一種高效表達(dá)α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種高效表達(dá)α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株，其保藏編號為CGMCC?No.8469。本發(fā)明通過紫外誘變的方法獲得的突變菌株黑曲霉Atm61能高效重組表達(dá)α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其發(fā)酵酶活高達(dá)14952U/mL，比出發(fā)菌提高了58%。該突變菌株黑曲霉Atm61表達(dá)的α-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，可廣泛應(yīng)用于低聚異麥芽糖漿的生產(chǎn)，能使轉(zhuǎn)苷效率提高40%～50%以上，獲得的異麥芽糖漿中異麥芽低聚糖的質(zhì)量體積比高達(dá)90%，市場前景廣闊。
【專利說明】一種高效表達(dá)Ct-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物誘變篩選【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高效異源表達(dá)a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉(Asperillus niger)菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶(a -transglucosidase E.C.2.4.1.24)能夠從低聚糖類底物的非還原性末端切開a-1、4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，或?qū)⒂坞x出的葡萄糖殘基以a_l、6糖苷鍵轉(zhuǎn)移到另一個糖類底物上，從而得到非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖(簡稱頂0，主要包括異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖及四糖以上的低聚糖)、糖脂或糖肽等。該酶既具有水解能力，又可以專一地進(jìn)行葡萄糖苷鍵的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，是生產(chǎn)低聚異麥芽糖的必需酶制劑之一。
[0003]a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶在自然界中分布廣泛，種類繁多，性質(zhì)各異，幾乎存在于所有生物體內(nèi)，在人類的糖原降解及動物、植物和微生物的糖類代謝方面具有重要的生理功能。a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶主要應(yīng)用于生產(chǎn)頂0，而MO是人類腸道有益菌群雙歧桿菌的增殖因子，攝入后不被人體消化吸收，也不易被大腸中的多數(shù)腐敗細(xì)菌所利用，卻能作為雙歧桿菌的碳源而被利用，具有促進(jìn)腸道有益菌群增值、潤腸通便、調(diào)節(jié)血脂、低甜度、低熱量等獨特功效，尤其是在促進(jìn)腸道有益菌群增值方面功效顯著。作為一種功能性食品原料，IMO已被廣泛用于各種食品的制造如乳制品、糖果類、焙烤食品等，居各種功能性低聚糖之首。[0004]目前工業(yè)上已經(jīng)有以淀粉或麥芽糖為原料，通過酶法生產(chǎn)低聚異麥芽糖的工藝，但是已有的生產(chǎn)工藝轉(zhuǎn)化率并不高。此外，雖然我國異麥芽糖產(chǎn)量很高，a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的用量很大，但卻一直沒有實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，該酶仍然依賴進(jìn)口，這些因素都極大制約了國內(nèi)低聚異麥芽糖的生產(chǎn)。因此，本領(lǐng)域亟需獲得高活性的a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶及其相應(yīng)的高產(chǎn)量的a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶生產(chǎn)菌株，以適應(yīng)低聚異麥芽糖生產(chǎn)工藝的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種高效表達(dá)a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株及其應(yīng)用，本發(fā)明通過紫外誘變的方式對異源表達(dá)a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉工程菌株進(jìn)行突變篩選，最終獲得一株穩(wěn)定性好、a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶產(chǎn)量高的黑曲霉突變株，為a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006]本發(fā)明一方面提供了一種a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
