominant PCR-based markers for Pinus taedadeveloped from mapped cDNA clones，Theor.Appl.Genet.(1998)97pp.327-336)。
針對(duì)RFLP標(biāo)志物探針序列設(shè)計(jì)引物，(“RFLP”是用DNA片段作為探針通過(guò)Southern分析觀察到的一種多態(tài)性。用作探針的DNA片段的核苷酸序列稱為“RFLP標(biāo)志物探針序列”)，用該引物進(jìn)行基因組PCR后，可以通過(guò)以下兩種方法中的任一種獲得PCR標(biāo)志物。第一種方法涉及用一系列限制酶處理產(chǎn)物，以便找出一種導(dǎo)致片段長(zhǎng)度多態(tài)性的限制酶，第二種方法設(shè)計(jì)通過(guò)對(duì)產(chǎn)物的核苷酸序列進(jìn)行種間比較，從而找出多態(tài)性，并在此多態(tài)性基礎(chǔ)上獲得PCR標(biāo)志物。
但這種方法的問(wèn)題是品種間多態(tài)性頻率較低，以至于當(dāng)比較約1000bp的PCR產(chǎn)物時(shí)，不僅不能獲得RFLP，而且在很多情況下，即使在核苷酸序列水平上也不能發(fā)現(xiàn)品種間多態(tài)性。針對(duì)較長(zhǎng)區(qū)域的比較是可能的，但工作量更大。
B.基于對(duì)導(dǎo)致RFLP的位點(diǎn)的鑒定的PCR標(biāo)志物可通過(guò)鑒定RFLP標(biāo)志物探針序列中及其附近(通過(guò)在數(shù)千堿基以內(nèi))的導(dǎo)致RFLP的位點(diǎn)(參與比較的兩個(gè)品種中，僅由其中一種攜帶的限制酶識(shí)別位點(diǎn))來(lái)獲得PCR標(biāo)志物。
但這種方法的問(wèn)題是耗時(shí)又耗力，因?yàn)橐b定導(dǎo)致RFLP的位點(diǎn)，必需對(duì)包含對(duì)應(yīng)于RFLP標(biāo)志物探針的基因組區(qū)域及其附近區(qū)域的基因組克隆進(jìn)行分離/分析。具體地，需要進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，包括篩選基因組文庫(kù)(雜交)，擴(kuò)增并分離陽(yáng)性克隆，制備所分離的克隆的限制酶譜，鑒定導(dǎo)致多態(tài)性的限制性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合適的引物并鑒定多態(tài)性，即使每一步進(jìn)展順利，大概也需要一個(gè)月才能完成。
(2)微衛(wèi)星標(biāo)志物微衛(wèi)星是大量出現(xiàn)在基因組中的約2-4個(gè)核苷酸的重復(fù)序列，如(CA)n。如果存在重復(fù)數(shù)量的品種間多態(tài)性，可以用設(shè)計(jì)在鄰接區(qū)域中的引物通過(guò)PCR觀察到PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的多態(tài)性，從而檢測(cè)出DNA多態(tài)性。用于通過(guò)微衛(wèi)星檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物稱為微衛(wèi)星標(biāo)志物(O.Parnaud，X.Chen，S.R.McCouch，Development of microsatellite markers和characterization ofsimple sequence length polymorphism(SSLP)in rice(Oryza sativa L.)，Mol.Gen.Genet.(1996)252pp.597-607)。
但這種方法的問(wèn)題是隨機(jī)選擇的微衛(wèi)星通常不能顯示多態(tài)性。而且，僅僅在分析了丙烯酰胺凝膠后才能利用眾多微衛(wèi)星標(biāo)志物清楚觀察到多態(tài)性，而所述凝膠分析比常規(guī)的瓊脂糖凝膠分析復(fù)雜得多。
如上所述，用于檢測(cè)DNA多態(tài)性的各種方法都進(jìn)行了研究，但仍然需要更有效檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物和方法。
轉(zhuǎn)座因子“轉(zhuǎn)座因子”是“可轉(zhuǎn)座的遺傳元件”、“移動(dòng)性遺傳元件”或“移動(dòng)元件”的同義詞，是指具有特定結(jié)構(gòu)、可以在DNA上從一個(gè)位點(diǎn)轉(zhuǎn)座至另一個(gè)位點(diǎn)的DNA單元。它的兩側(cè)通常都是約10-50個(gè)堿基對(duì)的反向序列，而且它一般在內(nèi)部包含編碼轉(zhuǎn)座酶(即，識(shí)別上述末端反向序列以便控制轉(zhuǎn)座反應(yīng)的酶)的序列。它可以通過(guò)轉(zhuǎn)座反應(yīng)來(lái)介導(dǎo)基因組重排，從而僅僅通過(guò)插入或切出，或者通過(guò)缺失、倒位、重復(fù)和重復(fù)子融合，使基因失活或改變基因結(jié)構(gòu)。
玉米遺傳系統(tǒng)中轉(zhuǎn)座因子的存在已由B.McClintock證實(shí)。原核生物中的實(shí)例包括插入序列(IS)、攜帶抗生素抗性基因等的轉(zhuǎn)座子(Tn)、以及溶原性噬菌體如Mu。真核生物中眾所周知的實(shí)例是玉米中的Ac和Spm，金魚(yú)草(Antirrhinum majus)中的Tam，果蠅中的P元件，以及線蟲(chóng)中的Tc1。
通過(guò)轉(zhuǎn)座進(jìn)行的重組反應(yīng)以靶位點(diǎn)處數(shù)個(gè)堿基對(duì)的序列的重復(fù)為特征，這也可見(jiàn)于真核生物中，逆轉(zhuǎn)錄病毒/逆(反)轉(zhuǎn)座子RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA通過(guò)整合酶(IN蛋白)的作用而整合的事件中。因此，這些元件也包括在廣義上的轉(zhuǎn)座因子中。基于諸如轉(zhuǎn)座子等轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座能力作為標(biāo)記進(jìn)行的基因工程技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于多種生物系統(tǒng)(巖波生物學(xué)辭典第4版，第966-967頁(yè)，1996年3月21日由株式會(huì)社巖波書(shū)店發(fā)行)。
(1)轉(zhuǎn)座子廣義上的轉(zhuǎn)座因子，或者尤其是在原核生物染色體或質(zhì)粒上攜帶標(biāo)志物基因如抗藥基因的那些，都稱為“轉(zhuǎn)座子”(Iwanami′s Dictionary of Biology，4th Edition，p.1011，同上)。
根據(jù)標(biāo)志物的來(lái)源或類型可以將轉(zhuǎn)座子分為T(mén)n1，Tn2，Tn3...。根據(jù)結(jié)構(gòu)特征可以將它們分為兩翼為插入序列或相關(guān)序列的那些，以及側(cè)翼僅為反向重復(fù)序列的那些。前者的實(shí)例包括Tn5和Tn9，后者的實(shí)例包括Tn3。Tn5約5.8千個(gè)堿基對(duì)(bp)長(zhǎng)，兩端含有互為反向的1533bp插入序列(IS50)，內(nèi)部含有卡那霉素抗性基因。Tn9在兩端含有同向的插入序列(IS1)，內(nèi)部含有氯霉素抗性基因。這些Tn都帶有轉(zhuǎn)座酶，這是一種使它們自身的插入序列轉(zhuǎn)座所必需的酶。Tn3與這些轉(zhuǎn)座子的區(qū)別在于，它的每一端都是38bp的反向重復(fù)序列，內(nèi)部是編碼其自身轉(zhuǎn)座酶的序列以及氨芐青霉素抗性基因。
一般認(rèn)為，一旦轉(zhuǎn)座因子插入DNA，這種插入所針對(duì)的核苷酸序列在該轉(zhuǎn)座因子以外重復(fù)，所重復(fù)的核苷酸數(shù)目(通常約3-12個(gè)堿基對(duì))取決于轉(zhuǎn)座酶的類型。這種靶位點(diǎn)的重復(fù)是轉(zhuǎn)座因子整合的特征。
術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)座子”有時(shí)泛指廣義上的轉(zhuǎn)座因子，包括下述真核生物中的逆轉(zhuǎn)座子。
(2)逆轉(zhuǎn)座子將基因組中某一位點(diǎn)上的信息(DNA)轉(zhuǎn)錄為RNA，然后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶的作用轉(zhuǎn)為互補(bǔ)DNA，并重新插入基因組中另一位點(diǎn)，這樣的DNA統(tǒng)稱為“逆轉(zhuǎn)座子”。相反，以DNA的形式轉(zhuǎn)座而無(wú)任何中間形式的DNA稱為狹義的“轉(zhuǎn)座子”。大多數(shù)散在的重復(fù)序列都是逆轉(zhuǎn)座子(巖波生物學(xué)辭典第4版，第1500頁(yè)，同上)。
逆轉(zhuǎn)座子主要可分為以下兩大類(1)病毒型包括逆轉(zhuǎn)錄病毒和由其自身編碼逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄子(如果蠅中的Copia元件，酵母中的Ty元件和人體中的L1元件)。除了逆轉(zhuǎn)錄病毒以外的其它病毒家族中的逆轉(zhuǎn)錄子統(tǒng)稱為逆轉(zhuǎn)座子，它們的轉(zhuǎn)座事件稱為逆轉(zhuǎn)座。
(2)非病毒型包括由編碼蛋白的基因經(jīng)RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄得到mRNA、再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的假基因，核內(nèi)小分子RNA的假基因，以及由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄的統(tǒng)稱為SINE的散布重復(fù)序列。SINE包括人類基因組中的Alu家族和眾多衍生自tRNA的其它已知實(shí)例(P.L.Deininger(1989)，SINEsShort interspersed repeated DNA elements in higher eukaryotes.InMobile DNA(eds.D.E.Berg和M.M.Howe)，pp.619-636 American Society forMicrobiology，Washington，D.C.)。狹義而言，有時(shí)僅非病毒家族的逆轉(zhuǎn)錄子稱為逆轉(zhuǎn)錄子。一般認(rèn)為逆轉(zhuǎn)錄子是不具有功能的寄生元件，但在極少數(shù)情況中，逆轉(zhuǎn)錄子獲得功能，或者通過(guò)逆轉(zhuǎn)座產(chǎn)生新的基因。
另有報(bào)道稱植物中存在多種轉(zhuǎn)座因子。在此根據(jù)日本人大坪的分類法，將植物轉(zhuǎn)座因子分為I類和II類(Cell Technology，Supplementary Volume，Plant Cell Technology Series 5，Plant Genome Science，pp.102-113，publishedon October 1，1996 by Shujunsha Co.Ltd.)。I類由通過(guò)RNA中間體轉(zhuǎn)座的逆轉(zhuǎn)錄子組成，包括逆轉(zhuǎn)座子、LINE和SINE。II類由以DNA形式轉(zhuǎn)座但不形成任何中間體的轉(zhuǎn)座子組成，包括Ac/Ds、En/Spm和Mu。最近從植物基因組中發(fā)現(xiàn)的稱為MITE(微小反向重復(fù)轉(zhuǎn)座因子)的新轉(zhuǎn)座子為方便起見(jiàn)，也歸類在II類中，但它們的轉(zhuǎn)座機(jī)制尚不明了。
MITE的結(jié)構(gòu)特征在于，它們相對(duì)較短(至多約400bp)、不編碼任何基因、每一末端都有反向重復(fù)序列、可能具有DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、以及每種MITE元件具有特異性的靶序列(S.R.Wessler等，Current Opinion in Genetics& Development 1995，Vol.5，pp.814-821)。據(jù)推測(cè)，每種MITE元件在整個(gè)植物基因組中大量出現(xiàn)。例如，屬于Stowaway的Tnrl在水稻基因組中有大約3500個(gè)拷貝(T.Tenzen等，Mol Gen Genet(1994)Vol.245pp.441-448)。屬于Tourist的B2和Hbr元件在玉米中分別約有至少10,000個(gè)拷貝(S.R.Wessler等，Current Opinion in Genetics & Development 1995，Vol.5，pp.814-821)。
