專(zhuān)利名稱(chēng)：寡核苷酸芯片及其在乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體地是涉及乙肝病毒突變位點(diǎn)的寡核苷酸檢測(cè)芯片，利用寡核苷酸芯片的固相PCR來(lái)檢測(cè)乙肝病毒突變位點(diǎn)。
根據(jù)功能分類(lèi)，基因芯片可分為分為cDNA芯片和寡核苷酸芯片，前者可用于基因功能的分析。寡核苷酸芯片除了可繪制表達(dá)譜外，在高通量測(cè)序、臨床診斷、疾病耐藥性檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性、基因分型等方面具有潛在的優(yōu)勢(shì)。例如人線(xiàn)粒體16.6kb基因組多態(tài)性的研究、BRCA I外顯子11、CFTR基因、ATM基因、HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因的突變檢測(cè)、分枝桿屬內(nèi)不同種的識(shí)別及利福酶素抗性檢測(cè)等。
寡核苷酸芯片識(shí)別單核苷酸多態(tài)性(SNPs)或單堿基突變可以通過(guò)PCR擴(kuò)增得到的片段與等位特異性的寡核苷酸探針雜交，根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)分析結(jié)果。但由于核酸的雜交效率和形成雜合體的熱穩(wěn)定性與核酸的序列、結(jié)構(gòu)關(guān)系密切，改變反應(yīng)條件如溫度、雜交嚴(yán)謹(jǐn)度等只能部分改善雜交效率和雜合體的熱穩(wěn)定性。由于該限制性，衍生出許多新方法和新思路。寡核苷酸芯片由最初的固相合成到合成后點(diǎn)樣，高密度芯片與低密度芯片同時(shí)并存?；诠押塑账彡嚵械奈y(cè)序、單堿基延伸、固相PCR等也應(yīng)運(yùn)而生。
肝炎是世界性傳染疾病，我國(guó)是公認(rèn)的肝炎大國(guó)，肝炎的患病率和發(fā)病率都居世界前列，尤其是乙型肝炎在全國(guó)范圍內(nèi)分布最廣。肝炎病毒的感染，不僅與急慢、性肝炎，還與肝硬化、肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。乙肝病毒基因不同位點(diǎn)的突變可引起免疫逃避、抗病毒治療逃避，使得臨床檢測(cè)出現(xiàn)漏檢、用藥不當(dāng)，以至延誤治療。傳統(tǒng)的乙肝突變檢測(cè)，通常是通過(guò)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)等各種分子標(biāo)記、PCR擴(kuò)增而實(shí)現(xiàn)的。它們難以做到對(duì)大量樣品的同時(shí)、平行分析，而且所需樣品量大，檢測(cè)靈敏度低，操作時(shí)間長(zhǎng)。
本發(fā)明總的構(gòu)思是集寡核苷酸芯片和固相PCR反應(yīng)于一體。在PCR反應(yīng)中，鑒于TaqDNA聚合酶在引物的3′末端存在錯(cuò)配時(shí)不能正確延伸的特點(diǎn)，將突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)在檢測(cè)探針的3′末端，然后將其5′末端固定在經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的玻璃基片上作為寡核苷酸芯片的探針、固相PCR反應(yīng)的固相引物，其3′末端游離。設(shè)計(jì)不同的液相引物，使其與固相引物配對(duì)。為確保擴(kuò)增的效率和準(zhǔn)確性，所擴(kuò)增的PCR區(qū)域不超過(guò)150bp，熒光標(biāo)記采用Cy3-dCTP。固相PCR擴(kuò)增結(jié)果的檢測(cè)采用熒光掃描或是熒光顯微鏡觀察(見(jiàn)附

圖1)。