[0007]所述a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO: 2。
[0008]本發(fā)明另一方面提供了一株高效表達(dá)上述a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的黑曲霉Atm61(Aspergillus niger Atm61)，已于2013年11月12日保藏于北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，菌株保藏編號為 CGMCC N0.8469。
[0009]本發(fā)明所述黑曲霉Atm61在生產(chǎn)a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明通過紫外誘變的方法獲得的突變菌株黑曲霉Atm61能高效重組表達(dá)a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其發(fā)酵酶活高達(dá)14952U/mL，比出發(fā)菌提高了 58%。該突變菌株黑曲霉Atm61表達(dá)的a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，可廣泛應(yīng)用于低聚異麥芽糖漿的生產(chǎn)，能使轉(zhuǎn)苷效率提高40%~50%以上，獲得的異麥芽糖漿中異麥芽低聚糖的質(zhì)量體積比高達(dá)90%，市場前景廣闊。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1:pGm-At重組質(zhì)粒的遺傳圖譜；
[0012]圖2:突變菌株黑曲霉Atm61發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳檢測圖，其中泳道I所示為蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記，由上至下為116.0kD, 66.2kD，45.0kD, 35.0kD, 25.0kD, 18.4kDa和14.4kD;泳道2所示為出發(fā)菌株黑曲霉At3發(fā)酵上清液中蛋白表達(dá)情況；泳道3所示為突變菌株黑曲霉Atm61發(fā)酵上清液中蛋白表達(dá)情況,箭頭所指107kDa處的蛋白條帶即為重組表達(dá)的a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶；
[0013]圖3: a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的相對酶活與pH的曲線圖；
[0014]圖4: a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的相對酶活與溫度的曲線圖。
【具體實施方式】
[0015]本發(fā)明用到了在遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)等參考書中所記載的技術(shù)。但是,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以選用已公開的技術(shù)來實施本發(fā)明實施例中記載的方案，而不限于實施例中所限定述的具體方法和試劑。
[0016]本發(fā)明中，核酸是按5'至3'方向從左至右書寫；氨基酸是按氨基至羧基的方向從左至右書寫。
[0017]本發(fā)明說明書中記載的低`聚異麥芽糖和異麥芽低聚糖可互換使用，都指選自下組的一種或多種糖:異麥芽糖、異麥芽三糖、異麥芽四糖、或潘糖。此外，應(yīng)理解，所述的術(shù)語還包括上述糖的混合物。
[0018]本發(fā)明所記載的a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，又稱為a-D-葡萄糖苷水解酶，能切開麥芽糖和麥芽低聚糖分子結(jié)構(gòu)中a -1, 4糖苷鍵，并能將游離出來的一個葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個葡萄糖分子或麥芽糖或麥芽三糖等分子中的a -1, 6位上，其轉(zhuǎn)糖苷作用可將低聚糖中的a-l，4糖苷鍵轉(zhuǎn)化成a-1，6糖苷鍵或其他形式的鏈接，從而得到非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖或糖酯、糖肽等。
[0019]基因指參與生產(chǎn)多肽的DNA片段，包括編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域，以及各編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內(nèi)含子)。
[0020]核酸包括DNA、RNA,單鏈或雙鏈的，以及它們的化學(xué)修飾物；核酸與多核苷酸在本說明書中可以互換使用。
[0021]宿主菌株或宿主細(xì)胞是指表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物的合適宿主，所述表達(dá)載體或DNA構(gòu)建物包含本發(fā)明的編碼a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優(yōu)選地是絲狀真菌細(xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是野生型絲狀真菌宿主細(xì)胞或者經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”指由絲狀真菌菌株細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞核原生質(zhì)體。