植物轉(zhuǎn)座因子可見(jiàn)于水稻，玉米，煙草等。特別是在水稻中，已知的逆轉(zhuǎn)座子有Tos(H.Hirochika等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)Vol.93，pp.7783-7788)，RIRE1(K.Noma等，Genes Genet.Syst.(1997)Vol.72PP.131-140)，RIRE2(H.Ohtsubo等，Genes Genet.Syst.(1999)Vol.74 pp.83-91)，以及SINE如p-SINE1(K.Mochizuki等，Jpn.J.Genet.(1992)57，pp.155-166)。在II類中，已知有屬于En/Spm的Tnr3(R.Motohashi等，Mol GenGenet(1996)Vol.250，pp.148-152)和MITE。最近，W.-Y.Song等人(Mol GenGenet(1998)Vol.258449-456)發(fā)現(xiàn)了新的II類元件，如Krispie，Snap，Crackle，Pop和Truncator。
已知的MITE包括Gaijin，Castaway，Ditto，Wanderer和Explorer(T.Bureau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.93，PP.8524-8529，August 1996)，Tourist(T.E.Bureau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)Vol.91，pp.1411-1415)，Stowaway(T.E.Bureau等，The Plant Cell(1994)Vol.6，pp.907-916)，Amy/LTP(N.Huang等，Gene(1992)Vol.111，pp.223-228，F(xiàn).Vignols等，Gene(1994)Vol.142，pp.265-270，T.Bureau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.93，pp.8524-8529，August 1996)，Tnr2(K.Mochizuki等，Jpn.J.Genet.(1993)Vol.68，pp.205-217)等。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)座因子不限于上述所列已知轉(zhuǎn)座因子。
上文中提到的K.Mochizuki等，Jpn.J.Genet.(1992)57，pp.155-166的文章指出，在p-SINEL1，重復(fù)序列比單一序列更容易發(fā)生突變堿基的取代。但是，他們既沒(méi)有具體討論轉(zhuǎn)座因子與多態(tài)性之間的聯(lián)系，也沒(méi)有提到轉(zhuǎn)座因子可作為檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物來(lái)應(yīng)用。
發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明的目的是提供制備用于檢測(cè)植物基因組多態(tài)性的標(biāo)志物的方法。本發(fā)明的方法的特征為，包括利用植物基因組中轉(zhuǎn)座因子和/或其鄰接區(qū)域的堿基序列制備用于核酸擴(kuò)增的引物。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括i)基于目標(biāo)植物的基因組中轉(zhuǎn)座因子和/或其鄰接區(qū)域的堿基序列制備一對(duì)引物，用于擴(kuò)增上述轉(zhuǎn)座因子，或該轉(zhuǎn)座因子及其鄰接區(qū)域；ii)以目標(biāo)植物基因組DNA為模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；和iii)基于在上述核酸擴(kuò)增產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的多肽性，制備檢測(cè)植物基因組多態(tài)性的標(biāo)志物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種以本發(fā)明的方法制備的檢測(cè)植物基因組多態(tài)性的標(biāo)志物。


圖1顯示用于擴(kuò)增Gaijin區(qū)的引物序列。
圖2顯示Gaijin 1區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示Gaijin-Os1序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。
圖3顯示Gaijin 2區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示Gaijin-Os2序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。雙下劃線指示用于制備PCR標(biāo)志物的多態(tài)性。
圖4顯示Gaijin 3區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示Gaijin-Os3序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。雙下劃線指示用于制備PCR標(biāo)志物的多態(tài)性。
圖5顯示作為檢測(cè)Gaijin區(qū)中多態(tài)性的(PCR)標(biāo)志物的引物序列。
圖6顯示用于擴(kuò)增Wanderer區(qū)的引物序列。
圖7顯示W(wǎng)anderer 1區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示W(wǎng)anderer-Os1序列及其鄰接序列。空格指示不同于Asominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。雙下劃線指示用于制備PCR標(biāo)志物的多態(tài)性。
圖8顯示W(wǎng)anderer 2區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示W(wǎng)anderer-Os2序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。
圖9顯示W(wǎng)anderer 3區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示W(wǎng)anderer-Os3序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。雙下劃線指示用于制備PCR標(biāo)志物的多態(tài)性。
圖10顯示W(wǎng)anderer 4區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示W(wǎng)anderer-Os4序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。雙下劃線指示用于制備PCR標(biāo)志物的多態(tài)性。
圖11顯示作為檢測(cè)Wanderer區(qū)中多態(tài)性的(PCR)標(biāo)志物的引物序列。
圖12顯示用于擴(kuò)增Castaway區(qū)的引物序列。
圖13顯示Castaway 1區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示Castaway-Os1序列及其鄰接序列。空格指示不同于Asominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。雙下劃線指示用于制備PCR標(biāo)志物的多態(tài)性。
圖14顯示Castaway 2區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示W(wǎng)anderer-Os2序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。雙下劃線指示用于制備PCR標(biāo)志物的多態(tài)性。其后的大寫(xiě)字母指示另一轉(zhuǎn)座因子Explorer-Os2。
圖15顯示作為檢測(cè)Castaway區(qū)中多態(tài)性所用的(PCR)標(biāo)志物的引物序列。
圖16顯示用于擴(kuò)增Diito區(qū)的引物序列。
圖17顯示Ditto 1區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示Ditto-Os1序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。雙下劃線指示用于制備PCR標(biāo)志物的多態(tài)性。其后的大寫(xiě)字母指示另一轉(zhuǎn)座因子Explorer-Os1。
圖18顯示Ditto 2區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示Ditto-Os2序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。
圖19顯示p-SINE-r1區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示p-SINE-r1序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。單下劃線指示正向重復(fù)序列。
圖20顯示p-SINE-r2區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示p-SINE-r2序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。單下劃線指示正向重復(fù)序列。
圖21顯示p-SINE-r3區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示p-SINE-r3序列及其鄰接序列。單下劃線指示正向重復(fù)序列。
圖22顯示p-SINE-r4區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示p-SINE-r4序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。單下劃線指示正向重復(fù)序列。雙下劃線指示用于制備PCR標(biāo)志物的多態(tài)性。
圖23顯示p-SINE-r5區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示p-SINE-r5序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。單下劃線指示正向重復(fù)序列。雙下劃線指示用于制備PCR標(biāo)志物的多態(tài)性。
圖24顯示p-SINE-r6區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示p-SINE-r6序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。單下劃線指示正向重復(fù)序列。
圖25顯示p-SINE-r7區(qū)核苷酸序列的種間比較。大寫(xiě)字母和小寫(xiě)字母分別指示p-SINE-r7序列及其鄰接序列?？崭裰甘静煌贏sominori序列的多態(tài)性位點(diǎn)。單下劃線指示正向重復(fù)序列。雙下劃線指示用于制備PCR標(biāo)志物的多態(tài)性。
圖26顯示作為檢測(cè)p-SINE區(qū)中多態(tài)性的(PCR)標(biāo)志物的引物序列。
