賦予過氧化氫耐性的基因及其利用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于對微生物賦予過氧化氫耐性的基因及其利用方法。該賦予過氧化氫耐性的基因編碼選自以下的（a）～（c）中的蛋白質(zhì)。（a）由序列編號2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）由在（a）的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1個或多個氨基酸的氨基酸序列組成且具有能夠賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)；（c）由具有與（a）的氨基酸序列85%以上的同一性的氨基酸序列組成且具有能夠賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)。
【專利說明】賦予過氧化氫耐性的基因及其利用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及對微生物賦予過氧化氫耐性的基因及其利用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]許多需氧型微生物具有負(fù)責(zé)氧代謝的呼吸鏈，在氧存在下能夠獲得能量，良好地繁殖。另外，一部分氧在其代謝過程中產(chǎn)生超氧陰離子或過氧化氫，而這樣的微生物具有利用清除這些物質(zhì)的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶或過氧化物酶等將這些物質(zhì)無毒化而避免其毒性的機制。
[0003]在厭氧型微生物中作為有用菌被已知的乳酸菌屬于兼性厭氧型菌，不具有呼吸鏈和過氧化氫酶，但是許多乳酸菌即使在氧存在下也能夠繁殖，具有耐氧性。以前，關(guān)于乳酸菌耐氧性機理進行了若干研究，其中，作為代謝氧的酶，已知有NADH氧化酶和丙酮酸氧化酶等。NADH氧化酶被報告有水生成型和過氧化氫生成型的2種類型，水生成型將氧進行4電子還原形成水而無毒化。另一方面，報告了過氧化氫生成型以2電子還原產(chǎn)生過氧化氫，但在變異鏈球菌等乳酸菌中，利用烷基過氧化氫還原酶將該過氧化氫轉(zhuǎn)化為水，發(fā)揮作為2成分性的過氧化物酶的功能。
[0004]另外，也報告了具有清除由氧產(chǎn)生的超氧陰離子或過氧化氫的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶或NADH過氧化物酶等的乳酸菌。
[0005]在乳酸菌 植物乳桿菌WCFSl中，通過強化硫氧還蛋白還原酶基因的表達，對過氧化氫等的氧化應(yīng)力的抵抗力更強，由此提出了硫氧還蛋白還原酶在氧化應(yīng)力抗性中起著重要作用(非專利文獻I)。
[0006]另外，在厭氧型革蘭氏陰性細菌脆弱擬桿菌中，硫氧還蛋白-硫氧還蛋白還原酶系統(tǒng)被認(rèn)為是負(fù)責(zé)硫醇/ 二硫化物的氧化還原反應(yīng)的唯一系統(tǒng)，報告了通過硫氧還蛋白還原酶的缺失，即使在厭氧環(huán)境下，不添加半胱氨酸、二硫蘇糖醇等還原劑，菌也不能繁殖(非專利文獻2)。
[0007]另外，報告了在大腸桿菌中，存在為了將細胞內(nèi)保持為還原狀態(tài)所必須的谷胱甘肽-谷胱甘肽還原酶系統(tǒng)或硫氧還蛋白-硫氧還蛋白還原酶系統(tǒng)，與這些系統(tǒng)相關(guān)的基因破壞株對過氧化氫等的氧化應(yīng)力具有敏感性。
[0008]另一方面，報告了在乳酸菌乳酸乳球菌中，通過破壞硫氧還蛋白還原酶，有氧條件下繁殖被抑制(非專利文獻3)，但有氧條件下的繁殖抑制，由于以二硫蘇糖醇的添加得到恢復(fù)，而且如果培養(yǎng)24小時就會成為與野生株同樣程度的菌體量，所以有氧條件下的繁殖抑制和耐氧性的關(guān)系沒有解明。