在本發(fā)明中，采用了三對(duì)液相引物。上游引物3與下游引物3用于擴(kuò)增包括S區(qū)已知突變位點(diǎn)在內(nèi)的區(qū)域。上游引物1與下游引物1用于擴(kuò)增前C區(qū)1762、1764位點(diǎn)聯(lián)合突變，上游引物2與下游引物2來(lái)擴(kuò)增前C區(qū)其它突變位點(diǎn)。液相混合物中的上游引物分別和其相應(yīng)的反義鏈上的寡核苷酸檢測(cè)探針，即固相下游引物配對(duì)。液相混合物中的下游引物分別和其相應(yīng)的正義鏈上的寡核苷酸探針，即固相上游引物配對(duì)。從而擴(kuò)增出不同長(zhǎng)短、包含突變位點(diǎn)信息的帶有熒光標(biāo)記的片段。
本發(fā)明中，乙肝每一個(gè)突變位點(diǎn)在DNA的正、反義鏈上分別設(shè)計(jì)有相應(yīng)的檢測(cè)探針，同時(shí)還有與檢測(cè)探針相對(duì)應(yīng)，僅缺少3′末端待檢測(cè)堿基在內(nèi)的陽(yáng)性對(duì)照探針。所以，每一突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)有6條寡核苷酸探針，陽(yáng)性對(duì)照探針2條、突變檢測(cè)探針2條、野生檢測(cè)探針2條，均分別設(shè)計(jì)在DNA的正、反義鏈上。根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照，如果某一位點(diǎn)的在正、反義鏈上的突變探針的陽(yáng)性信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)高于野生探針，證明該位點(diǎn)為純合突變位點(diǎn)M/M；反之為純合野生位點(diǎn)W/W。如果同一位點(diǎn)在正、反義鏈上的探針信號(hào)強(qiáng)度相近，證明該位點(diǎn)為雜合位點(diǎn)M/W。
本發(fā)明的寡核苷酸檢測(cè)芯片，包括玻璃基片和陣列式分布的寡核苷酸探針與對(duì)照的點(diǎn)涂層，所述點(diǎn)涂層是在玻璃基片上陣列式均勻分布的，含有包括乙肝前核心抗原區(qū)和表面抗原區(qū)已知的12個(gè)突變位點(diǎn)和其相對(duì)應(yīng)的野生位點(diǎn)的72條寡核苷酸探針。
上述玻璃基片為硅烷化玻璃載片，或是經(jīng)過(guò)三甲氧基丙基-乙烯亞胺修飾、丁二酸-N-羥化丁二酰亞胺酯活化的玻璃載片。
上述寡核苷酸芯片上的所有探針通過(guò)5′末端氨基己烷連接在修飾后的玻片上。
上述寡核苷酸探針?biāo)陉嚵信c對(duì)照的點(diǎn)涂層的大小可以根據(jù)點(diǎn)的大小，點(diǎn)間距的變化而變化；陣列的排列和分布數(shù)量可以根據(jù)待分析樣品的數(shù)目而變化。
上述寡核苷酸探針排列如附圖3所示，探針點(diǎn)直徑為100μm，點(diǎn)間距為300μm時(shí)，肽核酸探針?biāo)陉嚵信c相應(yīng)的點(diǎn)涂層大小為2.2mm×2.5mm。
上述的72條寡核苷酸探針包含的12個(gè)突變位點(diǎn)是，乙肝表面抗原區(qū)已知的5個(gè)突變位點(diǎn)546C-T、551A-G、552T-C、585A-C、587G-A；前核心抗原區(qū)7個(gè)已知的突變位點(diǎn)1896G-A、1762A-T與1764G-A聯(lián)合突變、1858C-T、1862G-T、1898G-A、1899G-A、1901G-A。
上述的72條寡核苷酸探針，每一個(gè)待檢測(cè)位點(diǎn)包括6條探針，突變位點(diǎn)和野生位點(diǎn)的正、反義鏈探針共計(jì)4條。陽(yáng)性對(duì)照探針2條，分別位于正、反義鏈，它缺少3′末端的待檢測(cè)堿基。
上述的寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為14-19mer，Tm值相差不超過(guò)10℃，GC堿基百分含量為50％-70％。