發(fā)明詳述為解決上述問(wèn)題，我們進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在植物基因組的轉(zhuǎn)座因子中或其附近以(極高)頻率出現(xiàn)遺傳多態(tài)性，基于這一點(diǎn)完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及制備用于檢測(cè)植物基因組多態(tài)性的標(biāo)志物的方法，其特征為，該方法包括利用植物基因組轉(zhuǎn)座因子和/或其鄰接區(qū)域的堿基序列制備核酸擴(kuò)增的引物。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法包括i)基于目標(biāo)植物基因組中轉(zhuǎn)座因子和/或其鄰接區(qū)域的堿基序列制備一對(duì)引物，用來(lái)擴(kuò)增上述轉(zhuǎn)座因子，或該轉(zhuǎn)座因子及其鄰接區(qū)域；ii)以目標(biāo)植物基因組DNA為模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；和iii)基于在上述核酸擴(kuò)增產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性，制備用于檢測(cè)植物基因組多態(tài)性的標(biāo)志物。
本發(fā)明的目標(biāo)植物種類沒(méi)有特別的限定，但優(yōu)選單子葉植物如水稻，玉米和大麥。特別優(yōu)選水稻。
轉(zhuǎn)座因子在本發(fā)明制備用于檢測(cè)植物基因組DNA多態(tài)性的標(biāo)志物的方法中，首先根據(jù)已知轉(zhuǎn)座因子的序列信息，通過(guò)對(duì)基因庫(kù)進(jìn)行Southern雜交篩選和測(cè)序或在數(shù)據(jù)庫(kù)中查找，而確定了目標(biāo)植物基因組的轉(zhuǎn)座因子及其鄰接區(qū)域的核苷酸序列。
轉(zhuǎn)座因子通過(guò)生物進(jìn)化過(guò)程的多次轉(zhuǎn)座而增加了拷貝數(shù)，而核苷酸序列的變異在每個(gè)拷貝的內(nèi)部序列中積累。因此，具有高度同源的核苷酸序列的轉(zhuǎn)座因子可被認(rèn)為是同源的，甚至那些同源性較低的轉(zhuǎn)座因子只要具有同類轉(zhuǎn)座因子的特征，也被認(rèn)為是同源的。例如，MITE的特征在于末端反向序列，目標(biāo)序列，假定的二級(jí)結(jié)構(gòu)和全長(zhǎng)等(T.E.Bureau等，The PlantCell，Vol.6，907-916 1994，T.E.Bureau等，Proc.Natl.Acad，Sci.USA Vol.91，pp.1411-1415，1994)。
植物基因組文庫(kù)可以通過(guò)已知方法制備，例如參見(jiàn)Maniatis，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，2nd Edition，1989?；蛘撸少?gòu)買(mǎi)植物基因組文庫(kù)商品(例如，CLONTECH的水水稻基因組文庫(kù)，STRATAGENE的玉米基因組文庫(kù)，等)。
多種植物基因組序列和轉(zhuǎn)座因子序列已被登記在數(shù)據(jù)庫(kù)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)在這些數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，來(lái)尋找/選擇可用于檢測(cè)多態(tài)性的轉(zhuǎn)座因子?？捎玫臄?shù)據(jù)庫(kù)包括，但不限于，GenBank，EMBL等。
本文中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的那樣，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)座因子”是指具有特定結(jié)構(gòu)、能在DNA上從一個(gè)座位轉(zhuǎn)位至另一座位的DNA單元。因此，“轉(zhuǎn)座因子”還包括經(jīng)由RNA中間體轉(zhuǎn)座的逆轉(zhuǎn)錄子如逆轉(zhuǎn)座子，LINE，SINE；以DNA形式轉(zhuǎn)座、不形成任何中間體的轉(zhuǎn)座子；和，最近發(fā)現(xiàn)的、稱為MITE(微小反向重復(fù)轉(zhuǎn)座因子)的新的植物轉(zhuǎn)座子。
本發(fā)明利用植物基因組中的轉(zhuǎn)座因子來(lái)檢測(cè)植物基因組中的多態(tài)性。在眾多植物基因組轉(zhuǎn)座因子中，最便于利用的是那些屬于MITE(微小反向重復(fù)轉(zhuǎn)座因子)或SINE(短型散布狀核元件)的轉(zhuǎn)座因子，因?yàn)樗鼈兊慕Y(jié)構(gòu)相對(duì)較短，但不限于此。
屬于MITE的已知轉(zhuǎn)座因子包括，例如，水稻中的轉(zhuǎn)座因子、Gaijin，Castaway，Ditto，Wanderer，Explorer，Stowaway，Tourist和Tnr2等。在下述實(shí)施例中，針對(duì)Gaijin(Gaijin-Os1，2，3)，Castaway(Castaway-Os1，2)，Ditto(Ditto-1，2)和Wanderer(Wanderer-Os1，2，3，4)的鄰接區(qū)設(shè)計(jì)引物，以水稻品種Asominori，IR24和Kasalath的總DNA為模板，進(jìn)行PCR。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列的種間比較顯示，每種轉(zhuǎn)座因子序列及其鄰接區(qū)以極高頻率出現(xiàn)多態(tài)性。MITE似乎大量存在于整個(gè)水稻基因組中，因此它們可用于產(chǎn)生覆蓋整個(gè)水稻基因組的眾多標(biāo)志物。
這些轉(zhuǎn)座因子中，Castaway也可見(jiàn)于玉米中(T.Bureau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.93，pp.8524-8529，August 1996)，Tourist也可見(jiàn)于玉米、高梁和大麥中(T.E.Bureau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)Vol.91，pp.1411-1415)，Stowaway可見(jiàn)于禾本科植物以及雙子葉植物(T.E.Bureau等，The Plant Cell(1994)Vol.6，pp.907-916)。因此，很容易推測(cè)，MITE不僅在水稻中而且在其它植物中都以極高頻率顯示多態(tài)性。
屬于SINE的已知轉(zhuǎn)座因子包括，例如，水稻中的p-SINE1(K.Mochizukiet al.，同上)。在以下實(shí)施例中，用Mochizuki(1992)等人用于擴(kuò)增p-SINE1序列及其周邊區(qū)域的引物，對(duì)水稻轉(zhuǎn)座因子p-SINE1(p-SINE1-r1，r2，r3，r4，r5，r6和r7)實(shí)施了類似于上述對(duì)MITE的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，不同p-SINE1元件之間的種間多態(tài)性頻率有差異，其中的一些不表現(xiàn)出種間多態(tài)性，但總體上表明，這些區(qū)域比對(duì)應(yīng)于RFLP標(biāo)志物探針的基因組區(qū)域更富有多態(tài)性。
在整個(gè)水稻基因組中有多達(dá)大約4500個(gè)拷貝的p-SINE1(大坪CellTechnology，Supplementary Volume，Plant Cell Technology Series 5，PlantGenome Science，第102-113頁(yè)，1996年10月1日由株式會(huì)社秀潤(rùn)社發(fā)行)，這表明，這些元件可用于制備對(duì)應(yīng)于整個(gè)水稻基因組的多種標(biāo)志物。
根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，SINE也可見(jiàn)于煙草和十字花科植物。因此，推測(cè)SINE不僅在水稻中而且在其它植物中都表現(xiàn)多態(tài)性。
II類中不屬于MITE的轉(zhuǎn)座子包括Ac/Ds，En/Spm和Mu，它們可見(jiàn)于多種植物。例如，在水稻中，已知屬于En/Spm的Tnr3，最近還發(fā)現(xiàn)了諸如Krispie，Snap，Crackle，Pop和Truncator(W.-Y.Song等，Mol Gen Genet(1998)Vol.258449-456)新因子。I類中不屬于SINE的逆轉(zhuǎn)錄子也可見(jiàn)于多種植物中。例如，在水稻中，已知RIRE1和RERE3。它們有時(shí)帶有內(nèi)部基因編碼序列，但在非編碼區(qū)可能富含與MITE和SINE相同的DNA多態(tài)性。由于它們的結(jié)構(gòu)相對(duì)較長(zhǎng)，它們不象MITE那樣便于用來(lái)制備標(biāo)志物，但可以按照下文實(shí)施例2中針對(duì)Wanderer-Os3的方法轉(zhuǎn)變成標(biāo)志物。
正如本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的，種間多態(tài)性的頻率取決于轉(zhuǎn)座因子的類型。因此，通過(guò)適當(dāng)選擇所用的轉(zhuǎn)座因子可以更有效地制備PCR標(biāo)志物。
本文中，對(duì)轉(zhuǎn)座因子的“鄰接區(qū)”無(wú)特別限制，但轉(zhuǎn)座因子區(qū)域的長(zhǎng)度、所用的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的類型等可能不同。在本發(fā)明中，根據(jù)在植物基因組中DNA多態(tài)性頻繁出現(xiàn)在轉(zhuǎn)座因子附近這一事實(shí)，通過(guò)制備必需能擴(kuò)增包含轉(zhuǎn)座因子或同時(shí)包含轉(zhuǎn)座因子及其鄰接區(qū)的核酸的核酸擴(kuò)增引物對(duì)，可以提供用于檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物。因此，優(yōu)選引物對(duì)的間距中適于根據(jù)所用核酸擴(kuò)增反應(yīng)類型擴(kuò)增核酸的長(zhǎng)度之內(nèi)。
本文中，轉(zhuǎn)座因子的“鄰接區(qū)”是指包含轉(zhuǎn)座因子或包含轉(zhuǎn)座因子及其鄰接區(qū)這兩者、處在適于核酸擴(kuò)增的距離之內(nèi)的區(qū)域。包含轉(zhuǎn)座因子及其鄰接區(qū)的區(qū)域優(yōu)選在約50-3000個(gè)堿基的范圍內(nèi)，更優(yōu)選約50-2000個(gè)堿基的范圍內(nèi)，還更優(yōu)選約100-1000個(gè)堿基的范圍內(nèi)，但不限于此。鄰接區(qū)優(yōu)選在轉(zhuǎn)座因子的5′側(cè)或3′側(cè)約0-3000個(gè)堿基的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約0-2000個(gè)堿基的范圍內(nèi)，還更優(yōu)選在約0-1000個(gè)堿基的范圍內(nèi)，但不限于此。
核酸擴(kuò)增本發(fā)明中，優(yōu)選根據(jù)所確定的目標(biāo)植物基因組中轉(zhuǎn)座因子及其鄰接區(qū)的核苷酸序列，制備用于擴(kuò)增所述轉(zhuǎn)座因子或轉(zhuǎn)座因子及其鄰接區(qū)的引物對(duì)。然后，以所述目標(biāo)植物的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)進(jìn)行核酸擴(kuò)增。
核酸擴(kuò)增反應(yīng)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(Saiki等，1985，Science 230，pp.1350-1354)。
可以根據(jù)轉(zhuǎn)座因子及其鄰接區(qū)的核苷酸序列，用任何已知方法制備用于核酸擴(kuò)增的引物對(duì)。具體地，可基于轉(zhuǎn)座因子和/或其鄰接區(qū)的堿基序列，用以下舉例的方法制備引物對(duì)，包括制備單鏈DNA，使其具有與轉(zhuǎn)座因子或其鄰接區(qū)的核苷酸序列相同或互補(bǔ)的核苷酸序列，必要時(shí)，包括制備包含修飾的單鏈DNA，所述修飾不影響轉(zhuǎn)座因子或其鄰接區(qū)的核苷酸序列的結(jié)合特異性，只要符合下列條件1)每一引物長(zhǎng)15-30個(gè)堿基；2)每一引物的堿基序列中G+C含量為30-70％；3)每一引物的堿基序列中，A，T，G和C的分布并非過(guò)度不均勻；4)用所述引物對(duì)擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物長(zhǎng)度為50-3000個(gè)堿基，優(yōu)選100-2000個(gè)堿基；及5)每一引物自身或引物相互間在堿基序列中不包含互補(bǔ)序列。