[0009]另外，報告了在變異鏈球菌中，由于將NADH氧化酶、烷基過氧化氫還原酶(ahpC)雙敲除的變異株具有耐氧性，所以作為另一個具有鐵結(jié)合性的蛋白質(zhì)的基因是與耐氧性相關(guān)的基因(專利文獻I)。但是，這些基因不是所有微生物具有的基因，耐氧性機理尚未明確之處較多。另外，如這里所舉出的那樣，與耐氧性相關(guān)的基因有多個，不是只有I個基因發(fā)揮耐氧性能力，因此難以簡便進行實際應(yīng)用。[0010]另外，本發(fā)明的發(fā)明人等報告了干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌中存在的fnr基因是對于有氧條件下的菌繁殖特別必要的基因，是賦予耐氧性的基因(專利文獻2)。
[0011]但是，在氧化應(yīng)力中，對在代謝過程中產(chǎn)生的過氧化氫的耐性也很重要，在乳桿菌屬的微生物中，報告了 NADH過氧化物酶或過氧化氫酶等的與清除過氧化氫相關(guān)的基因，但至今沒有發(fā)現(xiàn)對過氧化氫直接顯示抗性的基因。
[0012]現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0013]專利文獻
[0014]專利文獻1:日本特開2001-327292號公報
[0015]專利文獻2:國際公開第2009/150856號小冊子
[0016]非專利文獻
[0017]非專利文獻1:L.Mariela Serrano et al.Microbial Cell Factories6:29(2007)
[0018]非專利文獻2:Edson R.Rocha et al.J.Bacteriol.189:8015-8023 (2007)
[0019]非專利文獻3:Karin Vido et al.J.Bacteriol.187:601-610 (2005)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]發(fā)明所要解決的課題
`[0021]本發(fā)明涉及提供對微生物賦予對過氧化氫的耐性的基因及其利用方法。
[0022]用于解決課題的方法
[0023]本發(fā)明的發(fā)明人等對于干酪乳桿菌?Τ9029 (FERM BP-1366)的基因組基因進行研究，發(fā)現(xiàn)存在即使暴露于過氧化氫下也抑制羥基自由基生成的基因，通過利用該基因，能夠?qū)ξ⑸镔x予對過氧化氫的耐性或強化微生物本來具有的對過氧化氫的耐性。
[0024]即，本發(fā)明是涉及以下發(fā)明。
[0025]I) 一種賦予過氧化氫耐性的基因，其編碼選自以下的(a)~(C)中的蛋白質(zhì):
[0026](a):由序列編號2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0027](b):由在(a)的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 I個或多個氨基酸的氨基酸序列組成且具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)；
[0028](c):由具有與(a)的氨基酸序列85%以上的同一性的氨基酸序列組成且具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)。
[0029]2) 一種賦予過氧化氫耐性的基因，其包括選自以下的(d)~(f)中的多核苷酸:
[0030](d):由序列編號I所示的堿基序列組成的多核苷酸；
[0031](e):與由與(d)的堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)的多核苷酸；
[0032](f):由具有與(d)的喊基序列85%以上的同一性的喊基序列組成且編碼具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
[0033]3) 一種對微生物賦予或強化過氧化氫耐性的方法，其特征在于，在該微生物中導(dǎo)入上述基因或改變該微生物具有的該基因。