本發(fā)明寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)檢測(cè)中的應(yīng)用，方法包括(1)乙肝突變位點(diǎn)檢測(cè)寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)及合成；(2)玻璃基片的修飾和寡核苷酸探針的固定；(3)乙肝樣品DNA的提取；(4)固相PCR擴(kuò)增；(5)寡核苷酸芯片的洗滌和信號(hào)檢測(cè)分析。
上述的固相PCR是在寡核苷酸芯片上進(jìn)行的；固相引物為寡核苷酸芯片上的探針，液相引物為上游引物1、2、3與下游引物1、2、3的混合物；PCR擴(kuò)增之中采用Cy3-dCTP熒光摻入標(biāo)記。
上述的固相PCR擴(kuò)增中的3對(duì)液相引物，分別是用于擴(kuò)增包括S區(qū)已知突變位點(diǎn)在內(nèi)的區(qū)域的上游引物3與下游引物3，用于擴(kuò)增前C區(qū)1762、1764位點(diǎn)聯(lián)合突變的上游引物1與下游引物1，用于擴(kuò)增前C區(qū)其它突變位點(diǎn)的上游引物2與下游引物2；3對(duì)液相引物具體如下
Tm值為解鏈溫度，GC％為鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶百分含量。
本發(fā)明所述的寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)檢測(cè)中的應(yīng)用，具體包括以下步驟1、乙肝突變位點(diǎn)檢測(cè)寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)及合成采用奧理勾5.0(Oligo5.0)軟件來(lái)設(shè)計(jì)探針。檢測(cè)探針采用寡脫氧核苷酸，長(zhǎng)度為14-19mer，每一突變位點(diǎn)的探針包括2條突變檢測(cè)探針、2條野生檢測(cè)探針、2條陽(yáng)性對(duì)照探針，分別設(shè)計(jì)在乙肝DNA的正、反義鏈。4條檢測(cè)探針的3′末端最后一個(gè)堿基分別為正、反義鏈上待檢測(cè)突變位點(diǎn)，2條陽(yáng)性對(duì)照探針缺少3′末端待檢測(cè)堿基。(附圖2為S區(qū)546位點(diǎn)探針設(shè)計(jì)示意圖)，所有探針的Tm值按GC百分比計(jì)算，在65℃-75℃間。寡核苷酸芯片中所用探針(由上海生工生物工程公司合成)信息見(jiàn)表1。探針的5′端連接有氨基己烷NH2-(CH2)6以與活化的玻璃基片結(jié)合。氨基己烷通過(guò)polyT15與寡核苷酸探針相連，多聚胸腺嘧啶的加入，可以減少寡核苷酸探針與玻璃基片之間的空間阻遏，利于PCR的進(jìn)行。2、玻璃基片的修飾和寡核苷酸探針的固定用硅烷化試劑處理干凈的空白玻片，得到的硅烷化玻片可以直接用于點(diǎn)樣。或是將玻片用1％-3％三甲氧基丙基-乙烯亞胺(95％的乙醇配制)溶液處理玻片1小時(shí)，然后用丁二酸-N-羥化丁二酰亞胺酯溶液(用9∶1V/V的DMSODMF配置)處理5個(gè)小時(shí)。
寡核苷酸探針采用pH9.0的碳酸鈉鹽緩沖液溶液作為點(diǎn)樣液，寡核苷酸探針在基片上的分布原則是每一位點(diǎn)的六條探針為一組，陣列面積可以根據(jù)探針的排列以及點(diǎn)、點(diǎn)間距的變化而變化。附圖3中，圓圈內(nèi)的數(shù)字與表1中的探針編號(hào)一致，該陣列共計(jì)8行9列，探針點(diǎn)直徑為100μm，點(diǎn)間距為300μm，總面積為2.2mm×2.5mm。1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48、49-54、55-60、61-66、67-72分別代表乙肝S區(qū)待檢測(cè)位點(diǎn)546、551、552、585、587；前C區(qū)待檢測(cè)位點(diǎn)1896、1762、1764、1858、1862、1898、1899、1901等12組72條寡核苷酸檢測(cè)探針。