基因組中不同轉(zhuǎn)座因子的拷貝數(shù)各不相同，但總會(huì)在基因組中出現(xiàn)多個(gè)拷貝數(shù)。設(shè)計(jì)在轉(zhuǎn)座因子內(nèi)的引物對(duì)似乎更易于生成與多態(tài)性無(wú)關(guān)的不想要的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，優(yōu)選將引物對(duì)設(shè)計(jì)在包含多態(tài)性的轉(zhuǎn)座因子的鄰接區(qū)中。
但某些情況下可以將引物設(shè)計(jì)在轉(zhuǎn)座因子區(qū)域中，例如轉(zhuǎn)座因子區(qū)太長(zhǎng)，以致于不能僅僅將引物設(shè)計(jì)在轉(zhuǎn)座因子以外；或者不能有效擴(kuò)增核酸；或者多態(tài)性僅出現(xiàn)在轉(zhuǎn)座因子內(nèi)部；以及多態(tài)性被用于設(shè)計(jì)檢測(cè)該多態(tài)性的錯(cuò)配引物。既便是在這些情況下，也可以根據(jù)需要，利用設(shè)計(jì)在轉(zhuǎn)座因子區(qū)內(nèi)部的引物，通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)來(lái)檢測(cè)多態(tài)性。例如，在實(shí)施例2中Wanderer-Os3的情況中，其中一個(gè)引物(SEQ ID NO42)的靶位點(diǎn)完全由轉(zhuǎn)座因子組成(圖9)，但它可以作為標(biāo)志物應(yīng)用在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，沒(méi)有任何問(wèn)題。
對(duì)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法和條件沒(méi)有特別限制，都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？梢杂杀绢I(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)多種因素來(lái)選擇適當(dāng)?shù)臈l件，這些因素包括轉(zhuǎn)座因子或其鄰接區(qū)的核苷酸序列、引物對(duì)的核苷酸序列和長(zhǎng)度，等。通常，當(dāng)引物對(duì)較長(zhǎng)，或G+C含量較高，或A，T，G和C的分布較均勻，或基因組中轉(zhuǎn)座因子的拷貝數(shù)較多時(shí)，可以在較嚴(yán)格的條件(在較高溫度進(jìn)行退火反應(yīng)和核酸延伸反應(yīng)，并進(jìn)行較少的循環(huán))下進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)。應(yīng)用較嚴(yán)格的條件可以使擴(kuò)增反應(yīng)具有較高特異性。
擴(kuò)增反應(yīng)優(yōu)選，但不限于，包括90-95℃變性30秒-2分鐘，55-65℃退火30秒-2分鐘和70-75℃延伸30秒-2分鐘，共25-40個(gè)循環(huán)，更優(yōu)選94℃變性1分鐘，58℃退火1分鐘和72℃延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)。
制備用于檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物在用引物對(duì)經(jīng)核酸擴(kuò)增反應(yīng)得到擴(kuò)增產(chǎn)物，并檢驗(yàn)出其中是否存在多態(tài)性之后，根據(jù)所發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性制備用于檢測(cè)該多態(tài)性的標(biāo)志物?？梢栽跀U(kuò)增產(chǎn)物中檢測(cè)到的多態(tài)性的非限制性實(shí)例如下。
a)上述核酸擴(kuò)增產(chǎn)物中的多態(tài)性包括帶有缺失區(qū)的類型在這種情況中，制備位于所述缺失區(qū)兩側(cè)的核酸擴(kuò)增引物對(duì)來(lái)制備用于檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物。所述引物對(duì)的制備可以按照上述檢測(cè)多態(tài)性的步驟i)的方法來(lái)進(jìn)行。步驟i)中所用引物對(duì)也可以直接用作檢測(cè)所述多態(tài)性的標(biāo)志物。
如果缺失區(qū)足夠大，可以通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠上電泳的泳動(dòng)性能差異來(lái)檢測(cè)多態(tài)性。如果是瓊脂糖凝膠電泳，當(dāng)堿基對(duì)數(shù)量差異至少為約5％時(shí)，可以檢測(cè)多態(tài)性；如果是聚丙烯酰胺凝膠電泳，當(dāng)長(zhǎng)度差異至少為約1個(gè)堿基時(shí)，可以檢測(cè)多態(tài)性?；蛘?，可以用具有與除該缺失區(qū)以外的核苷酸序列互補(bǔ)的序列的寡核苷酸或DNA片段作為分析探針，通過(guò)其與上述核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的雜交來(lái)檢測(cè)多態(tài)性?；蛘撸梢栽诒匾獣r(shí)，通過(guò)測(cè)定上述擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列來(lái)證實(shí)多態(tài)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要適當(dāng)采用已知用于核酸電泳、雜交、測(cè)序等的技術(shù)。
在這種情況中，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度的差異直接反映多態(tài)性，基于此的多態(tài)性檢測(cè)標(biāo)志物被稱為ALP(擴(kuò)增子長(zhǎng)度多態(tài)性)標(biāo)志物。如實(shí)施例1中的Gaijin-Os1區(qū)，實(shí)施例2中的Wanderer-Os2區(qū)和實(shí)施例4中的Ditto-Os2區(qū)。在這些情況中，步驟i)所采用的擴(kuò)增引物對(duì)直接用作了檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物。
b)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物中的多態(tài)性包括導(dǎo)致限制酶識(shí)別差異的堿基取代在這種情況中，制備位于所述取代位點(diǎn)兩側(cè)的核酸擴(kuò)增引物對(duì)來(lái)制備用于檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物。所述引物對(duì)的制備可以按照上述檢測(cè)多態(tài)性的步驟i)的方法來(lái)進(jìn)行。步驟i)中所用引物對(duì)也可以直接用作檢測(cè)所述多態(tài)性的標(biāo)志物。
在這種情況下，在核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性中出現(xiàn)了導(dǎo)致限制酶識(shí)別差異的堿基取代，即所述核酸擴(kuò)增產(chǎn)物可以或不可以被一或多種特異性限制酶切割。這樣一來(lái)，可以將擴(kuò)增產(chǎn)物用限制酶處理并在瓊脂糖凝膠上電泳，以便根據(jù)泳動(dòng)性的差異來(lái)檢測(cè)多態(tài)性。必要時(shí)，可通過(guò)測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列來(lái)證實(shí)多態(tài)性。
在這種情況下，PCR等方法所得擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性片段長(zhǎng)度的差異可以反映多態(tài)性，基于這一點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)標(biāo)志物被稱為PCR-RFLP(PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)標(biāo)志物或CAPS(切割擴(kuò)增多態(tài)性序列)標(biāo)志物(A.Konieczny，F(xiàn).M.Ausubel，A procedure for mapping Arabidopsis mutations usingco-dominant ecotype-specific PCR-based markers，(1993)，Plant J.4(2)pp.403-410)。如，實(shí)施例1中的Gaijin-Os3區(qū)，實(shí)施例2中的Wanderer-Os1區(qū)和-Os4區(qū)，實(shí)施例3中的Castaway-Os2區(qū)，實(shí)施例4中的Ditto-Os1區(qū)，以及實(shí)施例5中的p-SINE1-r5區(qū)和-r7區(qū)。其中，對(duì)實(shí)施例4的Ditto-Os1區(qū)而言，步驟i)所用擴(kuò)增引物對(duì)被直接用作多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物。
即便可以如以上a)所述，利用核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度來(lái)檢測(cè)多態(tài)性，在某些情況(如實(shí)施例2的Wanderer-Os2區(qū))下，與限制酶處理相結(jié)合更易于檢測(cè)多態(tài)性。
c)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物中的多態(tài)性包括未導(dǎo)致限制酶識(shí)別差異的堿基取代。
在這種情況下，制備錯(cuò)配引入型引物對(duì)用作多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物，所述引物對(duì)包括堿基取代位點(diǎn)，并將核酸擴(kuò)增產(chǎn)物中包含所述堿基取代位點(diǎn)的區(qū)域修飾為導(dǎo)致限制酶識(shí)別差異的堿基序列。
具體地，可以按照上文中檢測(cè)多態(tài)性的步驟i)所述來(lái)制備該引物對(duì)。但是，步驟i)所用的引物對(duì)導(dǎo)致核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性而非限制酶識(shí)別的差異，因此，在兩引物之一或兩者中引入錯(cuò)配，以便將核酸擴(kuò)增產(chǎn)物中包含堿基取代位點(diǎn)(多態(tài)性)的區(qū)域修飾為導(dǎo)致限制酶識(shí)別差異的堿基序列?？梢允褂肕ikaelian等，Nucl.Acids.Res.20376.1992所述方法，作為通過(guò)PCR引入位點(diǎn)特異性突變，從而取代、缺失或添加特定核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。用錯(cuò)配引入型引物對(duì)作為多態(tài)性檢測(cè)標(biāo)志物得到的擴(kuò)增產(chǎn)物可以或者不可以用一或多種特異性限制酶切割，因?yàn)樗腻e(cuò)配引入位點(diǎn)存在限制酶識(shí)別差異。這樣一來(lái)，如上文b)所述，擴(kuò)增產(chǎn)物可以用限制酶處理并在瓊脂糖凝膠上電泳，以便根據(jù)泳動(dòng)性的差異來(lái)檢測(cè)多態(tài)性。
錯(cuò)配的引入必需是，既不影響引物與植物基因組標(biāo)靶的結(jié)合，也不影響多態(tài)性堿基取代。多態(tài)性堿基取代被用來(lái)在其附近引入錯(cuò)配，從而通過(guò)堿基取代和錯(cuò)配的共同作用導(dǎo)致限制酶識(shí)別差異。用于引入這種錯(cuò)配的方法是本領(lǐng)域已知的，例如，可參見(jiàn)Michaels，S.D.和Amasino，R.M.(1998)，Neff，M.M.，Neff，J.D.，Chory，J.和Pepper，A.E.(1998)的詳述。
