一種促進骨髓再生的Endomucin抗體藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種促進骨髓再生的Endomucin抗體藥物，公開了Endomucin對造血細胞的增殖、分化具有負調(diào)控作用，即對骨髓恢復、再生具有抑制作用，而Endomucin抗體可以削弱這種抑制作用，促進骨髓造血功能的恢復。采用骨髓瘤細胞融合技術(shù)制備Endomucin單克隆抗體，制成藥物制劑，對5-Fu化療的小鼠進行治療，能夠促進骨髓細胞的恢復、再生，可以顯著提高化療小鼠的生存率，對骨髓再生功能具有明顯的促進作用。Endomucin在調(diào)控骨髓造血功能方面的功能，具有巨大的潛在臨床應用和研究價值。
【專利說明】—種促進骨髓再生的Endomucin抗體藥物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種促進骨髓再生的Endomucin抗體藥物，具有促進骨髓受損后的恢復和再生的功能，屬于生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)在，放射治療和化學藥物治療仍是治療腫瘤和防止腫瘤復發(fā)的主要手段，其主要毒、副作用之一是損傷患者的骨髓系統(tǒng)，造成骨髓造血和免疫功能抑制，導致患者出現(xiàn)貧血、出血、感染、甚至危及生命的現(xiàn)象，嚴重影響了療效，經(jīng)常導致治療的失敗。因此，如何能有效的促進腫瘤患者自身骨髓的造血功能恢復、再生具有非常重要的意義。
[0003]放、化療對骨髓造成的損傷包括造血干細胞和由骨髓間充質(zhì)細胞組成的造血微環(huán)境。目前已經(jīng)上市的粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)、促紅細胞生成素(EP0)、和白介素-11 (IL-1l)等藥物都具有很大的局限性，其靶細胞主要是已經(jīng)定向分化的造血祖細胞，而不是作為造血源頭細胞的造血干細胞。這些藥物只作用于增生期的造血祖細胞，只能暫時性提高血細胞數(shù)量，如果骨髓造血干細胞和造血微環(huán)境長期得不到改善，不但無效，還可能加速骨髓造血功能的衰竭。目前，臨床上還沒有用于促進造血干細胞自我更新和促進受損骨髓間充質(zhì)細胞再生修復的藥物。
[0004]造血干細胞是一群具有自我更新能力和多向分化潛能的原始造血細胞，具備高度的自我更新能力，可分化生成所有類型的血細胞。單個造血干細胞就可以重建個體的造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，這種巨大的造血重建潛能每年能挽救45000人的生命。
[0005]本發(fā)明涉及的“Endomucin ”為造血干細胞膜表面的一個受體蛋白分子。在國內(nèi)外，Endomucin在骨髓造血的功能方面的研究尚未見報道。`
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明公開了一種促進骨髓再生的Endomucin抗體藥物，其目的是提出作為造血干細胞膜表面的受體蛋白的Endomucin，在放、化療骨髓的恢復、再生過程中的抑制功能，進而制備能夠促進骨髓再生的Endomucin單克隆抗體藥物。
[0007]本發(fā)明提供了 Endomucin在制備促進骨髓再生的抗體藥物中的用途。
[0008]本發(fā)明進一步公開了促進骨髓再生的Endomucin抗體藥物,其特征在于:
無色透明溶液的劑型，每支Endomucin抗體劑量為20mg/mL,含140mM NaCl, 0.5mM
EDTA,pH7.4。
[0009]本發(fā)明公開了促進骨髓再生的Endomucin抗體藥物的制備方法，包括以下步驟:
I)Endomucin基因的克隆、蛋白表達與純化
采用基因合成的方法制備人Endomucin基因，將人Endomucin全長基因分別克隆到PGEX-2T載體中，使目的基因接到谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因后面，以GST-Endomucin融合蛋白的形式在大腸桿菌BL21(DE3)中實現(xiàn)了高效表達；然后應用ant1-GST的親和層析介質(zhì)Glutathione - Sepharose對GST-Endomucin融合蛋白進行純化，采用凝血酶切下GST肽段，獲得純度超過98%的人Endomucin蛋白；
