一種滯育激素融合基因、融合蛋白、制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種滯育激素融合基因、融合蛋白、制備方法及應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明以分月扇舟蛾(Clostera anastomosis)滯育激素基因(Cloan-DH)編碼序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)改造合成遺傳密碼子得到優(yōu)化的人工基因，以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP為標(biāo)簽，人工合成TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，通過構(gòu)建TAT-Cloan-DH（TCDH）融合基因，在大腸桿菌中表達(dá)融合蛋白，借助TAT的高效跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，通過害蟲取食途徑將外源DH作用于害蟲，達(dá)到預(yù)防和控制蟲害的目的。
【專利說明】一種滯育激素融合基因、融合蛋白、制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種滯育激素融合基因，同時(shí)還涉及一種滯育激素融合蛋白以及 該融合蛋白的制備方法和應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] TAT(transactivator of transcription，TAT)為病毒有效轉(zhuǎn)錄和復(fù)制所必須 的多肽序列。TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域能夠?qū)⑴c之共價(jià)連接的生物大分子（如核酸、多肽、蛋白質(zhì) 等）非特異地轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)部，這種過程既不依賴于受體和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也與溫度和能量無 關(guān)，而且對宿主細(xì)胞幾乎沒有毒性。這種具有攜帶外源蛋白穿透細(xì)胞膜能力的特異多肽 序列稱為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域（Protein transduction Domains, PTDs),也稱細(xì)胞穿膜肽（cell penetratingpeptides, CPP)〇
[0003] 昆蟲滯育激素 （diapause hormone, DH)是昆蟲神經(jīng)肽類激素的一種，控制滯育行 為。滯育行為對昆蟲種群的繁衍有兩方面的積極意義，一是度過不良環(huán)境，維持個(gè)體生存； 二是使群體發(fā)育整齊，增強(qiáng)雌雄個(gè)體間交配機(jī)率。滯育激素作為昆蟲內(nèi)分泌調(diào)節(jié)神經(jīng)肽之 一，其引起昆蟲生理反應(yīng)所需劑量極低，理論上只需極微量的外源DH進(jìn)入蟲體，便可對害 蟲造成強(qiáng)烈生理干擾作用，但是如何有效保持外源DH活性，仍有待解決。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種滯育激素融合基因。
[0005] 其次，本發(fā)明提供一種滯育激素融合蛋白。
[0006] 再者，本發(fā)明提供一種滯育激素融合蛋白的制備方法。
[0007] 同時(shí)，本發(fā)明提供一種滯育激素融合基因在預(yù)防和控制蟲害方面的應(yīng)用。
[0008] 最后，本發(fā)明提供一種滯育激素融合蛋白在預(yù)防和控制蟲害方面的應(yīng)用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0010] 一種滯育激素融合基因，其含有TAT-Cloan-DH (T⑶H)融合基因，T⑶H融合基因 的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0011] 進(jìn)一步的，滯育激素融合基因還包含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因，EGFP基因 的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0012] 所述的TAT-Cloan-DH (T⑶H)融合基因和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因通過一 段編碼柔性連接肽的核苷酸序列連接。具體的，滯育激素融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0013] 一種滯育激素融合蛋白，其含有如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。該氨基酸序 列由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列編碼。
[0014] -種滯育激素融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：
[0015] (1)以PUC57-TCDH質(zhì)粒為模板擴(kuò)增TAT-Cloan-DH (TCDH)融合基因，并連接到 PGEX-4T載體中構(gòu)建pGEX-4T-TCDH載體；
[0016] (2)以pEGFP-NI質(zhì)粒為模板擴(kuò)增增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因，并連接到 PGEX-4T-TCDH 載體中構(gòu)建 pGEX-4T-TCDH-EGFP 載體；
[0017] (3)將PGEX-4T-T⑶H-EGFP載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)即得滯育激素融合蛋白 (TCDH-EGFP融合蛋白）。
