用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)。進一步地，本發(fā)明涉及一種三維培養(yǎng)系統(tǒng)在肝癌化療藥物篩選中的用途。
【專利說明】用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)。進一步地，本發(fā)明涉及用于個體化地篩選肝癌化療藥物的三維培養(yǎng)系統(tǒng)。
【背景技術】
[0002]肝細胞肝癌是發(fā)病率高居第三位的惡性腫瘤。目前治愈肝細胞肝癌的有效方法。但是由于缺乏有效的早期診斷指標，多數(shù)肝癌診斷時已處于進展期，手術切除后肝癌復發(fā)，這些因素影響了肝癌治療的預后。經(jīng)肝動脈注射化療藥物或全身應用化療藥物有助于改善肝癌患者預后。由于個體化差異的存在，并非所有患者肝癌細胞均對傳統(tǒng)的化療方案中所用藥物敏感。如何在應用化療藥物前敏感性化療藥物，從而提高化療治療的預后，降低化療藥物所致副反應是肝癌治療中需要解決的問題。
[0003]目前肝癌化療治療僅根據(jù)化療方案計算不同個體所用化療藥物劑量或常用細胞培養(yǎng)技術篩選化療藥物。然而上述方法無發(fā)篩選出敏感性化療藥物，且體外細胞培養(yǎng)技術不能完美模擬腫瘤組織的體內(nèi)環(huán)境，無法做到個體化治療，在應用化療藥物前篩選出肝癌敏感性化療藥物。
[0004]為了克服現(xiàn)有技術中的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種用于篩選抗肝癌化療藥物的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，利用含有培養(yǎng)基的凝膠構建出腫瘤組織生長的支架。肝癌組織固定于凝膠支架中，肝癌組織塊自身構成了與體內(nèi)完全一致的腫瘤組織生長微環(huán)境。而凝膠支架模擬并提供了肝癌組織在體生長的條件。在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中，肝癌細胞增殖并能夠遷移，排除了二維培養(yǎng)系統(tǒng)中的接觸抑制效應，該系統(tǒng)中的肝癌細胞生長，完全反應了腫瘤細胞對干預措施的反應。
[0005]根據(jù)本發(fā)明提供的三維`培養(yǎng)系統(tǒng)與現(xiàn)有技術形比，具有以下優(yōu)點:
[0006]1、三維培養(yǎng)系統(tǒng)的建立為細胞和組織培養(yǎng)提供了一種三維立體的培養(yǎng)系統(tǒng)，更加符合細胞生長的生物學行為，可促進細胞的聚集，維持組織細胞的橢球形狀，并支持腫瘤細胞的正常生長。
[0007]2、本技術利用三維組織培養(yǎng)技術,完好的模擬活體環(huán)境。與傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)技術相t匕，三維組織培養(yǎng)技術，能夠模擬腫瘤組織的微環(huán)境，更加完美呈現(xiàn)腫瘤組織對化療藥物敏感性。
[0008]3、本系統(tǒng)采集手術切除的肝癌標本，針對每個個體，每種腫瘤的敏感性進行篩選。做到了個體化，最大程度增加化療敏感性，減輕化療藥物毒副作用。
[0009]4、本系統(tǒng)能夠用于干細胞培養(yǎng)及分化急性和慢性毒性試驗；藥物預測療效的篩選；血管生成試驗等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供了一種用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述三維培養(yǎng)系統(tǒng)含有作為肝癌組織生長支架的凝膠。[0011]特別地，根據(jù)本發(fā)明所述的用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述三維培養(yǎng)系統(tǒng)還含有培養(yǎng)基、促凝劑。
[0012]特別地，根據(jù)本發(fā)明提供的用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述三維培養(yǎng)系統(tǒng)進一步含有肝癌組織。
[0013]特別地，根據(jù)本發(fā)明提供的用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述肝癌組織固定于凝膠支架中。
[0014]另一方面，本發(fā)明提供了一種建立用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)的方法，其包括步驟:
[0015]a)配制液體凝膠與促凝劑的混合物；
[0016]b)將配置好的凝膠混合物加入培養(yǎng)板中，等待液態(tài)凝膠形成半透明狀；
[0017]c)將肝癌組織塊放置于半透明的凝膠中，置于孔正中，靜置，待組織培養(yǎng)凝膠形成不透明的膠凍狀。
[0018]另一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明所述的用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)、或本發(fā)明所述的方法制備的三維培養(yǎng)系統(tǒng)在肝癌化療藥物篩選中的用途。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1:肝癌組織三維培養(yǎng)，鏡下觀察不同處理組，肝癌細胞生長及細胞遷移情況，細胞遷移距離反應了肝癌細胞對化療藥物敏感性?；熕幬锩舾?，細胞遷移距離短。A為對照組，B-D為不同化療藥物處理組。