2)Endomucin單克隆抗體的制備與純化
①抗原免疫:選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照0、7天、14天、28天的免疫方案,每次將0.5mL, 20mg的人Endomucin蛋白抗原注射免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞；
②細胞融合:在免疫結(jié)束后的第14天，采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備IOmL脾細胞懸液；將準備好的SP20骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按1:2比例混合，并加入10%的促融合劑聚乙二醇；使各種淋巴細胞與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞；
③雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化:在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌人Endomucin單克隆抗體的細胞能夠生長，用有限稀釋法在96孔細胞培養(yǎng)板上進行雜交瘤細胞的篩選和克隆化培養(yǎng)，應 用ELISA方法篩選出能產(chǎn)生Endomucin單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞；在TlOO細胞培養(yǎng)瓶中進行雜交瘤細胞的克隆擴增，培養(yǎng)條件為37°C，5%C02,然后取IOmL細胞混懸液轉(zhuǎn)入850 mL羅氏瓶中進一步擴增，最后向收獲的細胞培養(yǎng)液中加入20% 二甲基亞砜，在液氮中對雜交瘤細胞株進行凍存；④單克隆抗體的大量制備:應用CelliGen Plus生物反應器,工作容積14升罐體中間填裝200g的聚酯片載體Cytodex I ；聚酯片載體Cytodex I是由50%聚酯纖維和50%聚丙烯制備的直徑為6mm的小圓盤，比表面積為120mm2/mm3 ;攪拌和通氣在固定床的上方，在攪拌中產(chǎn)生負壓，促使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)聚酯片載體Cytodex I，以利于營養(yǎng)物質(zhì)和氣體的傳遞；采用連續(xù)灌流方式對雜交瘤細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基是⑶雜交瘤細胞培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為:溫度37°C，pH7.2，攪拌速度60-80rpm，溶氧40-50%，接種細胞密度2-3X 105/mL，四氣混合系統(tǒng)供氣(氧氣、空氣、氮氣、二氧化碳)；在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細胞產(chǎn)生單克隆抗體并分泌到細胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)21天后收集細胞培養(yǎng)液，應用Contifuge Stratos連續(xù)流離心機進行連續(xù)流離心處理,在4°C、12000rpm條件下離心去除細胞及其碎片，流速80mL/min,離心收獲的上清液是含有人Endomucin單克隆抗體的細胞培養(yǎng)上清液；
⑤單克隆抗體的純化:
應用AKTA Explorer 100蛋白純化系統(tǒng)進行人Endomucin單克隆抗體的親和層析純化；親和層析柱的介質(zhì)為Mabselect Sure,將人Endomucin單克隆抗體的細胞培養(yǎng)上清液進行親和層析柱純化；柱層析純化的流速是5mL/min,以20mM, pH7.4的磷酸鹽緩沖液作為平衡柱緩沖液和上樣緩沖液，以4個柱體積(CV)的平衡緩沖液平衡Mabselect Sure柱后，將離心收獲的含有人Endomucin單克隆抗體的細胞培養(yǎng)上清液調(diào)整為pH7.4后直接上柱，上樣量約是10CV，上樣結(jié)束后以約2CV的平衡緩沖液洗凈未結(jié)合的蛋白；以20mM，pH4.0的檸檬酸緩沖液洗脫并收獲Endomucin單克隆抗體，然后以0.1N NaOH沖洗層析柱4CV，清洗柱中的雜蛋白和再生介質(zhì)，以20%乙醇沖洗層析柱2CV保存柱子；通過一步親和層析柱純化收獲純度超過95%的人Endomucin單克隆抗體；將純化收獲的人Endomucin單克隆抗體溶液應用Centramate Cassette超濾器進行超濾濃縮和溶液置換,采用截留分子量10000道爾頓的膜包，超濾緩沖液為pH7.4，140mM NaCl, 0.5mM EDTA,將Endomucin抗體溶液體系置換為pH7.4，140mM NaCl, 0.5mM EDTA,按照終濃度20mg/mL進行稀釋配制，制備人Endomucin單克隆抗體制劑。