[0034]4)導(dǎo)入或改變了上述基因得到的微生物。
[0035]5)含有上述微生物的飲料和/或食品。[0036]6)含有上述微生物的醫(yī)藥品。
[0037]7) 一種過氧化氫耐性微生物的篩選方法，其特征在于，測定上述基因有無和/或
其表達量。
[0038]8)包含上述多核苷酸或其一部分的重組載體。
[0039]9)包含上述重組載體的宿主微生物。
[0040]10)與上述多核苷酸特異性雜交的核酸片段。
[0041]11)包含上述多核苷酸或其一部分的DNA陣列或DNA芯片。
[0042]發(fā)明的效果
[0043]通過利用本發(fā)明的基因或多核苷酸，能夠?qū)ξ⑸镔x予過氧化氫耐性、強化微生物具有的過氧化氫耐性、篩選過氧化氫耐性的微生物。該過氧化氫耐性被賦予或強化后的微生物，即使暴露于過氧化氫下也能夠控制羥基自由基的生成，抑制核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等細胞構(gòu)成成分的障礙。
[0044]另外，通過使用本發(fā)明的基因被導(dǎo)入或改變后的微生物，就能夠制造所希望的對氧化應(yīng)力具有抗性的飲料和/或食品、醫(yī)藥品。另外，由于能夠在氧存在下維持較高的活菌數(shù)，所以不需要制品制造時的厭氧裝置、制品的厭氧保存容器，能夠?qū)崿F(xiàn)降低成本的制造。另外，由于一般而言活菌數(shù)越高則微生物的生理效應(yīng)越大，所以能夠使微生物具有的生理效應(yīng)有效地發(fā)揮。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1是表示由氧化應(yīng)力造成的⑶S2657基因表達量變化的圖表。
[0046]圖2是表示⑶S2657基因破壞株的過氧化氫耐性(存活率)的曲線圖。
[0047]圖3是表示⑶S2657基因破壞株的過氧化氫清除活性的圖表。
[0048]圖4表示⑶S2657蛋白質(zhì)的SDS-PAGE圖譜。M:標(biāo)記物(marker)、CL:細胞裂解液(cell lysate)、FT:流穿液(Flow through)、W:清洗液(wash)、E1&2:洗脫液(elution)
[0049]圖5是表示過氧化氫對⑶S2657基因高表達株的影響的圖表。
【具體實施方式】
[0050]在本說明書中，氨基酸序列和堿基序列的同一性(相同性)，能夠使用通過利用基因信息處理軟件GENETYX (Genetyx公司生產(chǎn))的Lipman-Person法(Lipman, D.J.and Pearson, ff.R.1985.Rapid and sensitive protein similarity searches.Science227:1435-1441)的同源性解析(Search homology)程序得到。具體而言,例如，同一性通過將干酪乳桿菌YIT9029的基因與已知的基因進行相同性比較、解析來算出，作為參數(shù)，設(shè)為 Unit Size to compare=2、Pick up Location=5,將結(jié)果以 ％ 表不來進行。
[0051]另外，所謂基因，不僅包括雙鏈DNA，還包括構(gòu)成雙鏈DNA的正義鏈和反義鏈的各個單鏈DNA，另外，其長度沒有任何限制。另外，作為多核苷酸，可以例示RNA、DNA，DNA包括cDNA、基因組DNA、合成DNA。
[0052]本發(fā)明的賦予過氧化氫耐性的基因是在干酪乳桿菌?Τ9029中發(fā)現(xiàn)的⑶S2657基因以及從該基因得到的基因，編碼具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)。
[0053]該CDS2657基因是由其編碼的蛋白質(zhì)功能未被解明(假設(shè)蛋白hypotheticalprotein)的所謂功能未知的基因。
[0054]本發(fā)明的賦予過氧化氫耐性的基因，具體而言是編碼選自以下的(a)~(C)中的蛋白質(zhì)的基因。
