用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)。進一步地，本發(fā)明涉及含有作為腫瘤組織生長支架的凝膠、培養(yǎng)基、促凝劑和腫瘤組織的三維培養(yǎng)系統(tǒng)。
【專利說明】用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)。進一步地，本發(fā)明涉及所述三維培養(yǎng)系統(tǒng)用于腫瘤化療藥物的篩選。
【背景技術(shù)】
[0002]目前惡性腫瘤治療方案首選手術(shù)切除原發(fā)病灶，但是有些惡性腫瘤患者在就診時已處于腫瘤晚期，無法行手術(shù)治療，且手術(shù)切除原發(fā)灶后，腫瘤復發(fā)均影響了腫瘤治療效果，降低了惡性腫瘤患者生存期?；熤委熓翘岣吣[瘤治療效果，改善患者預后并延長患者生存期的重要手段之一。目前惡性腫瘤的化療治療主要是采取全身應(yīng)用化療藥物，在應(yīng)用化療藥物前，通過體外培養(yǎng)腫瘤組織原代細胞，從而篩選出敏感性化療藥物，指導臨床制定化療方案。
[0003]體外細胞培養(yǎng)技術(shù)不能完美模擬腫瘤組織的體內(nèi)環(huán)境，且破壞了腫瘤組織的微環(huán)境，所應(yīng)用化療藥物僅針對腫瘤實質(zhì)細胞，而不能同時作用于腫瘤間質(zhì)細胞。細胞培養(yǎng)中細胞在二維平面生長，而在體的腫瘤細胞是在三維系統(tǒng)中生長，現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)技術(shù)不能完全模擬腫瘤組織的在體生長環(huán)境及生物動力學變化。
[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)腫瘤細胞的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，利用含有培養(yǎng)基的凝膠構(gòu)建出腫瘤組織生長的支架。瘤組織固定于凝膠支架中，腫瘤組織塊自身構(gòu)成了與體內(nèi)完全一致的腫瘤組織生長微環(huán)境。而凝膠支架模擬并提供了腫瘤組織在體生長的條件。在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中，腫瘤細胞增殖并能夠遷移，排除了二維培養(yǎng)系統(tǒng)中的接觸抑制效應(yīng)，該系統(tǒng)中的腫瘤細胞生長，完全反應(yīng)了腫瘤細胞對干預措施的反應(yīng)。
[0005]根據(jù)本發(fā)明提供的三維培養(yǎng)系統(tǒng)與現(xiàn)有技術(shù)形比，具有以下優(yōu)點:
[0006]1、三維培養(yǎng)系統(tǒng)的建立為細胞和組織培養(yǎng)提供了一種三維立體的培養(yǎng)系統(tǒng)，更加符合細胞生長的生物學行為，可促進細胞的聚集，維持組織細胞的橢球形狀，并支持腫瘤細胞的正常生長。
[0007]2、本技術(shù)利用三維組織培養(yǎng)技術(shù),完好的模擬活體環(huán)境。與傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)技術(shù)相t匕，三維組織培養(yǎng)技術(shù)，能夠模擬腫瘤組織的微環(huán)境，更加完美呈現(xiàn)腫瘤組織對化療藥物敏感性。
[0008]3、本系統(tǒng)采集手術(shù)切除的腫瘤標本，針對每個個體，每種腫瘤的敏感性進行篩選。做到了個體化，最大程度增加化療敏感性，減輕化療藥物毒副作用。
[0009]4、本系統(tǒng)能夠用于干細胞培養(yǎng)及分化急性和慢性毒性試驗；藥物預測療效的篩選；血管生成試驗等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供了一種用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述三維培養(yǎng)系統(tǒng)含有作為腫瘤組織生長支架的凝膠。
[0011]進一步地，根據(jù)本發(fā)明所述的用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述三維培養(yǎng)系統(tǒng)還含有培養(yǎng)基、促凝劑。
[0012]進一步地，根據(jù)本發(fā)明所述的用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述三維培養(yǎng)系統(tǒng)進一步含有腫瘤組織。
[0013]進一步地，根據(jù)本發(fā)明所述的用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述腫瘤組織固定于凝膠支架中。
[0014]可選地，根據(jù)本發(fā)明所述的用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述腫瘤組織是肝癌組織。
[0015]另一方面，本發(fā)明提供了一種建立用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)的方法，其包括步驟:
[0016]a)配制液體凝膠與促凝劑的混合物；
[0017]b)將配置好的凝膠混合物加入培養(yǎng)板中，等待液態(tài)凝膠形成半透明狀；
[0018]c)將腫瘤組織塊放置于半透明的凝膠中，置于孔正中，靜置，待組織培養(yǎng)凝膠形成不透明的膠凍狀。
[0019]另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)在化療藥物篩選中的用途。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1:肝癌組織三維培養(yǎng)，鏡下觀察不同處理組，肝癌細胞生長及細胞遷移情況，細胞遷移距離反應(yīng)了肝癌細胞對化療藥物敏感性?；熕幬锩舾校毎w移距離短。A為對照組，B-D為不同化療藥物處理組。