這種情況中的標(biāo)志物是對(duì)上文b)中所述CAPS標(biāo)志物的改進(jìn)，它們被稱為dCAPS(衍生的CAPS)標(biāo)志物。如，實(shí)施例1中的Gaijin-Os2區(qū)，實(shí)施例2中的Wanderer-Os3區(qū)，實(shí)施例3中的Castaway-Os1區(qū)和實(shí)施例5中的p-SINE1-r4區(qū)。
如果上述b)或c)的情況中，有很多額外的限制性位點(diǎn)與種間多態(tài)性無(wú)關(guān)，可能就難以根據(jù)多態(tài)性來(lái)鑒定限制性位點(diǎn)識(shí)別中的任何差異。這時(shí)，可以視情況不同而在引物中引入錯(cuò)配，從而去掉不必要的限制性位點(diǎn)。例如，在實(shí)施例2的Wanderer-Os3區(qū)域中，在5′-引物中引入錯(cuò)配，從而去掉了與多態(tài)性無(wú)關(guān)的MseI位點(diǎn)。
多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物本發(fā)明還提供了用上述方法制備的檢測(cè)植物基因組中多態(tài)性所用的標(biāo)志物。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以制備廣泛多種檢測(cè)植物基因組多態(tài)性的標(biāo)志物。因此，由本發(fā)明方法制備的標(biāo)志物并無(wú)特別限制。
在以下的非限制性實(shí)例中，水稻的屬于MITE或SINE類的多種轉(zhuǎn)座因子常常出現(xiàn)多態(tài)性。因此利用這些轉(zhuǎn)座因子的水稻多態(tài)性檢測(cè)標(biāo)志物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。具有本文序列表中SEQ ID NOs1-2，16-19，22-23，40-45，48-49，56-57，58-61和95-100的具體序列的引物，經(jīng)證實(shí)可以用作后文實(shí)施例中檢測(cè)水稻多態(tài)性所用的標(biāo)志物，它們也作為例子包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
如上所述，本發(fā)明總體上為利用轉(zhuǎn)座因子有效檢測(cè)多態(tài)性和制備標(biāo)志物提供了可能性。通過(guò)選用特定的轉(zhuǎn)座因子可以更有效地制備PCR標(biāo)志物，因?yàn)榉N間多態(tài)性的頻率取決于轉(zhuǎn)座因子的類型。
用本發(fā)明所得標(biāo)志物檢測(cè)多態(tài)性的方法相比于傳統(tǒng)的多態(tài)性檢測(cè)方法有顯著的優(yōu)勢(shì)。具體地，核苷酸序列中的種間多態(tài)性頻率，比利用基于基因組區(qū)(其對(duì)應(yīng)于RFLP探針)多態(tài)性的標(biāo)志物進(jìn)行PCR所得頻率更高。因此，可以以更高頻率制備標(biāo)志物，而且相應(yīng)地，可以有效制備標(biāo)志物。與基于RFLP引發(fā)位點(diǎn)的鑒定的PCR標(biāo)志物相反，通過(guò)利用數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的多種轉(zhuǎn)座因子，可以省去正如基因組文庫(kù)篩選和所分離的克隆的分析等復(fù)雜步驟。因此，可以通過(guò)大大減少用于開(kāi)發(fā)標(biāo)志物的時(shí)間/勞動(dòng)而有效地制備標(biāo)志物(如果一切順利，需約1周的時(shí)間)。與微衛(wèi)星標(biāo)志物不同的是，可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳而用PCR標(biāo)志物檢測(cè)多態(tài)性，這比聚丙烯酰胺電泳更易于操作，而且核苷酸序列中的種間多態(tài)性頻率較高。如此一來(lái)，可以制備適于在瓊脂糖凝膠上檢測(cè)多態(tài)性的簡(jiǎn)易(easy-to-use)PCR標(biāo)志物，而且由于能夠以更高頻率產(chǎn)生這些標(biāo)志物，使得它們的制備方法更有效。
實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，但不視為對(duì)本發(fā)明技術(shù)范圍的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的描述對(duì)本發(fā)明進(jìn)行改動(dòng)，這些改動(dòng)都包括在本發(fā)明是技術(shù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例1利用Gaijin開(kāi)發(fā)標(biāo)志物材料與方法Gaijin-Os1，2和3是提交到數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中的OS4CL(X52623)，RICCBP3(D10985)和RICAP(D32165)基因中的Gaijin-Os轉(zhuǎn)座因子(Bureau等1996)。
如圖1所示設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增Gaijin-Os序列及其鄰接區(qū)域的引物對(duì)(SEQID NOs1-6)。這些引物對(duì)用于以水稻品種Asominori，Kasalath和IR24的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)(94℃1分鐘，58℃1分鐘和72℃2分鐘，30個(gè)循環(huán))。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用QIAEXII(QIAGEN)回收所需DNA片段。用所回收的DNA為模板，在dRhodamine Terminator CycleSequencing FS Ready Reaction Kit(ABI)上進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，在ABI Model 310上測(cè)出核苷酸序列。
結(jié)果和討論上述品種的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖2-圖4和SEQ ID NOs7-15。圖2(SEQ ID NOs7-9)顯示Gaijin-Os1區(qū)，圖3(SEQ ID NOs10-12)顯示Gaijin-Os2區(qū)，圖4(SEQ ID NOs13-15)顯示Gaijin-Os3區(qū)。在圖2-圖4的每張圖中，5’引物和3’引物的序列都以相同于以下實(shí)施例中各種擴(kuò)增引物對(duì)的方式置于圖2-圖4中所示序列的5’側(cè)和3’側(cè)。
1)Gaijin-Os1區(qū)當(dāng)使用針對(duì)Gaijin-Os1的引物(SEQ ID NOs1和2)時(shí)，在Asominori與Kasalath或IR24之間觀察到PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的多態(tài)性。具體地，Asominori的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為434個(gè)堿基對(duì)(不包括引物區(qū))，Kasalath和IR24的分別為278個(gè)堿基對(duì)和277個(gè)堿基對(duì)，見(jiàn)圖2。這表明，Kasalath和IR24由于不合有Gajjin-Os1，而與Asominori出現(xiàn)多態(tài)性。這種基于PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度差異的多態(tài)性被用作ALP(擴(kuò)增子長(zhǎng)度多態(tài)性)標(biāo)志物。在Asominori-IR24的71例RIL(重組近交系)中為該標(biāo)志物作圖，結(jié)果表明OS4CL(Gaijin-Os1)基因座位于8號(hào)染色體上。
當(dāng)使用針對(duì)Gaijin-Os2和Gaijin-Os3的引物(分別為SEQ ID NOs3-4和5-6)時(shí)，未觀察到PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度中的多態(tài)性，但在核苷酸序列水平上顯示多態(tài)性。比較Gaijin-Os序列與其鄰接區(qū)之間的多態(tài)性頻率，發(fā)現(xiàn)前者有頻率較高的傾向。但是，Gaijin-Os鄰接區(qū)中的多態(tài)性頻率傾向于比對(duì)應(yīng)于常規(guī)RFLP標(biāo)志物的基因組序列中的更高，這提示轉(zhuǎn)座因子的鄰接區(qū)可能存在多處種間差異。
2)Gaijin-Os2區(qū)在Gaijin-Os2區(qū)的情況中，基于Asominori與Kasalath或IR24之間的多態(tài)性，用dCAPS(衍生的切割擴(kuò)增多態(tài)性序列)方法(Michaels和Amasino1998；Neff等1998)制備多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物。
具體地，Asominori的Gaijin-Os2區(qū)中第136位核苷酸是″C″，而Kasalath和IR24的相應(yīng)位點(diǎn)上是″T″，參見(jiàn)圖3(除非特別說(shuō)明，本實(shí)施例中以下所稱核苷酸編號(hào)是指Asominori中的編號(hào))。據(jù)此制備圖5A所示的引物(SEQ IDNOs16和17)作為多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物，來(lái)進(jìn)行PCR(PCR條件為94℃30秒，58℃30秒和72℃30秒，共35循環(huán))。SEQ ID NOs16和17的序列分別對(duì)應(yīng)于圖3所示Asominori序列(SEQ ID NO10)中的核苷酸編號(hào)負(fù)10-16和138-161，但3’引物(其具有核苷酸序列SEQ ID NO17)被設(shè)計(jì)成將第143-144位的核苷酸″ta″取代為″gt″。當(dāng)用這種多態(tài)性檢測(cè)標(biāo)志物作為引物時(shí)，擴(kuò)增得到圖3中負(fù)10-161的序列(SEQ ID NOs10-12)，但3’-引物所致取代僅在Asominori中得到序列″CACNNNNGTG″，在Kasalath和IR24中得到序列″TACNNNNGTG″。序列″CACNNNNGTG″由限制酶MslI識(shí)別。因此，當(dāng)用這種酶處理擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，僅Asominori的Gaijin-Os2區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物被切割，Kasalath和IR24的擴(kuò)增產(chǎn)物不被切割。這一點(diǎn)可以用來(lái)檢測(cè)多態(tài)性。
3)Gaijin-Os3區(qū)在Gaijin-Os3區(qū)的情況中，用常規(guī)CAPS方法制備了多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物。具體是，Asominori的Gaijin-Os3區(qū)的第355-358位核苷酸是″TTAA″，而Kasalath和IR24的相應(yīng)位點(diǎn)上是″TCAA″，見(jiàn)圖4。據(jù)此制備圖5B所示的引物(SEQ ID NOs18和19)作為檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物來(lái)進(jìn)行PCR(PCR條件為94℃30秒，58℃30秒和72℃30秒，共35循環(huán))。SEQ ID NOs18和19的序列分別對(duì)應(yīng)于圖4所示Asominori序列(SEQ ID NO13)中的核苷酸編號(hào)212-235和416-439，這種多態(tài)性檢測(cè)標(biāo)志物被用作引物，以便擴(kuò)增圖4中212-439的序列(SEQ ID NOs13-15)。Asominori中第355-358位的序列″TTAA″由限制酶MseI識(shí)別。對(duì)應(yīng)于Asominori中第401-404位的核苷酸的序列在所有Asominori，Kasalath和IR24中都是″TTAA″。因此，當(dāng)用這種酶處理擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，Asominori的Gaijin-Os3區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物在兩處位點(diǎn)被切割(355-358和401-404)，Kasalath和IR24的擴(kuò)增產(chǎn)物僅在一個(gè)位點(diǎn)被切割(401-404)。