[0055](a):由序列編號2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0056](b):由在(a)的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 I個或多個氨基酸的氨基酸序列組成且具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)；
[0057](c):由具有與(a)的氨基酸序列85%以上的同一性的氨基酸序列組成且具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)
[0058]其中，由序列編號2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)是來自于干酪乳桿菌YIT9029的蛋白質(zhì)。
[0059]序列編號2所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了 I個或2個以上的氨基酸的氨基酸序列，包括缺失、取代或添加了 I個或數(shù)個、優(yōu)選I~10個氨基酸的氨基酸序列，添加包括在兩末端添加I~數(shù)個氨基酸。
[0060]氨基酸的缺失、取代、添加包括例如通過由序列編號2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)發(fā)生I堿基取代等天然產(chǎn)生的變異、或利用位點特異性變異導(dǎo)入法或突變處理等在基因中人工導(dǎo)入的變異等而產(chǎn)生的缺失、取代、添加。作為人工進行這樣的氨基酸缺失、取代或添加時的方法，例如，可以列舉對由編碼序列編號2所示的氨基酸序列的堿基序列組成的多核苷酸，實施常用的位點特異性變異導(dǎo)入，然后由通常方法使該多核苷酸表達的方法。
[0061]另外，作為氨基酸的取代，例如，可以列舉取代為與原氨基酸在疏水性、電荷、pK、立體結(jié)構(gòu)上的特征等具有類似性質(zhì)的氨基酸。
[0062]另外，作為具有與(a)的氨基酸序列85%以上的同一性的氨基酸序列，是指在序列編號2所示的氨基酸序列中將相當(dāng)?shù)男蛄羞m當(dāng)?shù)乇葘?alignment)時，具有與該氨基酸序列85%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上同一性的氨基酸序列。
[0063]在本發(fā)明中，所謂“賦予過氧化氫耐性”，是指使微生物對過氧化氫的敏感性下降，即，即使在過氧化氫存在下也能夠使微生物繁殖，和/或即使在過氧化氫存在下也不會使繁殖的微生物死亡。具體而言，是指即使微生物在內(nèi)部或外部被暴露于過氧化氫時，也能夠控制羥基自由基的生成，抑制由該羥基自由基引起的核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等細胞構(gòu)成成分的障礙。
[0064]本發(fā)明的賦予過氧化氫耐性的基因，適合列舉由選自以下的(d)~(f)中的多核苷酸組成的基因。
[0065](d):由序列編號I所示的堿基序列組成的多核苷酸；
[0066](e):與由與(d)的堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)的多核苷酸；
[0067](f):由具有與(d)的喊基序列85%以上的同一性的喊基序列組成且編碼具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
[0068]其中，由序列編號I所示的堿基序列組成的多核苷酸是來自于干酪乳桿菌YIT9029的DNA (⑶S2657基因)，對該微生物賦予過氧化氫耐性，使其能夠在過氧化氫存在下繁殖。[0069]在本發(fā)明中，所謂“嚴(yán)格條件”，例如，可以列舉在Molecular cloning-aLaboratory manual 2nd edition (Sambrook 等、1989)中記載的條件等。例如，可以列舉如下條件:在包含6XSSC( IXSSC的組成:0.15M氯化鈉、0.015M檸檬酸鈉、pH7.0),0.5%SDS、5X Denhardt雜交溶液和100mg/mL鯡魚精子DNA的溶液中，與由與該堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸一起，以65°C恒溫8~16小時使之雜交。