[0021]圖2:利用三維培養(yǎng)體系，篩選出肝癌組織敏感性化療藥物。
[0022]應(yīng)當了解，所附附圖并非按比例地顯示了本發(fā)明的基本原理的圖示性的各種特征的略微簡化的畫法。本文所公開的本發(fā)明的具體設(shè)計特征包括例如具體尺寸、方向、位置和外形將部分地由具體所要應(yīng)用和使用的環(huán)境來確定。
[0023]在這些圖形中，貫穿附圖的多幅圖形，附圖標記引用本發(fā)明的同樣的或等同的部分。
【具體實施方式】
[0024]本發(fā)明提供的三維培養(yǎng)系統(tǒng)是利用含有培養(yǎng)基的凝膠構(gòu)建出腫瘤組織生長的支架。瘤組織固定于凝膠支架中，腫瘤組織塊自身構(gòu)成了與體內(nèi)完全一致的腫瘤組織生長微環(huán)境。而凝膠支架模擬并提供了腫瘤組織在體生長的條件。在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中，腫瘤細胞增殖并能夠遷移，排除了二維培養(yǎng)系統(tǒng)中的接觸抑制效應(yīng)，該系統(tǒng)中的腫瘤細胞生長，完全反應(yīng)了腫瘤細胞對干預措施的反應(yīng)(圖1)。
[0025] 實施例1、三維培養(yǎng)系統(tǒng)的建立
[0026]首先配制組織培養(yǎng)用凝膠:將1.5mL含表皮生長因子的促凝劑(Adittivel)加入12mL組織培養(yǎng)用基質(zhì)膠中，所述基質(zhì)膠含層黏連蛋白、膠原IV，成纖維細胞生長因子、組織纖維酶原活化因子，緩慢加入，邊加邊充分混勻，混合液為淡黃色清亮。將1.5mL含有酚酞的指示劑(Adittive2)加入混合液中，邊緩慢加入，邊混勻。剛加入時，可見局部溶液為粉紅色，混勻后成為淡黃色、清亮，各組份混勻后，配置成15mL組織培養(yǎng)凝膠。[0027]將配置好的凝膠加入48孔培養(yǎng)板中，每孔加入250uL凝膠。放置于超凈臺中，等待液態(tài)凝膠形成半透明狀。
[0028]提取手術(shù)切除的腫瘤組織標本，將組織放置于PBS溶液中，分離成0.5cm3大小組織塊。
[0029]將組織塊放置于半透明的凝膠中，置于孔正中，靜置，待組織培養(yǎng)凝膠形成不透明的膠凍狀。
[0030]12mL培養(yǎng)基中加入3mL胎牛血清。每個組織培養(yǎng)孔中加入250uL含胎牛血清的培養(yǎng)基。 [0031]實施例2、三維培養(yǎng)系統(tǒng)中化療藥物敏感性的檢測
[0032]利用培養(yǎng)基或PBS配制待測化療藥物，根據(jù)藥物說明書所示使用濃度，保持培養(yǎng)基體積與化療藥物體積比例大于100。
[0033]將腫瘤組織塊在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)24h、48h、72h、96h和120h，每天觀察細胞生長情況，并測量細胞遷移距離。
[0034]收集相關(guān)數(shù)據(jù)。統(tǒng)計分析不同藥物對腫瘤細胞生長和遷移的影響。
[0035]利用上述三維組織培養(yǎng)技術(shù)，我們對肝細胞肝癌組織對化療藥物敏感性進行研究(圖2)，初步結(jié)果顯示，該培養(yǎng)系統(tǒng)能夠反應(yīng)肝癌組織對不同化療藥物的敏感性。
【權(quán)利要求】
1.一種用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述三維培養(yǎng)系統(tǒng)含有作為腫瘤組織生長支架的凝膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述三維培養(yǎng)系統(tǒng)還含有培養(yǎng)基、促凝劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項所述的用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述三維培養(yǎng)系統(tǒng)進一步含有腫瘤組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述凝膠含有層黏連蛋白、膠原IV，成纖維細胞生長因子、組織纖維酶原活化因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述腫瘤組織固定于凝膠支架中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述腫瘤組織是肝癌組織。
7.一種建立用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)的方法，其包括步驟: a)配制液體凝膠與促凝劑的混合物； b)將配置好的凝膠混合物加入培養(yǎng)板中，等待液態(tài)凝膠形成半透明狀； c)將腫瘤組織塊放置于半透明的凝膠中，置于孔正中，靜置，待組織培養(yǎng)凝膠形成不透明的膠凍狀。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的用于腫瘤細胞培養(yǎng)的三維培養(yǎng)系統(tǒng)、或根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法制備的三維培養(yǎng)系統(tǒng)在化療藥物篩選中的用途。
【文檔編號】C12M3/00GK103756904SQ201410012583
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】趙海濤, 李光兵 申請人:趙海濤