在Asominori-IR24的71例RIL(重組近交系)中作圖，結(jié)果表明RICCBP3(Gaijin-Os2)基因座和RICAP(Gaijin-Os3)基因座分別位于2號(hào)和5號(hào)染色體上。
實(shí)施例2利用Wanderer開(kāi)發(fā)標(biāo)志物材料與方法Wanderer-Os 1，2，3和4是提交到數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中的RIC3H3M(L28995)，RIC3H3M(L28995)，RICGLUTE(D00584)和OSALAM(X16509，S50948)基因中的Wanderer-Os轉(zhuǎn)座因子(Bureau等1996)。
如圖6所示設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增Wanderer-Os序列及其鄰接區(qū)域的引物對(duì)(SEQ ID NOs20-27)。這些引物對(duì)用于以Asominori，Kasalath和IR24的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，按照實(shí)施例1對(duì)Gaijin區(qū)的方式測(cè)定核苷酸序列。
結(jié)果和討論上述品種的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖7-圖10和SEQ IDNOs28-39。圖7(SEQ ID NOs28-30)顯示W(wǎng)anderer-Os1區(qū)，圖8(SEQ IDNOs31-33)顯示W(wǎng)anderer-Os2區(qū)，圖9(SEQ ID NOs34-36)顯示W(wǎng)anderer-Os3區(qū)，圖10(SEQ ID NOs37-39)顯示W(wǎng)anderer-Os4區(qū)。
1)Wandere-Os2區(qū)當(dāng)使用針對(duì)Wanderer-Os2的引物時(shí)，在Asominori與Kasalath或IR24之間觀察到PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的多態(tài)性。具體地，Asominori的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為320個(gè)堿基對(duì)(不包括引物區(qū))，Kasalath和IR24的分別為298個(gè)堿基對(duì)和297個(gè)堿基對(duì)，見(jiàn)圖8。這表明，由于Kasalath和IR24缺失Wanderer-Os2的一部分而產(chǎn)生了多態(tài)性。
在Wanderer-Os2的情況中，僅通過(guò)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的差異就能檢測(cè)多態(tài)性，但可以通過(guò)與限制酶處理(CAPS)相結(jié)合，使多態(tài)性的檢測(cè)更便利。具體地，Kasalath的第114-199位核苷酸的序列以及IR24的第113-118位相關(guān)序列是″TTTAAA″，它可以被限制酶DraI切割。但Asominori的相關(guān)序列(第136-141位核苷酸)是″TGAAAA″，它不能被DraI切割。因此，用DraI處理Wanderer-Os2區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物，僅Kasalath和IR24的擴(kuò)增產(chǎn)物可被切割，Asominori的擴(kuò)增產(chǎn)物不被切割。
這種基于Wanderer-Os2的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度差異的多態(tài)性可以用作ALP標(biāo)志物。在Asominori-IR24的71例RIL中為該標(biāo)志物作圖，結(jié)果表明RIC3H3M(Wandere-Os2)基因座位于2號(hào)染色體上。
當(dāng)使用針對(duì)Wanderer-Os1，Wanderer-Os3和Wanderer-Os4的引物時(shí)，未觀察到PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度中的多態(tài)性，但在核苷酸序列水平上顯示多態(tài)性。比較Wanderer-Os序列與其鄰接區(qū)之間的多態(tài)性頻率，發(fā)現(xiàn)前者有頻率較高的傾向。但是，即使在Wanderer-Os鄰接區(qū)中的多態(tài)性頻率也傾向于比對(duì)應(yīng)于常規(guī)RFLP標(biāo)志物的基因組序列中的更高，這提示轉(zhuǎn)座因子的鄰接區(qū)可能存在多處種間差異。
2)Wanderer-Os1區(qū)在Wanderer-Os1區(qū)的情況中，用常規(guī)CAPS方法制備了多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物。具體是，Asominori的Wanderer-Os1區(qū)的第226-231位核苷酸是″TTTAAA″，而Kasalath和IR24的相應(yīng)位點(diǎn)上是″TTCAAA″，見(jiàn)圖7。據(jù)此制備圖11A所示的引物(SEQ ID NOs40和41)作為檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物，按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行PCR。SEQ ID NOs40和41的序列分別對(duì)應(yīng)于圖7所示Asominori序列(SEQ ID NO28)中的核苷酸編號(hào)42-65和300-323，這種多態(tài)性檢測(cè)標(biāo)志物被用作引物，以便擴(kuò)增圖7中42-323的序列(SEQ IDNOs28-30)。Asominori中第226-231位的序列″TTTAAA″由限制酶DraI識(shí)別。對(duì)應(yīng)于Asominori中第197-202位核苷酸的序列在所有Asominori，Kasalath和IR24中都是″TTTAAA″。因此，當(dāng)用這種限制酶處理擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，Asominori的Wanderer-Os1區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物在兩處位點(diǎn)被切割(226-231和197-202)，Kasalath和IR24的擴(kuò)增產(chǎn)物僅在一個(gè)位點(diǎn)被切割(197-202)。
3)Wanderer-Os3區(qū)在Wanderer-Os3區(qū)的情況中，用dCAPS方法，按照對(duì)Gaijin-Os2區(qū)的相同方式，基于Asominori與Kasalath或IR24之間的多態(tài)性，來(lái)制備多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物。
具體是，Asominori的Wanderer-Os3區(qū)的第206位核苷酸是″A″，而Kasalath和IR24的相應(yīng)位點(diǎn)上是″T″，見(jiàn)圖9。據(jù)此制備圖11B所示的引物(SEQ ID NOs42和43)作為檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物，按照上述方式進(jìn)行PCR。SEQ ID NOs42和43的序列分別對(duì)應(yīng)于圖9所示Asominori序列(SEQ IDNO34)中的核苷酸177-205和269-292，但5’引物(其具有核苷酸序列SEQ IDNO42)被設(shè)計(jì)成將第203位的核苷酸″A″取代為″T″。當(dāng)采用這種多態(tài)性檢測(cè)標(biāo)志物作為引物時(shí)，擴(kuò)增得到圖9中177-292的序列(SEQ ID NOs34-36)，但5’-引物所致取代僅在Asominori中第203-206位得到序列″TTAA″，在Kasalath和IR24中得到序列″TTAT″。序列″TTAA″由限制酶MseI識(shí)別。5’引物(SEQ ID NO42)還使185位的核苷酸由“T”變?yōu)椤癆”，并使192位的核苷酸由“A”變?yōu)椤癟”。這些都是特別引入的錯(cuò)配，它們除去了擴(kuò)增區(qū)中除203-203位點(diǎn)以外的其它“TTAA”位點(diǎn)。因此，當(dāng)用MseI處理擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，僅Asominori的Wanderer-Os3區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物被切割，Kasalath和IR24的擴(kuò)增產(chǎn)物不被切割。這一點(diǎn)可以用來(lái)檢測(cè)多態(tài)性。
4)Wanderer-Os4區(qū)在Wanderer-Os4區(qū)的情況中，用常規(guī)CAPS方法制備多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物。具體是，Asominori的Wanderer-Os4區(qū)的第284-294位核苷酸是″Gctctgtgtgc″，而Kasalath和IR24的相應(yīng)位點(diǎn)上的核苷酸序列是″Actctgtgtgc″，見(jiàn)圖10。據(jù)此制備圖11C所示的引物(SEQ ID NOs44和45)作為檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物，按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行PCR。SEQ ID NOs44和45的序列分別對(duì)應(yīng)于圖10所示Asominori序列(SEQ ID NO37)中的核苷酸52-75和348-371，這種多態(tài)性檢測(cè)標(biāo)志物被用作引物，以便擴(kuò)增圖10中52-371的序列(SEQ ID NOs37-39)。Asominori中第284-294位的序列″Gctctgtgtgc″由限制酶MwoI識(shí)別(它識(shí)別″GCNNNNNNNGC″)。對(duì)應(yīng)于Asominori中第235-245位核苷酸的序列在所有Asominori，Kasalath和IR24中都是″GCTCGTTTTGC″。因此，當(dāng)用這種限制酶處理擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，Asominori的Wanderer-Os1區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物在兩處位點(diǎn)被切割(284-294和235-245)，Kasalath和IR24的擴(kuò)增產(chǎn)物僅在一個(gè)位點(diǎn)被切割(235-245)。
在Asominori-IR24的71例RIL中作圖，結(jié)果表明RIC3H3M(Wanderer-Os1)，RICGLUTE(Wanderer-Os3)和OSALAM(Wanderer-Os4)基因座分別位于2、10和2號(hào)染色體上。
實(shí)施例3利用Castaway開(kāi)發(fā)標(biāo)志物材料與方法Castaway-Os1和2是提交到數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中的OSSALT(Z25811)和RICRTH(D26547)基因中的Castaway-Os轉(zhuǎn)座因子(Bureau等1996)。
如圖12所示設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增Castaway-Os序列及其鄰接區(qū)域的引物對(duì)(SEQ ID NOs46-49)。這些引物對(duì)用于以Asominori，Kasalath和IR24的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，按照實(shí)施例1所述測(cè)定核苷酸序列。