[0070]另外，作為具有與(d)的堿基序列85%以上的同一性的堿基序列，是指在序列編號I所示的堿基序列中將相當(dāng)?shù)男蛄羞m當(dāng)?shù)乇葘r，具有與該堿基序列85%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%以上同一性的堿基序列。
[0071]本發(fā)明的基因能夠以序列編號I的堿基序列參考，制作引物，利用以干酪乳桿菌YIT9029的DNA作為模板的通常方法的PCR法容易地得到。
[0072]即，例如，能夠通過化學(xué)合成由包含任意基因的N末端起始密碼子的序列組成的多核苷酸A、和由與包含該基因的終止密碼子的序列互補的序列組成的多核苷酸B，將這些多核苷酸A和B作為I組，將干酪乳桿菌?Τ9029的DNA作為模板進行PCR反應(yīng)而得到。另外，為了將這樣操作得到的基因片段在質(zhì)粒載體等中高效地進行克隆，也可以在多核苷酸引物的5’末端側(cè)添加用于限制酶切斷的序列。在這里，作為引物，一般可以使用基于與本發(fā)明基因的堿基序列相關(guān)的信息而化學(xué)合成的核苷酸等，但也可以良好地利用已經(jīng)獲得的本發(fā)明基因及其片段。作為該核苷酸，可以列舉作為對應(yīng)于序列編號I的部分核苷酸序列的10~50個連續(xù)的堿基、優(yōu)選15~35個連續(xù)的堿基等。
[0073]另外，PCR的條件，例如，在得到2000堿基對長度的DNA片段時，可以列舉94°C 2分鐘、(95 0C 10秒鐘、52°C 10秒鐘、72°C 2分鐘)X 30循環(huán)、72°C 7分鐘。
[0074]另外，也可以利用DNA合成儀，按照該堿基序列進行人工合成而得到。
[0075]本發(fā)明的基因是與`賦予過氧化氫耐性相關(guān)的基因，所以通過將其導(dǎo)入微生物或改變微生物具有的該基因，能夠賦予該微生物對過氧化氫的耐性或強化微生物本來具有的對過氧化氫的耐性。
[0076]本發(fā)明的基因的導(dǎo)入，能夠通過將該基因?qū)朐瓉頉]有該基因的微生物中進行。作為導(dǎo)入基因的方法，使用利用DNA的攝取能力的感受態(tài)法、利用原生質(zhì)體的原生質(zhì)體PEG法和利用高電壓脈沖的電穿孔法等即可，特別優(yōu)選電穿孔法。另外，在微生物染色體中整合基因時，可以使用基于同源重組的方法、位點特異性整合的方法。
[0077]在本發(fā)明的基因改變中，可以列舉表達增強。
[0078]在增強基因的表達中，可以通過如下方法等進行即可:將載有本發(fā)明的基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入作為對象的微生物中，由位點特異性重組在染色體的其他部位整合該基因使微生物內(nèi)的該基因的拷貝數(shù)增加，通過改變控制該基因表達的控制區(qū)域或改變控制基因使表達增加，特別優(yōu)選使該基因的拷貝數(shù)增加的方法。具體而言，在每I個微生物細胞具有多個拷貝數(shù)的質(zhì)粒中，克隆入作為對象的基因以及該基因本來的引物序列和核糖體結(jié)合位點，或者在從其他基因中分離得到或由化學(xué)合成得到的引物和核糖體結(jié)合位點的下游只連接編碼該基因的多肽的區(qū)域，克隆入在每I個微生物細胞具有多個拷貝數(shù)的質(zhì)粒中，制成重組質(zhì)粒，由電穿孔法等將其導(dǎo)入微生物細胞內(nèi)，由此，能夠提高該基因在微生物細胞內(nèi)的拷貝數(shù)。
[0079]另外，對原本具有該基因的微生物，通過對該基因進行表達阻止或表達抑制，也能夠使該微生物的過氧化氫耐性下降。