[0022]絲狀真菌指所有絲狀形式的真菌亞門生物(參見INTRODUCTORY MYCOLOGY, 4thEd.(Alexopoulos,2007)和 AINSWORTH AND BISBY DICTIONARY OF THE FUNGI, IOthEd.(Kirk et al.，2008))。這些真菌的特征是帶有由幾丁質(zhì)、纖維素和其他復(fù)雜多糖組成的細(xì)胞壁的營養(yǎng)菌絲體。本發(fā)明所述的絲狀真菌在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)上不同于酵母。絲狀真菌的營養(yǎng)生長是通過菌絲的延伸來完成的，碳代謝是專性需氧的。在本發(fā)明中，絲狀真菌親代細(xì)胞可以使，但不限于，曲霉屬某種(Aspergillus sp.)(例如棒曲霉(A.clavatus)、煙曲霉(A.fumigatus)、泡盛曲霉(A.awamori)、黃曲霉(A.f Iavus)，土曲霉(A.terreus)和米曲霉(A.0ryzae))、青霉屬某種(Penicillium sp.)(例如產(chǎn)黃青霉(P.chrysogenum))、新薩托菌屬某種(Neosartorya sp.)(例如費希新薩托菌(N.fischeri))、粘帚霉菌屬某種(Gliocladium sp.)(例如粉紅粘帚霉(G.roseum))、木霉屬某種(Trichoderma sp.)(例如里氏木霉(T.reesei)、綠色木霉(T.viride)、康寧木霉(T.koningii)、哈茨木霉(T.harzianum))、腐質(zhì)霉屬某種(Humicola sp.)(例如特異腐質(zhì)霉(H.1nsolens)和灰腐質(zhì)霉(H.grisea))、金孢霉屬某種(Chrysosporium sp.)、鐮刀菌屬某種(Fusarium sp.)、脈孢霉屬某種(Neurospora sp.)、肉座菌屬某種(Hypocrea sp.)和裸孢殼屬某種(Emericella sp.)的細(xì)胞。
[0023]本發(fā)明所涉及的曲霉或曲霉屬某種是指以前或目前被分類為曲霉屬的任何真菌屬。
[0024]本發(fā)明中所述酶表達(dá)的分析方法和酶活測定方法如下:
[0025]為了評價a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的表達(dá)，可以在蛋白水平或核酸水平進(jìn)行分析。可以應(yīng)用的分析方法包括Northern印跡、斑點印跡(DNA或RNA分析)、Southern印跡、放射自顯影、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄酶聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和含有適當(dāng)標(biāo)記的探針(基于核酸編碼序列)進(jìn)行的原位雜交。此外，基因表達(dá)可以通過免疫學(xué)方法，諸如細(xì)胞、組織切片的免疫組織化學(xué)染色或者組織培養(yǎng)基的免疫試驗。例如通過Western印跡或ELISA來評估。這樣的免疫試驗可以用于定性地和定量地評 價a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶(諸如Atm61)的表達(dá)。此類方法的細(xì)節(jié)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且用于實施此類方法的許多試劑是可商業(yè)獲得的。在一些實施方式中，a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶(諸如Atm61)的表達(dá)通過SDS-PAGE進(jìn)行分析。
[0026]下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。在本發(fā)明中，百分比為重量百分比，除非特別說明。
[0027]實施例1出發(fā)菌株黑曲霉At3的構(gòu)建
[0028]按照制造商的說明書，使用真菌基因組DNA提取試劑盒(Omega)從土曲霉(Aspergillus terreus)過夜培養(yǎng)物中提取基因組DNA。根據(jù)NCBI上編號為XM_001210809的a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶基因序列設(shè)計PCR引物。用于克隆土曲霉中的At3基因的正向引物At3-F序列為 5’-CCATTACGTAATGGITGACATCACCGACCTTCTGG，反向引物 At3-R序列為 5’-CTGCTCTAGACTACCACTCCAGGACCCAGTCCTT，將該基因用 Phusion DNA聚合酶(Thermo scientific)從土曲霉基因組DNA中擴(kuò)增出來。