每一組的6條探針?lè)肿笥覂膳排帕?，左邊的一排從上到下分別是該位點(diǎn)正義鏈上的陽(yáng)性對(duì)照、野生探針和突變探針；右邊的一排從上到下分別是該位點(diǎn)反義鏈上的陽(yáng)性對(duì)照、野生探針和突變探針。點(diǎn)樣后的陣列經(jīng)水合后直接用于固相PCR擴(kuò)增。3、乙肝樣品DNA的提取取乙肝病人血清20-100μl，加入3倍體積的裂解液劇烈振蕩混勻。然后加入等體積的氯仿、異戊醇溶液(24∶1)，混勻后離心。收集上清液，加入2倍體積的無(wú)水乙醇于-20℃放置2個(gè)小時(shí)，離心后所得沉淀用70％的乙醇清洗沉淀2次，自然干燥。4、固相PCR擴(kuò)增固相PCR擴(kuò)增中所用的固相引物為固定在陣列上的寡核苷酸探針，相引物為三對(duì)上、下游引物的混合物。擴(kuò)增采用MJ Research PTC-200固相PCR擴(kuò)增儀，應(yīng)體系為10μl。
PCR擴(kuò)增采程序?yàn)?4℃ 6分鐘 1個(gè)循環(huán)94℃ 15秒、60℃ 30秒、72℃ 45秒，50個(gè)循環(huán)5、寡核苷酸芯片的洗滌和信號(hào)檢測(cè)分析固相PCR擴(kuò)增后的寡核苷酸陣列用1×SSC(0.15M NaCI、17mM檸檬酸鈉，pH7.0)，內(nèi)含0.1％的SDS溶液清洗兩次。清洗后的寡核苷酸陣列經(jīng)激光掃描儀掃描或熒光顯微鏡觀察并收集信號(hào)，分析檢測(cè)結(jié)果。掃描結(jié)果顯示如果某一位點(diǎn)的陽(yáng)性對(duì)照有熒光信號(hào)，正、反義鏈的野生探針陽(yáng)性信號(hào)遠(yuǎn)高于突變探針的信號(hào)強(qiáng)度，證明該位點(diǎn)為純合野生位點(diǎn)W/W。反之為純合突變位點(diǎn)M/M。如果同一位點(diǎn)在正、反義鏈的探針信號(hào)強(qiáng)度相近，證明該位點(diǎn)為雜合位點(diǎn)M/W。
表1 乙肝前S區(qū)與C區(qū)突變位點(diǎn)檢測(cè)探針
其中，每一位點(diǎn)所標(biāo)出的6條探針的排列次序按序號(hào)從低到高分別是正義鏈的陽(yáng)性對(duì)照探針、野生檢測(cè)探針和突變檢測(cè)探針，反義鏈的陽(yáng)性對(duì)照探針、野生檢測(cè)探針和突變檢測(cè)探針。同時(shí)，該表中還包含了探針的序列、長(zhǎng)度、Tm值和GC百分比等內(nèi)容。
本發(fā)明的優(yōu)良效果如下1)本發(fā)明集固相PCR與寡核苷酸芯片于一體。與傳統(tǒng)的突變檢測(cè)技術(shù)，如PCR和RFLP等分子標(biāo)記技術(shù)相比，它可以同時(shí)高通量地檢測(cè)很多突變位點(diǎn)，平行分析多個(gè)樣品。與常規(guī)的基因芯片相比，它直接在芯片上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增結(jié)束后即可直接通過(guò)掃描檢測(cè)結(jié)果而不必要經(jīng)過(guò)雜交，從而縮短了檢測(cè)時(shí)間。
2)本發(fā)明經(jīng)多輪PCR擴(kuò)增后，摻入標(biāo)記的熒光信號(hào)的強(qiáng)度大大增加，使得該檢測(cè)方法的靈敏度大大提高。
3)對(duì)于寡核苷酸芯片檢測(cè)突變來(lái)說(shuō)，待檢測(cè)序列自身結(jié)構(gòu)對(duì)雜交效率和雜交穩(wěn)定性都有影響，因而難以實(shí)現(xiàn)對(duì)大量突變位點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)。本發(fā)明利用TaqDNA聚合酶在3′末端存在錯(cuò)配時(shí)不能正確延伸的特點(diǎn)來(lái)檢測(cè)突變，而不經(jīng)過(guò)雜交。從而使之適用于高通量突變檢測(cè)和單核苷酸多態(tài)性分析。