[0080]在阻止基因的表達中，使本發(fā)明的基因破壞、缺失即可，作為該方法，可以使用將完全無關(guān)的DNA片段插入基因內(nèi)部的插入失活法、或者通過階段性同源重組使一部分或全部靶基因缺失的階段性雙重交叉法，特別優(yōu)選階段性雙重交叉法。
[0081]具體而言，在使一部分或全部靶基因缺失時，從染色體DNA中分離出夾著缺失區(qū)域的兩側(cè)的區(qū)域、或者由PCR法擴增來分離，例如，在pYSSE3那樣的在大腸桿菌中增殖但在作為對象的微生物中不能復(fù)制的質(zhì)粒載體中，以與本來方向相同的方向排列的狀態(tài)克隆入這兩條DNA片段。接著，使用電穿孔法等在要發(fā)生缺失的微生物中導(dǎo)入所得到的重組質(zhì)粒DNA，從產(chǎn)生的抗生物質(zhì)耐性的克隆中，利用PCR法等篩選出在與目的缺失區(qū)域的上游或下游的克隆區(qū)域相同的區(qū)域發(fā)生重組而質(zhì)粒插入染色體上的克隆。將這樣操作得到的克隆，用不含抗生物質(zhì)的培養(yǎng)基反復(fù)傳代培養(yǎng)，由此，篩選出如下失去抗生物質(zhì)耐性的克隆，其中，質(zhì)粒再次因接近存在的相同區(qū)域之間的重組而從染色體上脫離，伴隨菌增殖消失，從而失去抗生物質(zhì)耐性。能夠利用PCR法等從這樣操作得到的克隆中分離出缺失靶基因區(qū)域的克隆。
[0082]在抑制基因的表達中，可以使用基于合成與本發(fā)明基因的mRNA的5’末端區(qū)域互補的短的RNA的所謂RNA干涉的方法、或者將控制該基因表達的區(qū)域或控制基因破壞或者缺失等使其改變的方法，特別優(yōu)選改變控制該基因表達的區(qū)域。具體地，通過改變控制基因轉(zhuǎn)錄的引物序列，能夠增多或減少向該基因向mRNA的轉(zhuǎn)錄量。
[0083]其中，作為基因?qū)牖蚋淖兊膶ο蟮奈⑸餂]有特別限定，能夠使用革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、酵母等，可以適合利用革蘭氏陽性細菌，特別優(yōu)選利用對機體的安全性得到確認(rèn)的乳桿菌屬細菌、雙歧桿菌屬細菌等。在乳桿菌屬細菌中，優(yōu)選利用干酪乳桿菌、類干酪乳桿菌、玉米乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等屬于干酪乳桿菌群的細菌，可以特別適合利用干酪乳桿菌。
[0084]雙歧桿菌屬細菌是偏性厭氧型菌，對氧、低pH和高酸度弱，在制造時的增殖和保存時的存活性等操作中困難多。由于雙歧桿菌屬細菌對人顯示有用的生理效應(yīng)，所以耗費精力利用育種改良獲得對過氧化氫具有耐性的變異株或使用不透氧性容器等，其在飲料和/或食品、醫(yī)藥品中的應(yīng)用得到發(fā)展，但存在培養(yǎng)困難、或在保存中活菌數(shù)下降的各種問題。雙歧桿菌屬細菌因為已知不具有本申請發(fā)明的賦予過氧化氫耐性的基因，所以，能夠適合作為本申請發(fā)明的基因?qū)牖蚋淖兊膶ο笪⑸锢谩?br> [0085]這樣操作得到的基因被導(dǎo)入或改變的微生物，因為過氧化氫耐性被賦予或增強，所以能夠作為有效地發(fā)揮該微生物原來具有的各種生理效應(yīng)的飲料和/或食品、醫(yī)藥品利用。
[0086]在將基因被導(dǎo)入或改變后的本發(fā)明的微生物制成飲料和/或食品、醫(yī)藥品時，菌體既可以是活菌或加熱菌體(死菌體)的任意一種，也可以是冷凍干燥的菌體，或者還可以作為包含這些微生物的培養(yǎng)物、菌體處理物利用，但優(yōu)選以活菌狀態(tài)利用。