[0029]使用凝膠純化試劑盒(Fermentas)將上述PCR產(chǎn)物純化。用限制性內(nèi)切酶SnaBI和XbaI (Fermentas)對純化了的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切；同時，用限制性內(nèi)切酶SnaBI和XbaI對質(zhì)粒pGm進(jìn)行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產(chǎn)物純化,并用T4DNA連接酶(Fermentas)將上述兩個酶切產(chǎn)物連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)Trans5 a大腸桿菌(Transgen),用氨節(jié)青霉素進(jìn)行選擇。為確保準(zhǔn)確，對若干克隆進(jìn)行測序(Invitoogen)。測序結(jié)果顯示，本發(fā)明PCR擴(kuò)增得到的a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶基因片段的核苷酸序列為SEQ ID NO:2，編碼氨基酸序列為 SEQ ID NO:1。[0030]使用質(zhì)粒中量制備試劑盒(Axygen)從測序結(jié)果正確的大腸桿菌克隆中純化質(zhì)粒，將所得質(zhì)粒命名為PGm-At (質(zhì)粒圖譜見圖1)。
[0031]將上述純化得到的質(zhì)粒pGm-At通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入黑曲霉宿主菌Gl中，得到25個黑曲霉轉(zhuǎn)化子(分別命名為Atl，At2，At3，……，At25)。將所述25個轉(zhuǎn)化子的孢子懸浮液分別接種于20mL TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)5d ;將所得發(fā)酵液用8層紗布過濾；濾液在14000g條件下離心lOmin，收集上清液；將上清液在濃度為12%的SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳檢測分析，結(jié)果顯示本發(fā)明構(gòu)建得到的轉(zhuǎn)化子Atl、At3、At4、At5、At6、At9、At 10、At 13、At 14、At 15、At 18、Atl9、At20、At21、At23、At24、At25 在 107kD處都有明顯的蛋白條帶，與本發(fā)明所述a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶理論分子量一致，從而說明上述陽性轉(zhuǎn)化子均能重組表達(dá)a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶；挑選其中a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶蛋白表達(dá)量較高的陽性轉(zhuǎn)化子At3、At5、AtlO、Atl5、At20、At23，分別測定其發(fā)酵上清液的酶活，結(jié)果顯示，黑曲霉At3的發(fā)酵上清液酶活最高，達(dá)9413U/mL。
[0032]a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶活力測定方法
[0033]采用中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB2525-2001，將a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶作用于底物a-甲基-D-葡萄糖苷生成葡萄糖，所生成的葡萄糖與含有葡萄糖氧化酶、過氧化酶的4-氨基安替比林(4-Aminoantipyrin)和酹試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)來定量測定。
[0034]具體測定方法包括:吸取2% a -甲基-D-葡萄糖苷底物溶液Iml和0.02mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH5.0)lml加入試管(15mmX150mm)內(nèi)，在(50±0.5) °C的恒溫水浴箱中保溫lOmin。加入樣品酶液0.5ml，混勻，于(50±0.5)°C的恒溫水浴箱中準(zhǔn)確保溫60min后，將試管轉(zhuǎn)移至沸水浴中加熱5min,然后用流水快速冷卻。冷卻后,吸此溶液0.1ml到試管中，并加入4-氨基安替比林-苯酚顯色劑3ml，混勻。將此試管放入(40±0.5) °C的恒溫水浴中保溫20min，測定500nm處的吸光度，根據(jù)吸光度值計算a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的酶活力(U/ml),即在此試驗條件下,在反應(yīng)混合物2.5ml中，60min產(chǎn)生I y g葡萄糖所需的酶量定義為一個a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶活力單位。
[0035]TSB 發(fā)酵培養(yǎng)基:12g NaNO3,0.5g KCl, 1.5g KH2PO4, 2.05g MgSO4 ? 7H20，3.5gNaH2PO4 ? H20，45g胰蛋白大豆肉湯，70g檸檬酸鈉，Ig吐溫80，ImL痕量元素(見下)，加入dlH20至終體積700mL，高壓蒸氣滅菌后加入300mL用0.22 y m的微孔濾膜過濾除菌的40%
麥芽糖。
[0036]痕量兀素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4 ? 7H20,8.8g ZnSO4 ? 7H20,0.4gCuSO4 *5H20,0.15g MnSO4 *4H20,0.1g Na2B4O7 ? IOH2O, 50mg (NH4) 6Mo7024 ? 4H20，0.2mL 濃 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0.22 ii m的微孔濾膜過濾除菌。