[0018] 所述步驟（1)中擴(kuò)增TAT-Cloan-DH (T⑶H)融合基因采用的引物對A為：
[0019] A 上游引物：5' -CGGAATTCATGTACGGCCGCAAGAAGAGG-3' (如 SEQ ID NO: 5 所示），
[0020] A 下游引物：5' -ACGCGTCGACGTCGACATTGTCTTCACTG-3,(如 SEQ ID NO:6 所示）。
[0021] 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：總體系 50μ 1，40· 5μ I dH20、5y I 10XBuffer、ly 1 dNTP(25 μ Μ)、1 μ I primer forward (12 μ Μ)>1 μ I primer reverse (12 μ Μ)>0. 5 μ I pfu Taq(5U/y 1)、1 μ I Templete cDNA(〈20pg/y 1)。
[0022] 擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94°C 4min預(yù)變性后，94°C 30s，60°C 30s，72°C 30s，共30個(gè)循環(huán)， 最后72°C延伸7min。
[0023] 所述步驟（2)中擴(kuò)增增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP)基因采用的引物對B為：
[0024] B 上游引物：5 ' -ACGCGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3 '（如 SEQ ID NO: 7 所示)，
[0025] B 下游引物：5' -AATGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3' (如 SEQ ID NO:8 所 示)。
[0026] 擴(kuò)增反應(yīng)體系為：總體系 50μ 1，40· 5μ 1 (1Η20、5μ I 10XBuffer、ly 1 dNTP(25 μ Μ)>1 μ I primer forward (12 μ Μ)>1 μ I primer reverse (12 μ Μ)>0. 5 μ I pfu Taq(5U/y 1)、1 μ I Templete cDNA(〈20pg/y 1)。
[0027] 擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94°C 4min預(yù)變性后，94°C 30s，62°C 30s，72°C 60s，共30個(gè)循環(huán)， 最后72°C延伸7min。
[0028] -種滯育激素融合基因在預(yù)防和控制蟲害方面的應(yīng)用。
[0029] -種滯育激素融合蛋白（T⑶H-EGFP)在預(yù)防和控制蟲害方面的應(yīng)用。
[0030] 具體的，滯育激素融合蛋白在制備殺蟲組合物方面的應(yīng)用。其中，TCDH-EGFP融合 蛋白為殺蟲組合物的活性成分，其有效添加量大于I X ΚΓ4%。
[0031] 所述的殺蟲組合物的制備方法為：取TCDH-EGFP融合蛋白與常規(guī)輔料混勻即得。 常規(guī)輔料如棉鈴蟲人工飼料等，棉鈴蟲人工飼料配方（500ml):麥麩70g，大豆粉40g，干酵 母l〇g，玉米油3ml，瓊脂8g，山梨酸Ig,抗壞血酸15g，溶劑為水。
[0032] 本發(fā)明的有益效果：
[0033] 本發(fā)明以分月扇舟蛾（Clostera anastomosis)滯育激素基因（Cloan-DH)編碼序 列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)改造合成遺傳密碼子得到優(yōu)化的人工基因，以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP為 標(biāo)簽，人工合成TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，通過構(gòu)建TAT-Cloan-DH (T⑶H)融合基因，在大腸桿 菌中表達(dá)融合蛋白，借助TAT的高效跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，通過害蟲取食途徑將外源DH作用于害 蟲，達(dá)到預(yù)防和控制蟲害的目的。
[0034] 本發(fā)明分析了 TAT對保持DH生物活性的作用，為利用以DH為例的昆蟲神經(jīng)肽提 供了理論依據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。本發(fā)明的意義主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：在世界范圍內(nèi)，蟲害每 年造成的損失約占作物總產(chǎn)量的15%，損失數(shù)千億美元。目前蟲害的防治主要依賴化學(xué)農(nóng) 藥，雖一時(shí)緩解了矛盾，但由此造成了環(huán)境污染、害蟲抗藥性和害蟲再猖獗等生態(tài)問題。昆 蟲神經(jīng)肽類激素調(diào)控影響昆蟲的生長、發(fā)育和變態(tài)、昆蟲的生殖、代謝行為和遺傳信息的表 達(dá)，以及性信息素的合成和釋放等多種生理過程。由于神經(jīng)肽類激素具有如此重要的生物 功能，因此，通過干擾神經(jīng)肽活動(dòng)可以達(dá)到控制害蟲的目的。本發(fā)明成功人工表達(dá)出有活性 的昆蟲滯育激素，昆蟲通過自然取食行為將外源激素?cái)z入體內(nèi)，從而打破其內(nèi)分泌系統(tǒng)平 衡，導(dǎo)致蟲體發(fā)育減慢，死亡率增加，對害蟲具有控制作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中T⑶H基因PCR擴(kuò)增片段的電泳圖；
[0036] 圖2為實(shí)施例1中EGFP基因 PCR擴(kuò)增片段的電泳圖；
[0037] 圖3為實(shí)施例1中重組質(zhì)粒pGEX-4T-TCDH的EcoRI、Sail雙酶切片段電泳圖；