[0087]在作為醫(yī)藥品使用時，能夠?qū)⒈景l(fā)明的微生物與固體或液體的醫(yī)藥用無毒性載體混合，以常用的醫(yī)藥品制劑的形態(tài)給藥。作為這樣的制劑，例如，可以列舉片劑、顆粒劑、散齊?、膠囊劑等固體制劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑等液體制劑、冷凍干燥制劑等。這些制劑能夠由制劑上常用手段制備。作為上述醫(yī)藥用無毒性載體，例如，可以列舉葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羥乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、氨基酸、明膠、白蛋白、水、生理食鹽水等。另外，根據(jù)需要，也可以適當(dāng)添加穩(wěn)定劑、濕潤劑、乳化劑、粘合劑、等滲劑、賦形劑等常用的添加劑。
[0088]另外，基因被導(dǎo)入或改變后的本發(fā)明的微生物，不僅可以制成為上述那樣的制劑，也可以在飲料和/或食品中配合使用。在飲料和/或食品中配合時，可以直接或使之與各種營養(yǎng)成分共同含有。因為該飲料和/或食品包含過氧化氫耐性被賦予或增強的微生物，所以能夠作為有效地發(fā)揮該微生物原來具有的各種生理作用的保健用食品或食品材料利用。具體而言，在飲料和/或食品中配合由本發(fā)明的方法得到的微生物時，既可以適當(dāng)使用能夠作為飲料和/或食品使用的添加劑，使用常用手段成形為適于食用的形態(tài)，即，顆粒狀、粒狀、片劑、膠囊、糊狀等，另外，也可以在各種食品中添加使用，例如，在火腿、香腸等食肉加工食品，魚糕、竹輪等水產(chǎn)加工食品，面包、甜點、黃油、奶粉中添加使用，或在水、果汁、牛奶、軟飲料、茶飲料等飲料中添加使用。另外，飲料和/或食品也包括動物飼料。
[0089]作為飲料和/或食品，還可以列舉利用本發(fā)明微生物的發(fā)酵乳、乳酸菌飲料、發(fā)酵豆乳、發(fā)酵果汁、發(fā)酵植物液等發(fā)酵飲料和/或食品的例子。這些發(fā)酵飲料和/或食品的制造按照通常方法進行即可。例如，制造發(fā)酵乳時，首先在滅菌后的乳培養(yǎng)基中將本發(fā)明的微生物單獨或與其它微生物同時接種培養(yǎng)，將其進行勻漿化處理，得到發(fā)酵乳基料(base)。接著，添加混合另外制備的糖漿溶液，用勻漿器等勻漿化，再添加香味調(diào)料，加工為最終制品即可。這樣操作得到的發(fā)酵乳也可以制成為不含糖漿(甜味劑)的原味類型、軟質(zhì)類型、水果風(fēng)味類型、固體狀態(tài)、液體狀態(tài)等任意形態(tài)的制品。
[0090]由本發(fā)明方法得到的微生物，由于具有高的過氧化氫耐性，所以飲料和/或食品中的菌的存活性高，因此，能夠抑制保存中的活菌數(shù)下降和死亡速度的增加，制品規(guī)格的維持變得容易，能夠使乳桿菌屬細菌等微生物具有的調(diào)節(jié)腸道作用等一般的生理效應(yīng)有效地發(fā)揮。另外，對于原來具有抗癌作用、幽門螺桿菌的除菌作用等特異的生理效應(yīng)的乳桿菌屬細菌和雙歧桿菌屬細菌，通過用本發(fā)明的方法賦予或增強過氧化氫耐性，就能夠在各種飲料和/或食品中利用該菌株，并且由于該菌株的存活性改善，就能夠使該菌株具有的生理效應(yīng)增強。`
[0091]另外，在利用雙歧桿菌屬細菌的飲料和/或食品中，以提高保存時的存活性為目的，一直以來主要使用以玻璃和鋁涂布紙等不透氧性包裝材料構(gòu)成的容器，但由本發(fā)明的方法得到的賦予或強化了過氧化氫耐性的雙歧桿菌屬細菌，因為具有高的存活性、不需要嚴(yán)格的無氧狀態(tài)，所以也可以使用透氧性高的樹脂(聚苯乙烯、聚乙烯、聚對苯二甲酸乙二醇酯)作為容器材料。使用這些樹脂的容器，相比于以不透氧性包裝材料構(gòu)成的容器，具有成本低、成型自由度高的優(yōu)點。
[0092]本發(fā)明的基因也可以用于過氧化氫耐性微生物的篩選。
[0093]即，通過測定本發(fā)明的基因有無和/或其表達量，能夠篩選出過氧化氫耐性的微生物。
[0094]其中，基因的有無和/或其表達量的測定，使用能夠檢測出本發(fā)明的基因和來自基因的mRNA的探針和引物，能夠通過Southern雜交(DNA雜交)法、DNA微陣列或RT-PCR法測定微生物中作為靶標(biāo)的基因的有無、拷貝數(shù)和表達量。然后，通過靶基因或其表達的有無，選擇目的微生物即可。[0095]包含(d)~(f)所示的多核苷酸或其一部分(片段)的本發(fā)明的重組載體，能夠使用具有能夠選擇該載體在大腸桿菌和作為對象的微生物中導(dǎo)入那樣的基因標(biāo)記的任意載體(例如，pHY400、pSAl、pYSSE3等)，通過體外連接法等公知的方法得到。