[0037]實施例2:紫外誘變與篩選
[0038]2.1紫外誘變方法
[0039](I)將實施例1構(gòu)建得到的黑曲霉At3作為出發(fā)菌株，將其接種到CMA斜面上活化，在37°C下培養(yǎng)4d;
[0040](2)用3ml無菌的0.l%Tween-80洗滌At3新鮮斜面制得孢子懸液，吸取IOul置于血球計數(shù)板上計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果稀釋孢子懸液至孢子數(shù)目約為IO6個/ml左右；
[0041](3)吸取51111稀釋后的孢子懸液置于9cm培養(yǎng)皿中，在紫外燈30w、照射距離22cm、照射時間4min的條件下進(jìn)行紫外誘變；
[0042](4)紫外照射完畢后，將誘變后的孢子懸液稀釋100倍，吸取稀釋后的孢子懸液涂布CMA平板，每個CMA平板涂IOOul，約涂100個平板左右，在37°C下避光培養(yǎng)40h ；
[0043](5)培養(yǎng)40h后，挑取平板上長出的個體形態(tài)小、菌絲濃密且緊實的突變菌落，于另一 CMA平板上進(jìn)行劃線純化，劃線平板在37°C下培養(yǎng)40h ； [0044](5)挑出約100個劃線平板上長出的單菌落，接種至CMA斜面，在37°C下培養(yǎng)4天以上；
[0045]CMA平板:20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白胨，15g瓊脂，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0046]2.2突變菌株的篩選
[0047]1、初篩
[0048]根據(jù)CMA斜面上誘變菌株的生長情況，挑選長勢相近的誘變菌株分批進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，同時以出發(fā)菌株At3作對照。發(fā)酵采用一步搖瓶發(fā)酵法:將黑曲霉誘變菌株的孢子懸浮液分別接種于20mL TSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，每個菌株接I瓶，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)5d ；將所得發(fā)酵液用8層紗布過濾，濾液在14000 Xg條件下離心lOmin，收集上清液；將上清液在濃度為12%的SDS-PAGE膠上進(jìn)行電泳，通過觀察比較a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶重組蛋白條帶的表達(dá)量，挑選出16株比出發(fā)菌株At3表達(dá)效果好的突變菌株。
[0049]2、復(fù)篩
[0050]將挑選出的16株突變菌株再次進(jìn)行發(fā)酵表達(dá)，同時以出發(fā)菌株At3作對照。發(fā)酵采用兩步搖瓶發(fā)酵法:將黑曲霉誘變菌株的孢子懸浮液接種于20ml CLS發(fā)酵培養(yǎng)基中，在300C，200rpm的條件下培養(yǎng)48h ;然后按10%接種量，吸取2mlCSL培養(yǎng)液菌體接種于20mLTSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)5d ;將所得發(fā)酵液用8層紗布過濾，濾液在 14000 Xg 條件下離心 IOmin,收集上清液；用 Econo-PaclODG Columns (BO1-RAD)對上清液進(jìn)行脫鹽除糖處理；然后將其進(jìn)行12%SDS-PAGE檢測分析并測定酶活；最終挑選出一株a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶表達(dá)量最高的突變菌株，命名為黑曲霉Atm61 (Aspergillus nigerAtm61)，并于2013年11月12日保藏于北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，菌株保藏編號為CGMCC N0.8469。
[0051]所用到額CSL發(fā)酵培養(yǎng)基的一種配比如下:100g玉米漿，IgNaH2PO4 ? H20,0.5gMgSO4, 100g麥芽糖，IOg葡萄糖，50g果糖，加入dlH20至900mL，用固體NaOH顆粒調(diào)pH5.8后定容至1L，高壓蒸氣滅菌。
[0052]實施例4:突變菌株黑曲霉Atm61的搖瓶發(fā)酵驗證
[0053]將突變菌株黑曲霉Atm61 (CGMCC N0.8469)和出發(fā)菌株黑曲霉At3同時接種到CMA平板上培養(yǎng)4-5d，取其各自孢子懸浮液分別接種于20ml CLS發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)48h ;然后按10%接種量，吸取2ml CSL培養(yǎng)液菌體分別接種于20mLTSB發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30°C，200rpm的條件下培養(yǎng)5d，分別收集黑曲霉Atm61和黑曲霉At3的發(fā)酵上清液；用Econo-PaclODG Columns (BO1-RAD)對上清液進(jìn)行脫鹽除糖處理；然后將其進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測分析，結(jié)果如圖2所示，兩株菌在107kDa處均有明顯的蛋白條帶，說明本發(fā)明獲得的突變菌株黑曲霉Atm61也能重組表達(dá)a轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶；酶活測定結(jié)果顯示，出發(fā)菌黑曲霉At3的發(fā)酵酶活為9492U/mL，而突變株黑曲霉Atm61的發(fā)酵酶活高達(dá)14952U/mL，比出發(fā)菌提高了 58%。