[0010]本發(fā)明采用經(jīng)典的5-氟尿嘧啶(5-FU)化療小鼠的骨髓損傷和再生模型，應用基因芯片技術(shù)對化療后小鼠骨髓細胞基因表達譜的變化進行分析。Endomucin基因的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象，表達量最高相差11倍以上，與具有調(diào)控造血功能的已知基因(如⑶34、Kit ligand)具有相同的變化規(guī)律?？寺×巳薊ndomucin基因，通過基因疫苗的模式在正常小鼠體內(nèi)實現(xiàn)Endomucin基因過表達，發(fā)現(xiàn)實驗組骨髓細胞數(shù)量與對照組比較提高了 2倍，有顯著性差異。在小鼠血清中檢測到效價為1:10000的Endomucin抗體，將該小鼠的血清注射5-Fu化療的小鼠，可以顯著促進小鼠骨髓細胞和外周血白細胞、血小板的數(shù)量的增多和恢復。表達、純化了 Endomucin蛋白，在此基礎(chǔ)上制備Endomucin單克隆抗體，應用該抗體藥物可以顯著性提高小鼠對5-Fu的耐受能力和5-Fu后的生存能力。
[0011]5-Fu是尿嘧啶類似物，是通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶來阻斷脫氧尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣叵汆奏ず塑账?，從而抑制DNA的生物合成，是細胞周期特異性細胞毒藥物，在細胞周期的S期被摻入到DNA中導致細胞死亡，所以5-Fu能選擇性殺傷快速增殖的造血細胞，然而增殖緩慢和分化成熟的細胞對5-Fu不敏感。Endomucin對造血細胞的增殖、分化具有負調(diào)控作用，即對骨髓恢復、再生具有抑制作用。在5-Fu損傷作用下，基因表達量迅速提高使造血干細胞保持在Gtl期，不進入S期以應對5-Fu對細胞的殺傷。當骨髓造血進入恢復期后，它們的表達量下降以促進造血干細胞進入S期，增殖并分化成各種血細胞。而Endomucin抗體可以拮抗這種抑制作用，從而促進骨髓造血功能的恢復。
[0012]本發(fā)明的積極效果在于:
提供了 Endomucin對造血細胞的增殖、分化具有負調(diào)控作用，即對化療后受損傷骨髓的恢復、再生過程具有抑制作用，而Endomucin抗體可以拮抗這種抑制作用，促進骨髓造血功能的恢復。采用骨髓瘤細胞融合技術(shù)制備Endomucin單克隆抗體,制成藥物制劑，對5_Fu化療的小鼠進行治療，能夠促進骨髓細胞和外周血細胞的恢復、再生，可以顯著提高化療小鼠的生存率，對骨髓再生功 能具有明顯的促進作用。Endomucin在調(diào)控骨髓造血功能方面的機制，具有巨大的潛在臨床應用和研究價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為5-Fu化療小鼠骨髓細胞數(shù)量的變化圖；
圖2為5-Fu化療小鼠外周血白細胞數(shù)量的變化圖；
圖3為5-Fu化療小鼠外周血血小板數(shù)量的變化圖。
【具體實施方式】
[0014]實施例1
I)Endomucin基因的克隆、蛋白表達與純化
采用基因合成的方法制備人Endomucin基因(Genebank編號:AF205940)，將人Endomucin全長基因分別克隆到pGEX_2T載體中，使目的基因接到谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因后面，以GST-Endomucin融合蛋白的形式在大腸桿菌BL21(DE3)中實現(xiàn)了高效表達。人Endomucin蛋白的表達量占菌體總蛋白的33%。然后應用ant1-GST的親和層析介質(zhì)Glutathione-Sepharose對GST-Endomucin融合蛋白進行純化,采用凝血酶切下GST肽段，獲得純度超過98%的人Endomucin蛋白。