結(jié)果和討論上述品種的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖13-圖14和SEQ IDNOs50-55。圖13(SEQ ID NOs50-52)顯示Castaway-Os1區(qū)，圖14(SEQ IDNOs53-55)顯示Castaway-Os2區(qū)。
研究表明，Castaway-Os1僅存在于Kasalath中，但Asominori與IR24之間的多態(tài)性也存在于其周邊區(qū)。當(dāng)使用針對(duì)Castaway-Os2的引物時(shí)，未發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的多態(tài)性，但核苷酸序列水平上顯示多態(tài)性。多態(tài)性的頻率傾向于比對(duì)應(yīng)于常規(guī)RFLP標(biāo)志物的基因組序列中的更高，這提示轉(zhuǎn)座因子及其鄰接區(qū)可能存在多處種間差異。
1)Castaway-Os1區(qū)在Castaway-Os1區(qū)的情況中，用dCAPS方法，基于Asominori與IR24之間的多態(tài)性，來(lái)制備多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物。
具體是，Asominori和Kasalath的Castaway-Os1區(qū)的第205位核苷酸是″A″，而IR24的相應(yīng)位點(diǎn)上是″C″，見(jiàn)圖13。據(jù)此制備圖15所示的引物(SEQID NOs56和57)作為檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物，按照上述方式進(jìn)行PCR。SEQ IDNOs56和57的序列分別對(duì)應(yīng)于圖13所示Asominori序列(SEQ ID NO50)中的核苷酸102-125和209-234，但3’引物(其具有核苷酸序列SEQ ID NO42)被設(shè)計(jì)成將第214位的″a″取代為″g″。當(dāng)采用這種多態(tài)性檢測(cè)標(biāo)志物作為引物時(shí)，擴(kuò)增得到圖13中102-234的序列(SEQ ID NOs50-52)，但3’-引物所致取代僅在IR24中第204-214位得到序列″cccatgcatgg″，在Kasalath和Asominori中得到序列″cacatgcatgg″。序列″CCNNNNNNNGG″由限制酶BslI識(shí)別。對(duì)應(yīng)于Asominori中第121-131位核苷酸的序列在所有Asominori，Kasalath和IR24中都是″ccaaggcttgg″。因此，當(dāng)用限制酶BslI處理擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，IR24的Castaway-Os1區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物在兩處位點(diǎn)被切割(204-214和121-131)，Kasalath和Asominori的擴(kuò)增產(chǎn)物僅在一個(gè)位點(diǎn)被切割(121-131)。
2)Castaway-Os2區(qū)在Castaway-Os2區(qū)的情況中，用常規(guī)CAPS方法制備多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物。具體是，Asominori的Castaway-Os2區(qū)的第355-365位核苷酸是″CTTTTGCTTGG″，而Kasalath和IR24的相應(yīng)位點(diǎn)上的核苷酸序列是″CCTTTGCTTGG″，見(jiàn)圖14。據(jù)此制備圖12B所示的引物(SEQ ID NOs48和49)作為檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物，按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行PCR。對(duì)應(yīng)于Asominori中第355-365位核苷酸的Kasalath和IR24序列″CCTTTGCTTGG″由限制酶BslI識(shí)別(它識(shí)別″CCNNNNNNNGG″)。因此，當(dāng)用這種限制酶處理擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，Kasalath和IR24的Castaway-Os2區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物被切割，而Asominori的擴(kuò)增產(chǎn)物不被切割。
在Asominori-IR24的71例RIL中作圖，結(jié)果表明OSSALT(Castaway-Os1)和RICRTH(Castaway-Os2)基因座分別位于1和7號(hào)染色體上。
實(shí)施例4利用Ditto開(kāi)發(fā)標(biāo)志物材料與方法Ditto-Os1和2是提交到數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中的RICHSEA(M80938)和RICOSH1(D16507)基因中的Ditto-Os轉(zhuǎn)座因子(Bureau等1996)。
如圖16所示設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增Ditto-Os序列及其鄰接區(qū)域的引物對(duì)(SEQID NOs58-61)。這些引物對(duì)用于以Asominori，Kasalath和IR24的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，按照實(shí)施例1所述測(cè)定核苷酸序列。
結(jié)果和討論上述品種的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖17-圖18和SEQ IDNOs62-67。圖17(SEQ ID NOs62-64)顯示Ditto-Os1區(qū)，圖18(SEQ ID NOs65-67)顯示Ditto-Os2區(qū)。
1)Ditto-Os2區(qū)當(dāng)使用針對(duì)Ditto-Os2的引物時(shí)，在3個(gè)品種之間發(fā)現(xiàn)了PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的多態(tài)性。具體地，Asominori的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為267個(gè)堿基對(duì)，Kasalath的為246個(gè)堿基對(duì)，IR24的為312個(gè)堿基對(duì)，見(jiàn)圖18。這種多態(tài)性經(jīng)證實(shí)是Asominori和Kasalath分別在Ditto-Os2序列內(nèi)部包含1個(gè)和2個(gè)缺失的結(jié)果。這種基于PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度差異的多態(tài)性被用作ALP標(biāo)志物。在Asominori-IR24的71例RIL中為該標(biāo)志物作圖，結(jié)果表明RICOSH1(Ditto-Os2)基因座位于3號(hào)染色體上。
2)Ditto-Os1區(qū)當(dāng)使用針對(duì)Ditto-Os1的引物時(shí)，未發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的多態(tài)性，但核苷酸序列水平上顯示多態(tài)性。在Ditto-Os1序列及其鄰接區(qū)中多態(tài)性的頻率傾向于比對(duì)應(yīng)于常規(guī)RFLP標(biāo)志物的基因組序列中的更高，這提示轉(zhuǎn)座因子的鄰接區(qū)可能存在多處種間差異。
在Ditto-Os1區(qū)的情況中，用常規(guī)CAPS方法制備多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物。具體是，Asominori的Ditto-Os1區(qū)的第206-209位核苷酸是″GGCT″，而Kasalath和IR24的相應(yīng)位點(diǎn)上的核苷酸序列是″AGCT″，見(jiàn)圖17。而且，Asominori的第273-276位核苷酸是″agcc″，而Kasalath和IR24的相應(yīng)位點(diǎn)上的核苷酸序列是″agct″。據(jù)此制備圖16A所示的引物(SEQ ID NOs58和59)作為檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物，按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行PCR。對(duì)應(yīng)于Asominori中第206-209和273-276位核苷酸的Kasalath和IR24序列″AGCT″由限制酶AluI識(shí)別。對(duì)應(yīng)于Asominori中第29-32和39-42位核苷酸的序列在所有Asominori，Kasalath和IR24中都是″AGCT″。因此，當(dāng)用限制酶AluI處理擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，Asominori的Ditto-Os1區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物在兩處位點(diǎn)被切割(29-32和39-42)，Kasalath和IR24的擴(kuò)增產(chǎn)物在4處位點(diǎn)被切割(206-209和273-276以及29-32和39-42)。
在Asominori-IR24的71例RIL中作圖，結(jié)果表明RICHSEA(Ditto-Os1)基因座位于1號(hào)染色體上。
實(shí)施例5利用p-SINE1開(kāi)發(fā)標(biāo)志物材料與方法p-SINE1-r1至r7是Mochizuki等(1992，同上)所述的轉(zhuǎn)座因子。根據(jù)Mochizuki等(SEQ ID NOs68-73，針對(duì)p-SINE1-r4，-r5和r7)的文獻(xiàn)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增p-SINE1序列(p-SINE1-r1至-r7)及其鄰接區(qū)域的引物對(duì)。這些引物對(duì)用于以Asominori，Kasalath和IR24的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，按照實(shí)施例1所述測(cè)定核苷酸序列。
結(jié)果和討論上述品種的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列對(duì)比結(jié)果見(jiàn)圖19-圖25和SEQ IDNOs74-94。圖19(SEQ ID NOs74-76)顯示p-SINE1-r1區(qū)，圖20(SEQ IDNOs77-79)顯示p-SINE1-r2區(qū)，圖21(SEQ ID NOs80-82)顯示p-SINE1-r3區(qū)，圖22(SEQ ID NOs83-85)顯示p-SINE1-r4區(qū)，圖23(SEQ ID NOs86-88)顯示p-SINE1-r5區(qū)，圖24(SEQ ID NOs89-91)顯示p-SINE1-r6區(qū)，圖25(SEQ ID NOs92-94)顯示p-SINE1-r7區(qū)。
3個(gè)品種的p-SINE1-r3區(qū)未顯示多態(tài)性。至于p-SINE-r1，p-SINE1-r2和p-SINE1-r6區(qū)，在Asominori與Kasalath之間顯示多態(tài)性，但在Asominori與IR24之間未顯示多態(tài)性。對(duì)p-SINE1-r4，p-SINE1-r5和p-SINE1-r7區(qū)而言，在Asominori與IR24之間顯示多態(tài)性。上述多態(tài)性的頻率低于已知在MITE區(qū)中的頻率，但高于常規(guī)基因組序列中的頻率。這提示，MITE區(qū)以及p-SINE1區(qū)都可能存在多處種間差異。