4)本發(fā)明利用寡核苷酸芯片的固相PCR反應(yīng)來(lái)檢測(cè)乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)，可獲得與突變位點(diǎn)相關(guān)的臨床信息，指導(dǎo)臨床用藥。
圖2是以S區(qū)546位點(diǎn)為例的正、反義探針設(shè)計(jì)示意圖。其中，探針1、2、3為正義鏈上的三條探針，4、5、6為反義鏈上的三條探針。探針1、4分別為正、反義鏈上該位點(diǎn)的陽(yáng)性對(duì)照。2、5分別為該位點(diǎn)在正、反義鏈上的野生型探針，3、6為該位點(diǎn)在正、反義鏈上的突變型探針。
圖3為寡核苷酸探針在玻璃基片上的分布示意圖。
其中，1為玻璃基片，2為寡核苷酸探針與對(duì)照的點(diǎn)涂層。圓圈內(nèi)的數(shù)字與表1所列出的寡核苷酸探針序號(hào)相對(duì)應(yīng)。
圖4為利用激光共聚焦掃描儀ScanArray4000掃描(激光強(qiáng)度為80，PMT增益為80)經(jīng)固相PCR擴(kuò)增和清洗后的寡核苷酸芯片的結(jié)果圖。寡核苷酸芯片上分布有乙肝1896和1901位點(diǎn)的12條探針。其中，1和2列是1896位點(diǎn)的6條探針，3和4列是1901位點(diǎn)的6條探針。A1、B1、C1分別是1896位點(diǎn)正義鏈上的陽(yáng)性對(duì)照，野生位點(diǎn)檢測(cè)探針和突變位點(diǎn)檢測(cè)探針；A2、B2、C2分別是1896位點(diǎn)反義鏈上的陽(yáng)性對(duì)照，野生位點(diǎn)檢測(cè)探針和突變位點(diǎn)檢測(cè)探針。1901位點(diǎn)的探針排列如1896位點(diǎn)，3、4列分別為正義鏈和反義鏈上的三條探針。
寡核苷酸探針與對(duì)照的點(diǎn)涂層2陣列共計(jì)8行9列，針點(diǎn)直徑為100μm，間距為300μm，總面積為2.2mm×2.5mm。1-6、7-12、13-18、19-24、25-30、31-36、37-42、43-48、49-54、55-60、61-66、67-72分別代表乙肝S區(qū)待檢測(cè)位點(diǎn)516、551、552、585、587；前C區(qū)待檢測(cè)位點(diǎn)1896、1762、1764、1858、1862、1898、1899、1901等12組72條寡核苷酸檢測(cè)探針。每一組的6條探針?lè)肿笥覂膳排帕校筮叺囊慌艔纳系较路謩e是該位點(diǎn)正義鏈上的陽(yáng)性對(duì)照、野生探針和突變探針；右邊的一排從上到下分別是該位點(diǎn)反義鏈上的陽(yáng)性對(duì)照、野生探針和突變探針。點(diǎn)樣后的陣列經(jīng)水合后直接用于固相PCR擴(kuò)增。
固相PCR在寡核苷酸芯片上進(jìn)行，寡核苷酸探針同時(shí)是固相PCR擴(kuò)增的固相引物，三對(duì)液相引物包括了所有待檢測(cè)突變位點(diǎn)在內(nèi)的區(qū)域，且保證最長(zhǎng)的擴(kuò)增片段不超過(guò)150bp。在固相PCR擴(kuò)增過(guò)程中采用Cy-3-dCTP熒光摻入標(biāo)記。寡核苷酸芯片的固相PCR產(chǎn)物經(jīng)激光共聚焦掃描儀掃描后分析各突變位點(diǎn)。
實(shí)施例2.如實(shí)施例1所述的寡核苷酸芯片，所不同的是在玻璃基片1是經(jīng)過(guò)三甲氧基丙基-乙烯亞胺修飾、丁二酸-N-羥化丁二酰亞胺酯活化的玻璃載片。