[0015]2)人Endomucin免疫小鼠血清對骨髓造血的促進作用將人Endomucin蛋白肌肉注射小鼠，每支注射10ug，分別在ld，14d, 28d注射3次后，應用摘眼球法采集小鼠血液，37度放置30分鐘后，3000rpm離心20分鐘，收集離心上清液獲得人Endomucin免疫小鼠血清。
[0016]將5_Fu(200mg/kg)尾靜脈注射Balb/c小鼠，然后注射100 ii L人Endomucin免疫小鼠血清，連續(xù)注射5天，監(jiān)測14天內(nèi)骨髓細胞數(shù)量、外周血白細胞和血小板數(shù)量的變化。與對照組比較:
a.實驗組骨髓細胞數(shù)量在第11天和第14天明顯提高(圖1)，有顯著性差異(p〈0.01)，并且在第11天已經(jīng)恢復到化療前的水平，較對照組提前了 3天。
[0017]b.實驗組的外周血白細胞數(shù)量在第11天和第14天明顯提高(圖2)，有顯著性差異(p〈0.01);并且在第11天已經(jīng)接近恢復到化療前的水平。
[0018]c.實驗組的外周血血小板數(shù)量在第11天明顯提高(圖3)，與對照組有顯著性差異(p〈0.01);對照組在第11天也接近恢復到化療前的水平。
[0019]上述結(jié)果表明，人Endomucin免疫小鼠血清有助于5_Fu化療小鼠骨髓細胞和外周血細胞的提前恢復，化療后第14天的骨髓細胞、外周血白細胞和血小板的數(shù)量較對照組也明顯升高。受損后的骨髓造血功能得到了恢復。(參見圖廣3)
3)Endomucin單克隆抗體的制備與純化
①抗原免疫:選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照0、7天、14天、28天的免疫方案,每次將0.5mL, 20mg的人Endomucin蛋白抗原注射免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞。
[0020]②細胞融合:在免疫結(jié)束后的第14天，采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備IOmL脾細胞懸液。將準備好的SP20骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按1:2比例混合，并加入10%的促融合`劑聚乙二醇。使各種淋巴細胞與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞。
[0021 ] ③雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化:在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌人Endomucin單克隆抗體的細胞能夠生長，用有限稀釋法在96孔細胞培養(yǎng)板上進行雜交瘤細胞的篩選和克隆化培養(yǎng)，應用ELISA方法篩選出能產(chǎn)生Endomucin單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞。在T100細胞培養(yǎng)瓶中進行雜交瘤細胞的克隆擴增，培養(yǎng)條件為370C , 5%C02,然后取IOmL細胞混懸液轉(zhuǎn)入850 mL羅氏瓶中進一步擴增，最后向收獲的細胞培養(yǎng)液中加入20% 二甲基亞砜，在液氮中對雜交瘤細胞株進行凍存。④單克隆抗體的大量制備:應用CelliGen Plus生物反應器(美國NBS公司)，工作容積14升罐體中間填裝200g的聚酯片載體Cytodex I (美國NBS公司)。聚酯片載體Cytodex I是由50%聚酯纖維和50%聚丙烯制備的直徑為6mm的小圓盤，比表面積為120mm2/mm3。攪拌和通氣在固定床的上方，在攪拌中產(chǎn)生負壓，促使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)聚酯片載體Cytodex I，以利于營養(yǎng)物質(zhì)和氣體的傳遞。