一種可增強(qiáng)固氮菌泌銨能力的基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可增強(qiáng)固氮菌泌銨能力的基因。通過突變實(shí)驗(yàn)得到具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列的基因，將其轉(zhuǎn)入可泌銨的斯氏假單胞菌A1561菌得到的菌株，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，具有比A1561菌株更高的固氮及泌銨能力。本發(fā)明的基因可應(yīng)用于生產(chǎn)提供氮肥的微生物肥料。
【專利說明】—種可增強(qiáng)固氮菌泌銨能力的基因
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種可增強(qiáng)固氮菌泌銨能力的基因。
【背景技術(shù)】:
[0002]生物固氮的研究有助于增產(chǎn)糧食且不污染環(huán)境。泌銨菌向胞外環(huán)境分泌銨，為宿主植物提供一定量的氮素。
[0003]目前泌銨菌對于植物的促生作用的研究多局限于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下，應(yīng)用于大田環(huán)境還要從以下幾個因素對其進(jìn)行改良:1)提高泌銨菌的根際定殖能力；2)結(jié)合態(tài)氮是抑制固定大氣氮的主要因素，高銨條件下提高泌銨菌的固氮能力和耐銨能力；3)在土壤微生物菌群中使泌銨菌成為優(yōu)勢菌群；4)提高固氮能源的供給及優(yōu)化其組成。
[0004]斯氏假單胞菌A1501 (Pseudomonas stutzeri A1501)是一株聯(lián)合固氮菌，于 1980年分離于我國南方水稻田。該菌株雖然具有明顯的固氮能力，但它們固定的氮素主要用來滿足自身的生長需要，而提供給植物的氮素有限。特別是在外界有銨的情況下，所固定的氮就更少，甚至停止固氮及泌銨，這就限制了聯(lián)合固氮菌的開發(fā)及在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0005]中國專利申請200910236131.9提供了一種重組泌銨菌，通過對斯氏假單胞菌A1501進(jìn)行基因改造，缺失銨轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白amtBl、amtB2基因，同時轉(zhuǎn)入固氮酶正調(diào)芐基因(nif A)，該菌株命名為1561/pVA3，具有一定的泌銨能力。但對于固氮酶正調(diào)芐基因(nifA)進(jìn)行突變，以提高其固氮和泌銨能力，獲得高效固氮的泌銨菌還未見報道。
[0006]本文中所稱的“斯氏假單胞菌”，亦可稱為“施氏假單胞菌”。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007]本發(fā)明的目的是用基因重組的手段對固氮酶正調(diào)芐基因(nif A)進(jìn)行突變，并將其轉(zhuǎn)入斯氏假單胞菌A1561菌，開發(fā)新的高效泌銨的聯(lián)合固氮基因，以提供具有應(yīng)用潛力的微生物菌肥。
[0008]本發(fā)明通過突變實(shí)驗(yàn)得到具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的nif AM基因，突變的基因可提高斯氏假單胞菌A1561泌銨量，并得到高效泌銨的聯(lián)合固氮菌，證實(shí)了上述發(fā)現(xiàn)。
[0009]nif AM基因的獲得及菌株構(gòu)建具體方法如下:
[0010]1.基因克隆
[0011]提取斯氏假單胞菌A1501的基因組，以所提取的基因組為模板，通過PCR方法獲得nif A基因。以nif A基因?yàn)槟０?，易錯突變方法突變nif A基因。
[0012]2.載體構(gòu)建
[0013]按常規(guī)方法克隆(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)?？寺×斯痰刚{(diào)芐基因(nif AM)，nif AM核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0014]將含有完整的nif AM的DNA片段連接到pVKlOO，構(gòu)建了組成型表達(dá)質(zhì)粒pVKAM。
[0015]3.三親接合[0016]通過三親本接合將不能自我轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌中。
[0017]4.重組子的篩選及鑒定
[0018]挑出部分長出的菌落連續(xù)轉(zhuǎn)三次平板后，進(jìn)行菌落PCR鑒定。之后，對泌銨情況進(jìn)行鑒定。
[0019]經(jīng)采用靛酚藍(lán)比色法進(jìn)行測銨試驗(yàn)，并與菌株A1561、1561/pVA3相比較(見實(shí)施例3)，證實(shí)用本發(fā)明構(gòu)建的聯(lián)合固氮菌株可高效泌銨，進(jìn)而可為農(nóng)作物提供氮肥，是一種潛在的微生物肥料。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0020]圖1為nif AM基因同源片段的擴(kuò)增結(jié)果；
[0021 ] 圖2為大腸桿菌重組載體pVKAM的物理圖譜；
[0022]圖3為工程菌1561/pVA3、A1561、1561/pVKAM泌銨比較。橫坐標(biāo)為培養(yǎng)天數(shù)，縱坐標(biāo)為銨濃度。
[0023]序列表說明
[0024]1、SEQ ID NO:1nifAM 的 核苷酸；
[0025]2、SEQ ID NO: 2是從SEQ ID NO:1推導(dǎo)出的nif AM編碼的氨基酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0026]以下實(shí)驗(yàn)中所用的實(shí)驗(yàn)材料說明及來源如下:
[0027]菌株與載體:
[0028]大腸桿菌菌株E.coli JM109購自Novagen公司；
[0029]斯氏假單胞菌A1561:由野生斯氏假單胞菌A1501缺失amtBl、amtB2基因后得到，來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所；
[0030]1561/pVA3菌株:為1561菌株中轉(zhuǎn)入nif A基因(見中國專利申請200910236131.9)，來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所；
[0031]pVKlOO載體:由Knauf等人于構(gòu)建，見雜志Plasmidl982年，8:45-54，以下實(shí)驗(yàn)用載體來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所。
[0032]酶與試劑盒:
[0033]限制性內(nèi)切酶，連接酶，Taq酶為NEB公司產(chǎn)品。
[0034]基因組提取試劑盒為天根生化公司產(chǎn)品。
[0035]生化試劑:IPTG、X-Gal、SDS等試劑為Sigma公司產(chǎn)品。
[0036]培養(yǎng)基:大腸桿菌培養(yǎng)基為LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0)。A15限制性培養(yǎng)基:磷酸二氫鉀0.4g，磷酸氫二鉀0.1g,氯化鈉0.1g,七水硫酸鎂0.2g, 一水硫酸錳0.01g，一水硫酸鐵0.01g，鑰酸鈉0.01g，乳酸鈉6ml，硫酸銨0.4g定容至1000ml，調(diào)ρΗ6.8。用于液體培養(yǎng)，28°C搖床，180-200rpm，培養(yǎng)16~18h。A15無氮培養(yǎng)基:A15限制
性培養(yǎng)基中除去硫酸銨。
[0037]實(shí)施例中其它未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法進(jìn)行，如Sambrook等人的方法，分子克隆按(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)實(shí)驗(yàn)室手冊中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。[0038]實(shí)施例1nifAM基因的獲得[0039]提取斯氏假單胞菌A1501的基因組。以所提取的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所使用的引物根據(jù)nifA基因的5’和3’端序列合成，2個引物序列分別為:
[0040]5， CCGAAGCTTTCAGATCTTGCGCATATGA3，和[0041 ] 5，CCGAAGCTTACGGTGCATATCGATAGC3，，
[0042]通過PCR方法獲得完整的nifA基因，并包含nifA基因編碼區(qū)上游約70bp的一段核苷酸序列，長為1.6kb的目的片段。以nifA基因?yàn)槟０澹褂肔abest易錯PCR突變試劑盒，突變nifA基因。獲得突變后基因(圖1)，命名nifAM。
[0043]實(shí)施例2用nifAM構(gòu)建基因工程菌1561/pVKAM及驗(yàn)證
[0044]用Hind III酶切并回收nifAM片段，與同樣酶切的穿梭載體pVKlOO連接。TcsKnf抗性篩選，提取質(zhì)粒，Hind III及EcoR I酶切鑒定，重組質(zhì)粒pVKAM圖譜見圖2。
[0045]分別將供體菌pVKAM，受體菌1561，幫助菌pRK2013按著1:1:1的比例混合，通過三親結(jié)合的方法，將重組質(zhì)粒PVKAM轉(zhuǎn)入1561中，然后進(jìn)行卡那霉素(Km)，四環(huán)素(Tc)抗性篩選。隨機(jī)選取3個三親結(jié)合子，提取質(zhì)粒驗(yàn)證pVKAM是否轉(zhuǎn)入1561中。受體菌1561為前期獲得的突變株，缺失了 amtB基因。
[0046]提取質(zhì)粒后，以質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到1.6kb的片段，以提取1561的空質(zhì)粒為陰性對照；同時將質(zhì)粒通過EcoR I和Hind III酶切驗(yàn)證，分別切出兩條帶，從而得到了重組的工程菌，命名為1561/pVKAM。
[0047]實(shí)施例3nif AM泌銨作用驗(yàn)證比較
[0048]1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br> [0049]通過定量比較轉(zhuǎn)入nif AM基因的改造菌株與出發(fā)菌A1561、1561/pVA3的泌銨作用，驗(yàn)證nif AM基因的功能；
[0050]2、實(shí)驗(yàn)對象
[0051]實(shí)驗(yàn)菌株:轉(zhuǎn)入nif AM基因的工程菌1561/pVKAM (實(shí)施例2得到的)；
[0052]2種對照菌株:出發(fā)菌A1561、轉(zhuǎn)入nif A基因的工程菌A1561/pVA3。
[0053]3、實(shí)驗(yàn)方法
[0054]3.1NH4+濃度的測定按照靛酚藍(lán)比色法(Bender et al.1977)，具體操作如下:
[0055]I)配制A溶液、B溶液
[0056]A 溶液(100ml):5g 苯酌? ；0.025g Na-nitroprusside (Na2Fe [CN] 5N0 ? 2H20)；
[0057]B 溶液(100ml):62.5mllM NaOH; 3.3ml NaOCl (有效氯 5.25%)。