實(shí)施例3.寡核苷酸檢測(cè)芯片用于乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)的檢測(cè)1.乙肝突變位點(diǎn)檢測(cè)寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)及合成采用Oligo5.0軟件來(lái)設(shè)計(jì)探針。檢測(cè)探針采用寡脫氧核苷酸，長(zhǎng)度為14-19mer，每一突變位點(diǎn)的探針包括2條突變檢測(cè)探針、2條野生檢測(cè)探針、2條陽(yáng)性對(duì)照探針，分別設(shè)計(jì)在乙肝DNA的正、反義鏈。4條檢測(cè)探針的3′末端最后一個(gè)堿基分別為正、反義鏈上待檢測(cè)突變位點(diǎn)，2條陽(yáng)性對(duì)照探針缺少3′末端待檢測(cè)堿基。(附圖2為S區(qū)546位點(diǎn)探針設(shè)計(jì)示意圖)所有探針的Tm值按GC百分比計(jì)算，在65℃-75℃間。寡核苷酸芯片中所用探針(由上海生工生物工程公司合成)信息見(jiàn)表1。探針的5′端連有氨基己烷NH2-(CH2)6以與活化的玻璃基片結(jié)合。氨基己烷通過(guò)polyT15與寡核苷酸探針相連，加入多聚胸腺嘧啶，以減少寡核苷酸探針與玻璃基片之間的空間阻遏，利于PCR的進(jìn)行。2.玻璃基片的表面化學(xué)修飾和寡核苷酸探針的固定(1)玻璃基片的表面化學(xué)修飾1)將載玻片用1MNaOH浸泡1小時(shí)，水洗后再用1MHCI浸泡1小時(shí)。純水充分清洗后用乙醇清洗1次，甩干。
2)室溫下將上述玻片用3％的3-氨基丙基三甲氧基硅烷(95％的乙醇溶液配制)、或是3％的三甲氧基丙基-乙烯亞胺(95％的乙醇配制)處理1小時(shí)，劇烈振蕩。
3)室溫下將玻片用95％的乙醇溶液清洗3次，每次5分鐘。
4)使用平板離心機(jī)，800rpm離心8分鐘，甩干玻片。
5)將玻片置于80℃，烘烤1小時(shí)。至此得到的3-氨基丙基三甲氧基硅烷硅化的玻璃基片可以直接用于結(jié)合寡核苷酸探針，3％的三甲氧基丙基-乙烯亞胺處理的基片繼續(xù)進(jìn)行以下處理6)室溫下用20mM的丁二酸-N-羥化丁二酰亞胺酯溶液(9∶1V/V的DMSODMF配制)處理5個(gè)小時(shí)。
7)用乙醇清洗玻片兩次，每次5分鐘。
8)使用平板離心機(jī)，800rpm離心8分鐘，甩干玻片。
(2)寡核苷酸探針的固定寡核苷酸探針采用pH9.0的碳酸鹽緩沖液作為點(diǎn)樣液，探針濃度為50μM。利用卡塔森5500(Cartesian Pixsys5500)點(diǎn)樣儀把寡核苷酸探針點(diǎn)到活化的玻璃基片上，陣列的排列如附圖3所示，點(diǎn)直徑為100μm，點(diǎn)間距為300μm，陣列大小為2.2mm×2.5mm。點(diǎn)樣后而得到的寡核苷酸芯片置于含飽和NaCI溶液的濕盒中，室溫過(guò)夜。然后將玻片浸于150mM的乙醇胺(用100mM的Tris-CI配置，pH值為9.0)溶液，55℃反應(yīng)20分鐘以封閉未反應(yīng)的丁二酸-N-丁二酰亞胺酯。3.寡核苷酸芯片上的固相PCR(1)乙肝病毒DNA的提取1)取100μl乙肝病人血清，加入3倍體積的裂解液(4M硫氰酸胍、巰基乙醇、0.1MTris-CI，pH7.5)混勻。2)加入等體積的仿、異戊醇溶液(24∶1)，充分混勻。室溫下12000rpm離心15分鐘。3)小心將上清液移入另一1.5ml離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇。-20℃放置2個(gè)小時(shí)。4)4℃，12000rpm離心15分鐘。5)離心后所得沉淀用70％的乙醇清洗2次，每次在4℃，12000rpm離心10分鐘。6)沉淀自然干燥后溶于5.55μl純水中。(2)固相PCR擴(kuò)增采用MJ Research PTC-200固相PCR擴(kuò)增儀。1)PCR反應(yīng)體系為10μl，其中包括10×PCR緩沖液1.0μl2mM dATP dGTP dTTP 混合物1.0μl2mM dCTP 0.65μl1mM dCTP 0.7μl3對(duì)液相液相引物混合物(5μM) 1.0μlTaq DNA聚合酶(5u/μl)0.1μl乙肝DNA 5.55μl10μl其中10×PCR緩沖液的成分為500mM Tris-CI(pH8.3)、20mM MgCI2、0.75％牛血清蛋白。