采用連續(xù)灌流方式對雜交瘤細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基是Gibco公司的CD雜交瘤細胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為:溫度37°C，pH7.2，攪拌速度60-80rpm，溶氧40-50%，接種細胞密度2-3X 105/mL,四氣混合系統(tǒng)供氣(氧氣、空氣、氮氣、二氧化碳)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細胞產(chǎn)生單克隆抗體并分泌到細胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)21天后收集細胞培養(yǎng)液，應用ContifugeStratos連續(xù)流離心機(美國Thermo Fisher公司)進行連續(xù)流離心處理,在4°C、12000rpm條件下離心去除細胞及其碎片，流速80mL/min,離心收獲的上清液是含有人Endomucin單克隆抗體的細胞培養(yǎng)上清液。[0022]⑤單克隆抗體的純化:
應用AKTA Explorer 100蛋白純化系統(tǒng)(美國GE公司)進行人Endomucin單克隆抗體的親和層析純化。親和層析柱的介質(zhì)為Mabselect Sure (美國GE公司),將人Endomucin單克隆抗體的細胞培養(yǎng)上清液進行親和層析柱純化。柱層析純化的流速是5mL/min,以20mM, pH7.4的磷酸鹽緩沖液作為平衡柱緩沖液和上樣緩沖液，以4個柱體積(CV)的平衡緩沖液平衡Mabselect Sure柱后,將離心收獲的含有人Endomucin單克隆抗體的細胞培養(yǎng)上清液調(diào)整為PH7.4后直接上柱，上樣量約是10CV，上樣結(jié)束后以約2CV的平衡緩沖液洗凈未結(jié)合的雜蛋白。以20mM，pH4.0的檸檬酸緩沖液洗脫并收獲Endomucin單克隆抗體,然后以
0.1N NaOH沖洗層析柱4CV，清洗柱中的雜蛋白和再生介質(zhì)，以20%乙醇沖洗層析柱2CV保存柱子。通過一步親和層析柱純化收獲純度超過95%的人Endomucin單克隆抗體。將純化收獲的人Endomucin單克隆抗體溶液應用Centramate Cassette超濾器(美國PALL公司)進行超濾濃縮和溶液置換，采用截留分子量10000道爾頓的膜包，超濾緩沖液為pH7.4，140mMNaCl, 0.5mM EDTA,將 Endomucin 抗體溶液體系置換為 pH7.4，140mM NaCl, 0.5mM EDTA,按照終濃度20mg/mL進行稀釋配制,制備人Endomucin單克隆抗體制劑。
[0023]試驗例1:
Endomucin單克隆抗體對5_Fu化療小鼠的保護作用
根據(jù)5-Fu注射后小鼠骨髓和外周血的抑制、恢復情況，在注射后第7天骨髓抑制最嚴重，至第11天之后得到部分恢復；而大部分小鼠的死亡情況也出現(xiàn)在第7天左右，超過第11天即度過危險期。
[0024]對注射亞致死劑量5-Fu (280mg/kg)進行化療的小鼠做分組，治療組和對照組各20只小鼠，對照組未做處理，治療組應用人Endomucin單克隆抗體進行治療，在小鼠注射5-Fu后連續(xù)5天皮下注射0.2mL抗體(10mg/mL)。統(tǒng)計小鼠的死亡情況，對照組的小鼠從5-Fu注射后第7天開始出現(xiàn)死亡情況，至第12天共有17只小鼠死亡，僅有3只小鼠健存，存活率15% ;而治療組至第十二天只有5只小鼠死亡,有15只小鼠健存,存活率75%,死亡率從85%提高到25% ;治療組與對照組比較有顯著性差異(p < 0.01)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠的平均生存時間為8.8天，治療組小鼠的平均生存時間> 12天，與對照組比較有顯著性差異(P < 0.01)。實驗結(jié)果表明,Endomucin單克隆抗體可以提高小鼠對5_Fu化療藥物的耐受劑量，Endomucin抗體對小鼠骨髓造血恢復、再生具有促進作用。
[0025]試驗例2:
Endomucin單克隆抗體對5_Fu化療小鼠的保護作用
根據(jù)5-Fu注射后小鼠骨髓和外周血的抑制、恢復情況，在注射后第7天骨髓抑制最嚴重，至第11天之后得到部分恢復；而大部分小鼠的死亡情況也出現(xiàn)在第7天左右，超過第11天即度過危險期。