[0058]2 )繪制NH4+濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0059]配制NH4+ 的系列稀釋液(系列稀釋 IM 的 NH4+ 為 0.1, 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2? OmM ;加入A、B溶液反應(yīng)20min后，在OD625比色)
[0060]3)分別取100 U I實(shí)驗(yàn)菌和兩種對照菌的細(xì)菌培養(yǎng)上清液，加入100 ill A溶液后再加入100 ill B溶液，20min后觀察反應(yīng)液顏色，通過與NH4+濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的顏色深淺相t匕，判斷是否存有NH4+及其濃度。
[0061]4)將實(shí)驗(yàn)菌1561/pVKAM和兩種對照菌分別接種于半固體無氮限制性培養(yǎng)基(1000ml, KH2PO40.4g, K2HP040.lg, NaCl0.lg, MgSO4.7H200.2g, MnS04.H2O0.01g, Fe2 (SO4) 3.H200.01g, Na2MoO4.H2O0.01g, C3H5Na036ml，加入 0.1%—0.2% 的瓊脂，pH6.8)中，在充滿 N2,0.5%02，30°C條件下培養(yǎng)15天后，采用乙炔還原法分別測定兩種菌的固氮酶活，并用靛酚藍(lán)法分別檢測實(shí)驗(yàn)菌株和兩種對照菌培養(yǎng)基中的泌銨量和PH值。
[0062]以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。
[0063]3.2固氮活性測定，采用乙炔還原法測定，具體操作如下:
[0064]使用SP - 2305型氣相色譜儀測定。將待測的各菌株同時活化，保持生長狀態(tài)一致；將活化后的各菌株接入含相應(yīng)抗生素的液體A15培養(yǎng)基，30°C振蕩培養(yǎng)20h。測定各菌株的0D600值。從每個試管中取出適量菌液，4，000g，4°C離心lOmin，收集菌體。
[0065]用生理鹽水洗滌菌體兩次，充分懸浮于無氮A15液體培養(yǎng)基中，使0D600 = 1.0 ；每個小三角瓶加入9ml無氮A15液體培養(yǎng)基，接入Iml菌液，使菌液終濃度為0D600 = 0.1 ；將每個小三角型瓶塞入膠塞，注入純氬氣，同時排出空氣。然后注入0.5%體積的氧氣和10%體積新制的乙炔，30°C劇烈振蕩培養(yǎng)，脅迫4h。每隔Ih從每個小血清瓶中用微量進(jìn)樣器取出0.25ml氣體用氣相色譜法測定乙烯含量，根據(jù)各樣品乙烯峰的高低來比較其固氮酶活性高低。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。
[0066]固氮酶活=記錄儀上乙烯峰的面積X (試管氣相體積/進(jìn)樣量)/ (Inmol標(biāo)準(zhǔn)乙烯峰的面積X反應(yīng)時間)
[0067]4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0068]I)固氮酶活
[0069]在固氮條件下，含nif AM基因的改造菌1561/pVKAM的固氮酶活為19.06U/mg，對照菌1561/pVA3的固氮酶活14`.24U/mg，對照菌A1561的固氮酶活為7.41U/mg, 1561/pVKAM為A1561固氮酶活的2.57倍。
[0070]2)培養(yǎng)基 pH
[0071]培養(yǎng)20天后，發(fā)現(xiàn)對照菌A1561培養(yǎng)基未顯藍(lán)色，即沒有分泌銨，銨濃度為O，pH值7.10 ;而1561/pVKAM的培養(yǎng)基顯藍(lán)色，且泌銨量達(dá)到6.96mM,其培養(yǎng)基呈弱堿性(pH值=7.48) ；1561/pVA3的培養(yǎng)基顯藍(lán)色，且泌銨量達(dá)到5.15mM,其培養(yǎng)基呈弱堿性(pH值=7.42)。研究結(jié)果表明1561/pVKAM較1561/pVA3具有更強(qiáng)的固氮活力，并且能向細(xì)胞外分泌更多的銨。
[0072]結(jié)果如圖3、表1所示。
[0073]表1三種菌泌銨作用比較
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種可增強(qiáng)固氮菌泌銨能力的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.含權(quán)利要求1所述基因的重組質(zhì)粒。
3.權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒在生產(chǎn)具有固氮功能菌肥中的應(yīng)用。
4.含權(quán)利要求1所述基因的載體。
5.用權(quán)利要求4所述的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
6.含權(quán)利要求1所述基因的重組工程菌株。
7.權(quán)利要求6所述的菌株，是將權(quán)利要求1所述基因轉(zhuǎn)入斯氏假單胞菌A1561菌得到。
8.權(quán)利要求6或7所述菌株在生產(chǎn)具有固氮功能菌肥中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白，具有SEQID N0:2所示的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求9`所述蛋白在生產(chǎn)具有固氮功能菌肥中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/31GK103525830SQ201310459866
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】平淑珍, 趙仲麟, 燕永亮, 陸偉, 林敏
申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所