2)PCR擴(kuò)增采程序?yàn)?4℃ 6分鐘 1個(gè)循環(huán)94℃ 15秒、60℃ 30秒、72℃ 45秒， 50個(gè)循環(huán)4.寡核苷酸芯片的清洗、掃描和結(jié)果分析固相PCR擴(kuò)增后的寡核苷酸陣列用1×SSC，內(nèi)含0.1％的SDS溶液清洗兩次，每次5分鐘。清洗后的寡核苷酸陣列經(jīng)激光共聚焦掃描儀ScanArray4000掃描并收集信號(hào)，分析檢測(cè)結(jié)果。圖4為根據(jù)本發(fā)明所提供的具體方法，使用經(jīng)3-氨基丙基三甲氧基硅烷修飾的玻片固定探針，檢測(cè)一未知的乙肝病毒DNA1896和1901位點(diǎn)突變的結(jié)果圖。該寡核苷酸芯片包含了乙肝病毒1896和1901兩個(gè)位點(diǎn)的12條探針，所用的液相引物為上游引物2和下游引物2。圖中的1和2列是1896位點(diǎn)的6條探針，3和4列是1901位點(diǎn)的6條探針。A1、B1、C1分別是1896位點(diǎn)正義鏈上的陽(yáng)性對(duì)照，野生位點(diǎn)檢測(cè)探針和突變位點(diǎn)檢測(cè)探針；A2、B2、C2分別是1896位點(diǎn)反義鏈上的陽(yáng)性對(duì)照，野生位點(diǎn)檢測(cè)探針和突變位點(diǎn)檢測(cè)探針。1901位點(diǎn)的探針排列如1896位點(diǎn)，3、4列分別為正義鏈和反義鏈上的三條探針。根據(jù)掃描結(jié)果和陽(yáng)性對(duì)照探針的熒光強(qiáng)度，1896位點(diǎn)的B1和B2的熒光信號(hào)強(qiáng)度均遠(yuǎn)高于C1和C2，因此該位點(diǎn)為野生純合。1901位點(diǎn)中C3的熒光強(qiáng)度高于C2，證明1901位點(diǎn)在正義鏈上存在突變1901G-A。B4的熒光強(qiáng)度要強(qiáng)于C4，1901位點(diǎn)在反義鏈上不存在突變，所以該位點(diǎn)為野生雜合。
權(quán)利要求
1.一種寡核苷酸芯片，包括玻璃基片和陣列式分布的寡核苷酸探針與對(duì)照的點(diǎn)涂層，其特征在于所述的點(diǎn)涂層是在玻璃基片上均勻分布的、含有包括乙肝前核心抗原區(qū)和表面抗原區(qū)已知的12個(gè)突變位點(diǎn)和其相對(duì)應(yīng)的野生位點(diǎn)的72條寡核苷酸探針。
2.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的玻璃基片為硅烷化玻璃載片，或者是經(jīng)過(guò)三甲氧基丙基-乙烯亞胺修飾和丁二酸-N-羥化丁二酰亞胺酯活化的玻璃載片。
3.如權(quán)利要求1或2所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探針通過(guò)5′末端的氨基己烷連接在修飾后的玻片上。
4.如權(quán)利要求1所述的的寡核苷酸檢測(cè)芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針?biāo)陉嚵信c對(duì)照的點(diǎn)涂層的大小，可以根據(jù)點(diǎn)的大小，點(diǎn)間距的變化而變化；陣列的排列和分布數(shù)量可以根據(jù)待分析樣品的數(shù)目而變化。
5.如權(quán)利要求4所述的寡核苷酸檢測(cè)芯片，其特征在于，所述寡核苷酸探針點(diǎn)直徑為100μm，點(diǎn)間距為300μm時(shí)，寡核苷酸探針?biāo)陉嚵信c對(duì)照點(diǎn)涂層大小為2.2mm×2.5mm。
6.如權(quán)利要求1所述的寡核苷酸檢片，其特征在于，所述的72條寡核苷酸探針包含的12個(gè)突變位點(diǎn)是，乙肝表面抗原區(qū)已知的5個(gè)突變位點(diǎn)546C-T、551A-G、552T-C、585A-C、587G-A；前核心抗原區(qū)7個(gè)已知的突變位點(diǎn)18966-A、1762A-T與1764G-A聯(lián)合突變、1858C-T、1862G-T、1898G-A、1899G-A、1901G-A。