[0020]圖2A至圖2F利用三維培`養(yǎng)體系，篩選出不同患者肝癌組織敏感性化療藥物。其顯示不同肝癌患者肝癌組織在三維培養(yǎng)體系中培養(yǎng)后，應用比柔吡星(E)、氟尿嘧啶(F)、奧沙利鉬(P)、或比柔吡星聯(lián)合氟尿嘧啶(EF)、比柔吡星聯(lián)合奧沙利鉬(EP)、氟尿嘧啶聯(lián)合奧沙利鉬(FP)或三種化療藥物聯(lián)合應用(EFP)，肝癌細胞在三維培養(yǎng)體系中遷移的距離。
[0021]應當了解，所附附圖并非按比例地顯示了本發(fā)明的基本原理的圖示性的各種特征的略微簡化的畫法。本文所公開的本發(fā)明的具體設計特征包括例如具體尺寸、方向、位置和外形將部分地由具體所要應用和使用的環(huán)境來確定。
[0022]在這些圖形中，貫穿附圖的多幅圖形，附圖標記引用本發(fā)明的同樣的或等同的部分。
【具體實施方式】
[0023]本發(fā)明提供的三維培養(yǎng)系統(tǒng)是利用含有培養(yǎng)基的凝膠構建出肝癌組織生長的支架。肝癌組織固定于凝膠支架中，肝癌組織塊自身構成了與體內(nèi)完全一致的腫瘤組織生長微環(huán)境。而凝膠支架模擬并提供了腫瘤組織在體生長的條件。在三維培養(yǎng)系統(tǒng)中，肝癌細胞增殖并能夠遷移，排除了二維培養(yǎng)系統(tǒng)中的接觸抑制效應，該系統(tǒng)中的腫瘤細胞生長，完全反應了腫瘤細胞對干預措施的反應(圖1)。
[0024]實施例1、三維培養(yǎng)系統(tǒng)的建立
[0025]首先配制組織培養(yǎng)用凝膠:將1.5mL含表皮生長因子的促凝劑(Adittive I)加入12mL組織培養(yǎng)用基質膠中，所述基質膠含有層黏連蛋白、膠原IV，成纖維細胞生長因子、組織纖維酶原活化因子，緩慢加入，邊加邊充分混勻，混合液為淡黃色清亮。將1.5mL含有酚酞的指示劑(Adittive 2)加入混合液中，邊緩慢加入，邊混勻。剛加入時，可見局部溶液為粉紅色，混勻后成為淡黃色、清亮，各組份混勻后，配置成15mL組織培養(yǎng)凝膠。
[0026]將配置好的凝膠加入48孔培養(yǎng)板中，每孔加入250uL凝膠。放置于超凈臺中，等待液態(tài)凝膠形成半透明狀。
[0027]提取手術切除的肝癌組織標本，將組織放置于PBS溶液中，分離成0.5cm3大小組織塊。
[0028]將組織塊放置于半透明的凝膠中，置于孔正中，靜置，待組織培養(yǎng)凝膠形成不透明的膠凍狀。
[0029]12mL培養(yǎng)基中加入3mL胎牛血清。每個組織培養(yǎng)孔中加入250uL含胎牛血清的培養(yǎng)基。
[0030]實施例2、利用三維培養(yǎng)系統(tǒng)檢測肝癌組織對化療藥物的敏感性 [0031]利用培養(yǎng)基或PBS配制待測化療藥物，根據(jù)藥物說明書所示使用濃度，保持培養(yǎng)基體積與化療藥物體積比例大于100。
[0032]將腫瘤組織塊在培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)24h、48h、72h、96h和120h，每天觀察細胞生長情況，并測量細胞遷移距離。
[0033]收集相關數(shù)據(jù)。統(tǒng)計分析不同藥物對腫瘤細胞生長和遷移的影響。
[0034]我們利用上述三維組織培養(yǎng)技術，對肝細胞肝癌組織對化療藥物敏感性進行研究(圖 2A-2F)。
【權利要求】
1.一種用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述三維培養(yǎng)系統(tǒng)含有作為肝癌組織生長支架的凝膠。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述三維培養(yǎng)系統(tǒng)還含有培養(yǎng)基、促凝劑。
3.根據(jù)權利要求1或2任一項所述的用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述三維培養(yǎng)系統(tǒng)進一步含有肝癌組織。
4.根據(jù)權利要求1或3任一項所述的用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述凝膠含有層黏連蛋白、膠原IV，成纖維細胞生長因子、組織纖維酶原活化因子。
5.根據(jù)權利要求1-4任一項所述的用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于，所述肝癌組織固定于凝膠支架中。
6.一種建立用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)的方法，其包括步驟: a)配制液體凝膠與促凝劑的混合物； b)將配置好的凝膠混合物加入培養(yǎng)板中，等待液態(tài)凝膠形成半透明狀； c)將肝癌組織塊放置于半透明的凝膠中，置于孔正中，靜置，待組織培養(yǎng)凝膠形成不透明的膠凍狀。
7.根據(jù)權利要求1-5任一項所述的用于肝癌化療藥物篩選的三維培養(yǎng)系統(tǒng)、或根據(jù)權利要求6所述的方法制備的三維培`養(yǎng)系統(tǒng)在肝癌化療藥物篩選中的用途。
【文檔編號】C12M3/00GK103756903SQ201410012398
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月10日 優(yōu)先權日:2014年1月10日
【發(fā)明者】趙海濤, 楊曉波 申請人:趙海濤