[0038] 圖4為實(shí)施例2中重組質(zhì)粒pGEX-4T-TCDH-EGFP的Sail、NotI雙酶切片段電泳 圖；
[0039] 圖5為實(shí)施例3中T⑶H-EGFP融合蛋白原核表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖；
[0040] 圖6為實(shí)施例3中T⑶H-EGFP融合蛋白純化后的SDS-PAGE電泳圖；
[0041] 圖7為實(shí)施例4中棉鈴蟲幼蟲取食TCDH-EGFP融合蛋白中腸體段切片熒光圖；
[0042] 圖8為實(shí)施例5中棉鈴蟲幼蟲死亡率統(tǒng)計(jì)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 下述實(shí)施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0044] 實(shí)施例1
[0045] 重組質(zhì)粒pGEX-4T-TCDH的構(gòu)建：
[0046] 1、引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增
[0047] 限制性核酸酶EcoRI、SalI、NotI，普通Taq酶、T4連接酶均為美國MBIFermentas 產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒為上海生工產(chǎn)品；其他所用 試劑分析純均為BBI產(chǎn)品。
[0048] TO)H基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(其中TAT與Cloan-DH的連接基于 共價(jià)連接)，連接保存于PUC57質(zhì)粒中構(gòu)成中間載體pUC57-T⑶H (線性小片段T⑶H基因由 人工化學(xué)合成，小片段雙鏈DNA沒有制粒DNA穩(wěn)定性高，由上述公司合成后連接保存于克隆 載體中，PUC57為常用質(zhì)粒載體)，引物對A以pUC57-TCDH質(zhì)粒為模板；引物對B擴(kuò)增獲取 EGFP基因，以質(zhì)粒pEGFP-NI為模板，pEGFP-NI購買自上海生工生物工程有限公司。
[0049] 根據(jù)目的基因及載體（PGEX-4T)序列設(shè)計(jì)引物，并分別在上下游引物5'端引入 EcoRI、Sail酶切位點(diǎn)，命名A上游引物及A下游引物。為后續(xù)添加 EGFP標(biāo)簽，設(shè)計(jì)引物B 上游引物及B下游引物，并引入Sail、NotI酶切位點(diǎn)，引物對A、B詳見下表1。
[0050] 表1弓丨物序列
[

【權(quán)利要求】
1. 一種滯育激素融合基因，其特征在于：其含有TCDH融合基因，TCDH融合基因的核苷 酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的滯育激素融合基因，其特征在于：還包含EGFP基因，EGFP基 因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的滯育激素融合基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4. 一種滯育激素融合蛋白，其特征在于：其含有如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
5. -種如權(quán)利要求4所述的滯育激素融合蛋白的制備方法，其特征在于：包括以下步 驟： (1) 擴(kuò)增TCDH融合基因并連接到pGEX-4T載體中構(gòu)建pGEX-4T-TCDH載體； (2) 擴(kuò)增EGFP基因并連接到pGEX-4T-TCDH載體中構(gòu)建pGEX-4T-TCDH-EGFP載體； (3) 將pGEX-4T-T⑶Η-EGFP載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)即得滯育激素融合蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的滯育激素融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟（1)中 擴(kuò)增TCDH融合基因采用的引物對A為： A 上游引物：5' -CGGAATTCATGTACGGCCGCAAGAAGAGG-3', A 下游引物：5' -ACGCGTCGACGTCGACATTGTCTTCACTG-3，。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的滯育激素融合蛋白的制備方法，其特征在于：所述步驟（2)中 擴(kuò)增EGFP基因采用的引物對B為： β 上游引物：5' -ACGCGTCGACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3，, Β 下游引物：5' -AATGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3'。
8. -種如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的滯育激素融合基因在預(yù)防和控制蟲害方面的應(yīng) 用。
9. 一種如權(quán)利要求4所述的滯育激素融合蛋白在預(yù)防和控制蟲害方面的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的滯育激素融合蛋白在預(yù)防和控制蟲害方面的應(yīng)用，其特征 在于：滯育激素融合蛋白在制備殺蟲組合物方面的應(yīng)用，其中，滯育激素融合蛋白為殺蟲組 合物的活性成分，其有效添加量大于1X ΚΓ4%。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104293814SQ201410012581
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】周洲, 李永麗, 源春彥, 王盼盼, 李紅英 申請人:河南科技大學(xué)