7.如權(quán)利要求1或6所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探針，每一個(gè)待檢測(cè)位點(diǎn)包括6條探針，突變位點(diǎn)和野生位點(diǎn)的正、反義鏈探針共計(jì)4條，陽(yáng)性對(duì)照探針2條，分別位于正、反義鏈，它缺少3′末端的待檢測(cè)堿基。
8.如權(quán)利要求1或6所述的寡核苷酸芯片，其特征在于，所述的寡核苷酸探針的長(zhǎng)度為14-19mer，Tm值相差不超過(guò)10℃，GC百分含量為50％-70％。
9.一種權(quán)利要求1所述的寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)檢測(cè)中的應(yīng)用，包括(1)乙肝突變位點(diǎn)檢測(cè)寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)及合成；(2)玻璃基片的修飾和寡核苷酸探針的固定；(3)乙肝樣品DNA的提??；(4)固相PCR擴(kuò)增；(5)寡核苷酸芯片的洗滌和信號(hào)檢測(cè)分析。
10.如權(quán)利要求9所述的寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于，所述的固相PCR是在寡核苷酸芯片上進(jìn)行的；固相引物同時(shí)為寡核苷酸芯片上的探針，液相引物為上游引物1、2、3與下游引物1、2、3的混合物；PCR擴(kuò)增之中采用Cy3-dCTP熒光摻入標(biāo)記。
11.如權(quán)利要求10所述的寡核苷酸芯片在乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)檢測(cè)中的應(yīng)用，其特征在于，所述的固相PCR擴(kuò)增中的3對(duì)液相引物，分別是用于擴(kuò)增包括S區(qū)已知突變位點(diǎn)在內(nèi)的區(qū)域的上游引物3與下游引物3，用于擴(kuò)增前C區(qū)1762、1764位點(diǎn)聯(lián)合突變的上游引物1與下游引物1，用于擴(kuò)增前C區(qū)其它突變位點(diǎn)的上游引物2與下游引物2，3對(duì)液相引物具體如下
全文摘要
寡核苷酸芯片及其在乙型肝炎病毒突變位點(diǎn)檢測(cè)中的應(yīng)用，屬于基因芯片技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的寡核苷酸檢測(cè)芯片，包括玻璃基片和陣列式分布的寡核苷酸探針與對(duì)照的點(diǎn)涂層，所述的寡核苷酸探針共72條，包含有乙肝前核心抗原區(qū)和表面抗原區(qū)已知的12個(gè)突變位點(diǎn)和其相對(duì)應(yīng)的野生位點(diǎn)。以玻璃基片上的寡核苷酸探針作為固相引物，乙肝病毒DNA作為模板，三對(duì)液相引物混合后，通過(guò)熒光標(biāo)記的Cy3－dCTP進(jìn)行固相PCR擴(kuò)增。根據(jù)寡核苷酸芯片上不同位點(diǎn)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)分析突變位點(diǎn)。本發(fā)明集寡核苷酸芯片和固相PCR于一體，具有快速、高效、準(zhǔn)確、平行診斷的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1431317SQ0213562
公開(kāi)日2003年7月23日 申請(qǐng)日期2002年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月14日
發(fā)明者魯艷芹, 韓金祥 申請(qǐng)人:山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心