[0054]實施例4:酶學(xué)性質(zhì)分析
[0055]用pH值為 2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0、11.0 的緩沖液稀釋實施例 3
所述出發(fā)菌和突變菌的發(fā)酵上清液，分別測定其酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活，做作用PH-相對酶活曲線。結(jié)果如圖3所示，本發(fā)明的突變株黑曲霉Atm61表達(dá)的a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶與出發(fā)菌相比，作用PH-相對酶活曲線并未發(fā)生變化，最適作用pH值均為5.0。
[0056]分別在30°c、40°c、5(rc、6(rc、7(rc、8(rc、9(rc，PH5.0 條件下測定實施例 3 所述出發(fā)菌和突變菌發(fā)酵上清液酶活，以最高酶活為100%，計算相對酶活，做溫度-相對酶活曲線。結(jié)果如圖4所示，本發(fā)明的突變株黑曲霉Atm61表達(dá)的a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶與出發(fā)菌相比，作用溫度-相對酶活曲線并未發(fā)生變化，最適作用溫度均為50°C。
[0057]上述結(jié)果表明，本發(fā)明獲得的突變株黑曲霉Atm61的突變并未引起其表達(dá)的a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)發(fā)生失活突變。
[0058]實施例5 a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶在生產(chǎn)低聚異麥芽糖漿中的應(yīng)用
[0059]工業(yè)生產(chǎn)低聚異麥芽糖漿，以淀粉為原料，加水制成30%粉漿，在pH值為6.0、溫度為90~120°C條件下，經(jīng)耐熱性a淀粉酶液化后，在pH值為5.0、溫度為60°C的條件下，用@淀粉酶、普魯蘭酶和真菌a淀粉酶同時作用，轉(zhuǎn)化成麥芽糖；然后加入本發(fā)明所述突變株黑曲霉Atm61表達(dá)的a -轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶進(jìn)行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，生成異麥芽糖、異麥芽三糖、四糖及五糖等含a-1，6鍵的分支低聚糖與潘糖。分析結(jié)果表明，本發(fā)明所述a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶可使其轉(zhuǎn)化率明顯提高40%~50%以上。
`[0060]將上述轉(zhuǎn)苷反應(yīng)的產(chǎn)物經(jīng)活性炭脫色、離子交換樹脂脫鹽，濃縮到固形物質(zhì)量體積比為75%，即得到普通異麥芽糖漿，其中異麥芽低聚糖的質(zhì)量體積比為40%~50%，葡萄糖的質(zhì)量體積比為40%;再將異麥芽糖漿中的葡萄糖用酵母發(fā)酵或膜過濾除去，便可得到含異麥芽低聚糖的質(zhì)量體積比為90%的產(chǎn)品。
[0061]上述結(jié)果表明本發(fā)明所述突變菌株黑曲霉Atm61表達(dá)的a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，可廣泛應(yīng)用于低聚異麥芽糖漿的生產(chǎn)。
【權(quán)利要求】
1.一種a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:1。
2.如權(quán)利要求1所述的a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶，其特征在于，所述的a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
3.一株黑曲霉，其特征在于，所述的黑曲霉的保藏編號為CGMCC N0.8469。
4.權(quán)利 要求3所述的黑曲霉在生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的a-轉(zhuǎn)移葡萄糖苷酶中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/14GK103695383SQ201310692982
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月16日
【發(fā)明者】王華明, 訾禎禎 申請人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司, 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所