[0026]對注射亞致死劑量5-Fu (280mg/kg)進行化療的小鼠做分組，治療組和對照組各20只小鼠，對照組未做處理，治療組應用人Endomucin單克隆抗體進行治療，在小鼠注射5-Fu后連續(xù)5天皮下注射0.4mL抗體(10mg/mL)。統(tǒng)計小鼠的死亡情況,對照組的小鼠從5-Fu注射后第7天開始出現(xiàn)死亡情況，至第12天共有18只小鼠死亡，僅有2只小鼠健存，存活率10% ;而治療組至第十二天只有3只小鼠死亡，有17只小鼠健存，存活率85%，死亡率從90%提高到15% ;治療組與對照組比較有顯著性差異(p < 0.01)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠的平均生存時間為8.6天，治療組小鼠的平均生存時間> 12天，與對照組比較有顯著性差異(P <0.01)。實驗結(jié)果表明,Endomucin單克隆抗體可以提高小鼠對5-Fu化療藥物的耐受劑量，Endomucin抗體對小鼠骨髓造血恢復、再生具有促進作用。
[0027]試驗例3:
Endomucin單克隆抗體對5_Fu化療小鼠的保護作用
根據(jù)5-Fu注射后小鼠骨髓和外周血的抑制、恢復情況，在注射后第7天骨髓抑制最嚴重，至第11天之后得到部分恢復；而大部分小鼠的死亡情況也出現(xiàn)在第7天左右，超過第11天即度過危險期。
[0028]對注射亞致死劑量5-Fu (280mg/kg)進行化療的小鼠做分組，治療組和對照組各20只小鼠，對照組未做處理，治療組應用人Endomucin單克隆抗體進行治療，在小鼠注射5-Fu后連續(xù)5天皮下注射0.6mL抗體(10mg/mL)。統(tǒng)計小鼠的死亡情況,對照組的小鼠從5-Fu注射后第7天開始出現(xiàn)死亡情況，至第12天共有18只小鼠死亡，僅有2只小鼠健存，存活率10% ;而治療組至第十二天只有4只小鼠死亡,有16只小鼠健存,存活率80%,死亡率從90%提高到20% ;治療組與對照組比較有顯著性差異(p < 0.01)。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠的平均生存時間為8.3天，治療組小鼠的平均生存時間> 12天，與對照組比較有顯著性差異(P <0.01)。實驗結(jié)果表明,Endomucin單克隆抗體可以提高小鼠對5-Fu化療藥物的耐受劑量，Endomucin抗體對小鼠骨髓造血恢復、再生具有促進作用。
[0029]本發(fā)明藥物的表征為:無色透明溶液的劑型，每支Endomucin抗體劑量為20mg/mL,含 140mM NaCl, 0.5mM` EDTA, pH7.4。
【權(quán)利要求】
1.Endomucin在制備促進骨髓再生的抗體藥物中的用途。
2.一種促進骨髓再生的Endomucin抗體藥物,其特征在于: 無色透明溶液的劑型，每支Endomucin抗體劑量為20mg/mL,含140mM NaCl, 0.5mMEDTA，pH7.4。
3.一種促進骨髓再生的Endomucin抗體藥物的制備方法，包括以下步驟: 1)Endomucin基因的克隆、蛋白表達與純化 采用基因合成的方法制備人Endomucin基因，將人Endomucin全長基因分別克隆到PGEX-2T載體中，使目的基因接到谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)基因后面，以GST-Endomucin融合蛋白的形式在大腸桿菌BL21(DE3)中實現(xiàn)了高效表達；然后應用ant1-GST的親和層析介質(zhì)Glutathione-Sepharose對GST-Endomucin融合蛋白進行純化，采用凝血酶切下GST肽段，獲得純度超過98%的人Endomucin蛋白； 2)Endomucin單克隆抗體的制備與純化 ①抗原免疫:選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照0、7天、14天、28天的免疫方案,每次將0.5mL, 20mg的人Endomucin蛋白抗原注射免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細胞； ②細胞融合:在免疫結(jié)束后的第14天，采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備IOmL脾細胞懸液；將準備好的SP20骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按1:2比例混合，并加入10%的促融合劑聚乙二醇；使各種淋巴細胞與骨髓瘤細胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細胞； ③雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