1)p-SINE1-r4區(qū)在p-SINE1-r4區(qū)的情況中，用dCAPS方法，基于Asominori與Kasalath或IR24之間的多態(tài)性，來(lái)制備多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物。
具體是，Asominori的p-SINE1-r4區(qū)的第82-85位核苷酸是″GGGT″，而Kasalath的相應(yīng)位點(diǎn)上是″AAT″，IR24的相應(yīng)位點(diǎn)上是″GGT″，見(jiàn)圖22。據(jù)此制備圖26A所示的引物(SEQ ID NOs95和96)作為檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物，按照上述方式進(jìn)行PCR。SEQ ID NOs95和96的序列分別對(duì)應(yīng)于圖22所示Asominori序列(SEQ ID NO83)中的核苷酸60-86和223-246，但5’引物(其具有核苷酸序列SEQ ID NO95)被設(shè)計(jì)成將第84位的核苷酸″a″取代為″c″。當(dāng)采用這種多態(tài)性檢測(cè)標(biāo)志物作為引物時(shí)，擴(kuò)增得到圖22中60-246的序列(SEQ ID NOs83-85)，但3’-引物所致取代僅在Asominori中第84-94位得到序列″CCGCTCAGGGG″，在Kasalath和IR24中分別得到序列″CCGCTCAGAA″和″CCGCTCAGGG″。Asominori中第84-94位的序列″CCGCTCAGGGG″由限制酶BslI識(shí)別(它識(shí)別″CCNNNNNNNGG″)。對(duì)應(yīng)于Asominori中第109-119位核苷酸的序列在所有Asominori，Kasalath和IR24中都是″CCNNNNNNNGG″。因此，當(dāng)用限制酶BslI處理擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，Asominori的p-SINE1-r4區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物在兩處位點(diǎn)被切割(84-94和109-119)，Kasalath和IR2的擴(kuò)增產(chǎn)物僅在一個(gè)位點(diǎn)被切割(109-119)。
2)p-SINE1-r5區(qū)在SINE1-r5區(qū)的情況中，用常規(guī)CAPS方法制備多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物。具體是，Asominori的SINE1-r5區(qū)的第85-88位核苷酸是″TTAG″，而Kasalath和IR24的相應(yīng)位點(diǎn)上的核苷酸序列是″CTAG″，見(jiàn)圖23。據(jù)此制備圖26B所示的引物(SEQ ID NOs97和98)作為檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物，按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行PCR。SEQ ID NOs97和98的序列分別對(duì)應(yīng)于圖23所示Asominori序列(SEQ ID NO86)中的核苷酸3-26和168-190，這種多態(tài)性檢測(cè)標(biāo)志物被用作引物，以便擴(kuò)增圖23中3-190的序列(SEQ ID NOs86-88)。Kasalath和IR24中核苷酸85-88位的序列″CATG″由限制酶BfaI識(shí)別。對(duì)應(yīng)于Asominori中第64-67位核苷酸的序列在所有Asominori，Kasalath和IR24中都是″CTAG″。因此，當(dāng)用這種限制酶處理擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，Kasalath和IR24的p-SINE1-r5區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物在兩處位點(diǎn)被切割(85-88和64-67)，Asominori的擴(kuò)增產(chǎn)物僅在一處位點(diǎn)被切割(85-88)。
3)p-SINE1-r7區(qū)在p-SINE1-r7區(qū)的情況中，用常規(guī)CAPS方法制備多態(tài)性檢測(cè)的標(biāo)志物。具體是，IR24的p-SINE1-r7區(qū)的第65-69位核苷酸是″cttag″，而Kasalath和Asominori的相應(yīng)位點(diǎn)上的核苷酸序列是″cagtaggattag″(多了7個(gè)核苷酸)，見(jiàn)圖25。據(jù)此制備圖26C所示的引物(SEQ ID NOs99和100)作為檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物，按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行PCR。SEQ ID NOs99和100的序列分別對(duì)應(yīng)于圖25所示Asominori序列(SEQ ID NO92)中的核苷酸17-7和73-96，這種多態(tài)性檢測(cè)標(biāo)志物被用作引物，以便擴(kuò)增圖25中負(fù)17-96的序列(SEQ ID NOs92-94)。IR24中第65-69位核苷酸的序列″cttag″由限制酶DdeI識(shí)別(它識(shí)別″CTNAG″)。因此，當(dāng)用這種限制酶處理擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，IR24的p-SINE1-r7的擴(kuò)增產(chǎn)物被切割，而Kasalath和Asominori的擴(kuò)增產(chǎn)物不被切割。
在Asominori-IR24的71例RIL(重組近交系)中作圖，結(jié)果表明p-SINE1-r4，p-SINE1-r5和p-SINE1-r7基因座都位于2號(hào)染色體上。
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24<210>98<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>98gctgaaaatg ttactcattc agt23<210>99<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>99tggtacactg attactgaag tagc 24<210>100<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>100cagaagacct ctactgaatc ctaa2權(quán)利要求
1.制備用于檢測(cè)植物基因組多態(tài)性的標(biāo)志物的方法，該方法包括利用植物基因組中轉(zhuǎn)座因子和/或其鄰接區(qū)域的堿基序列制備用于核酸擴(kuò)增的引物。
2.權(quán)利要求1的制備用于檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物的方法，包括i)基于目標(biāo)植物基因組中轉(zhuǎn)座因子和/或其鄰接區(qū)域的堿基序列制備一對(duì)引物，用于擴(kuò)增上述轉(zhuǎn)座因子，或該轉(zhuǎn)座因子及其鄰接區(qū)域；ii)以目標(biāo)植物基因組DNA為模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)；和iii)基于在上述核酸擴(kuò)增的產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性，制備用于檢測(cè)植物基因組多態(tài)性的標(biāo)志物。
3.權(quán)利要求2的制備用于檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物的方法，其中制備標(biāo)志物的步驟iii)包括下列a)-c)中任一項(xiàng)a)當(dāng)所述核酸擴(kuò)增產(chǎn)物中的多態(tài)性包含具有缺失區(qū)的類型時(shí)，制備一對(duì)用于核酸擴(kuò)增的引物，使所述引物定位于所述缺失區(qū)的兩側(cè)，以此制備檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物；b)當(dāng)所述核酸擴(kuò)增產(chǎn)物中的多態(tài)性包含導(dǎo)致限制酶識(shí)別差異的堿基取代時(shí)，制備一對(duì)用于核酸擴(kuò)增的引物，使所述引物定位于所述堿基取代位點(diǎn)的兩側(cè)，以此制備檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物；或c)當(dāng)所述核酸擴(kuò)增產(chǎn)物中的多態(tài)性包含不導(dǎo)致限制酶識(shí)別差異的堿基取代時(shí)，制備一對(duì)用于引入錯(cuò)配的引物，使所述引物包含所述堿基取代位點(diǎn)并將所述核酸擴(kuò)增產(chǎn)物中包含該堿基取代位點(diǎn)的區(qū)域修飾為導(dǎo)致限制酶識(shí)別位點(diǎn)差異的堿基序列，以此制備檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物。
4.權(quán)利要求2或3的制備用于檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物的方法，其中步驟i)和iii)的引物對(duì)制備滿足以下1)-5)條件1)每個(gè)引物的長(zhǎng)度為15-30個(gè)堿基；2)每個(gè)引物的堿基序列中G+C含量比為30-70％；3)每個(gè)引物的堿基序列中A、T、G和C的分布略有偏差；4)該引物對(duì)擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物長(zhǎng)度為50-2000堿基；和5)每一引物自身的堿基序列內(nèi)部或不同引物的堿基序列之間不存在互補(bǔ)的部分。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的制備用于檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物的方法，其中步驟ii)的核酸擴(kuò)增應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的制備用于檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物的方法，其中所述目標(biāo)植物為單子葉植物。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的制備用于檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物的方法，其中所述目標(biāo)植物為水稻。
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的制備用于檢測(cè)多態(tài)性的標(biāo)志物的方法，其中所述轉(zhuǎn)座因子為MITE(微小反向重復(fù)轉(zhuǎn)座因子)或SINE(短型散布狀核元件)。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法制備的用于檢測(cè)植物基因組中的多態(tài)性的標(biāo)志物。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種利用轉(zhuǎn)座因子檢測(cè)植物基因組中多態(tài)性的標(biāo)志物及其制備方法。該方法用于制備檢測(cè)植物基因組中多態(tài)性的標(biāo)志物，其特征包括利用植物基因組中的轉(zhuǎn)座因子和/或其鄰接區(qū)域的堿基序列制備用于核酸擴(kuò)增的引物。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1458975SQ01815841
公開(kāi)日2003年11月26日 申請(qǐng)日期2001年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月2日
發(fā)明者小森俊之, 新田直人 申請(qǐng)人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社, 欣根塔有限公司