化:在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤細胞，只有少數(shù)是分泌人Endomucin單克隆抗體的細胞能夠生長，用有限稀釋法在96孔細胞培養(yǎng)板上進行雜交瘤細胞的篩選和克隆化培養(yǎng)，應用ELISA方法篩選出能產(chǎn)生Endomucin單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞；在TlOO細胞培養(yǎng)瓶中進行雜交瘤細胞的克隆擴增，培養(yǎng)條件為37°C，5%C02,然后取IOmL細胞混懸液轉(zhuǎn)入850 mL羅氏瓶中進一步擴增，最后向收獲的細胞培養(yǎng)液中加入20% 二甲基亞砜，在液氮中對雜交瘤細胞株進行凍存；④單克隆抗體的大量制備:應用CelliGen Plus生物反應器,工作容積14升罐體中間填裝200g的聚酯片載體Cytodex I ；聚酯片載體Cytodex I是由50%聚酯纖維和50%聚丙烯制備的直徑為6mm的小圓盤，比表面積為120mm2/mm3 ;攪拌和通氣在固定床的上方，在攪拌中產(chǎn)生負壓，促使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)聚酯片載體Cytodex I，以利于營養(yǎng)物質(zhì)和氣體的傳遞；采用連續(xù)灌流方式對雜交瘤細胞進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基是⑶雜交瘤細胞培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為:溫度37°C，pH7.2，攪拌速度60-80rpm，溶氧40-50%，接種細胞密度2-3X 105/mL，四氣混合系統(tǒng)供氣(氧氣、空氣、氮氣、二氧化碳)；在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細胞產(chǎn)生單克隆抗體并分泌到細胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)21天后收集細胞培養(yǎng)液，應用Contifuge Stratos連續(xù)流離心機進行連續(xù)流離心處理,在4°C、12000rpm條件下離心去除細胞及其碎片，流速80mL/min,離心收獲的上清液是含有人Endomucin單克隆抗體的細胞培養(yǎng)上清液； ⑤單克隆抗體的純化: 應用AKTA Explorer 100蛋白純化系統(tǒng)進行人Endomucin單克隆抗體的親和層析純化；親和層析柱的介質(zhì)為Mabselect Sure,將人Endomucin單克隆抗體的細胞培養(yǎng)上清液進行親和層析柱純化；柱層析純化的流速是5mL/min,以20mM, pH7.4的磷酸鹽緩沖液作為平衡柱緩沖液和上樣緩沖液，以4個柱體積(CV)的平衡緩沖液平衡Mabselect Sure柱后，將離心收獲的含有人Endomucin單克隆抗體的細胞培養(yǎng)上清液調(diào)整為pH7.4后直接上柱，上樣量約是10CV，上樣結(jié)束后以約2CV的平衡緩沖液洗凈未結(jié)合的雜蛋白；以20mM，pH4.0的檸檬酸緩沖液洗脫并收獲Endomucin單克隆抗體，然后以0.1N NaOH沖洗層析柱4CV，清洗柱中的雜蛋白和再生介質(zhì)，以20%乙醇沖洗層析柱2CV保存柱子；通過一步親和層析柱純化收獲純度超過95%的人Endomucin單克隆抗體；將純化收獲的人Endomucin單克隆抗體溶液應用Centramate Cassette超濾器進行超濾濃縮和溶液置換,采用截留分子量10000道爾頓的膜包，超濾緩沖液為pH7.4，140mM NaCl, 0.5mM EDTA,將Endomucin抗體溶液體系置換為PH7.4，140mM NaCl, 0.5mM EDTA,按照終濃度20mg/mL進行稀釋配制，制備人Endomucin單克隆 抗體制劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK103690949SQ201310692787
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】王群, 劉景曄, 高俊芳 申請人:長春長生生物科技股份有限公司