[0096]另外，包含上述重組載體的宿主微生物能夠通過使用如下等方法得到:通過公知的方法、即在宿主微生物中導(dǎo)入該重組載體時用電穿孔法等的方法，在整合入微生物染色體中時，將具有與該微生物相同的DNA區(qū)域的重組載體用電穿孔法等導(dǎo)入后，由PCR法等確認(rèn)由同源重組整合入染色體中的重組載體。
[0097]另外，包含(d)~(f)所示的多核苷酸或其一部分(片段)的本發(fā)明的DNA陣列或DNA芯片，能夠由光版印刷法等公知的方法制作。通過使用該DNA陣列或DNA芯片，能夠篩選表達本發(fā)明的基因的微生物。
[0098]另外，為了更有效地進行上述微生物的基因?qū)牖蚋淖兒臀⑸锏暮Y選，優(yōu)選使用包含本發(fā)明的多核苷酸或其一部分的重組載體、由本發(fā)明的一部分多核苷酸片段組成的PCR和RT-PCR用引物、能夠?qū)⒈景l(fā)明的多核苷酸或其一部分?jǐn)U增的PCR和RT-PCR用引物、由與本發(fā)明的多核苷酸特異性雜交的多核苷酸或其一部分組成的雜交用核酸片段。
[0099]其中，作為所使用的引物等的核酸片段，一般能夠使用基于與本發(fā)明基因的堿基序列相關(guān)的信息化學(xué)合成的核苷酸等，作為該核苷酸，優(yōu)選為對應(yīng)于序列編號I所示的堿基序列的部分核苷酸序列，為10~50個連續(xù)的堿基，更優(yōu)選為15~35個連續(xù)的堿基。
[0100]以下，利用實施例更詳細地說明本發(fā)明的內(nèi)容。
[0101]實施例
[0102]實施例1由氧、過氧化氫應(yīng)力引起的CDS2657基因表達量的變化
[0103]關(guān)于⑶S2657基因，使用實時PCR解析施加氧或過氧化氫應(yīng)力時的表達量。
[0104](I)氧化應(yīng)力的施加
[0105]氧應(yīng)力如下施加:在100ml的厭氧MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)7小時后，分為2份，將1份加入300ml容量的三角燒瓶，使用TAITEC公司生產(chǎn)的恒溫振蕩槽，以160rpm振蕩30分鐘。過氧化氫應(yīng)力如下施加:將100ml的MRS培養(yǎng)基在有氧靜置培養(yǎng)7小時后，分為2份，在I份中，添加過氧化氫達到0.5mM，繼續(xù)30分鐘培養(yǎng)。
[0106](2) RNA 的制備
[0107]將2ml用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的培養(yǎng)液添加在2倍量的RNAprotect BacteriaReagent (QIAGEN)中,攪拌后,在室溫孵育(incubate) 5分鐘，使RNA穩(wěn)定化。以5000 Xg離心10分鐘集菌后，懸浮在200 μ I包含15mg/ml溶菌酶的TE緩沖液中，加入10 μ I的Img/ml的N-乙酰胞壁酸酶SG (生化學(xué)工業(yè))，邊時常以旋渦混合器攪拌，邊以室溫孵育10分鐘。添加 700 μ I 的 RNeasy Mini Kit (QIAGEN)的 Buffer RLT 進行懸浮，以 5000X g 離心 5 分鐘，采集上清液。然后，按照在 RNeasy Mini Kit (QIAGEN)、RNAprotect BacteriaReagent (QIAGEN)中附帶的實驗程序(protocol)純化。在純化過程中，使用RNase-FreeDNase Set (QIAGEN)進行DNase處理，將混入的DNA分解。
[0108]制備的RNA 使用 2100Bioanalyzer (Agilent)確認(rèn)品質(zhì)。
[0109](3)通過實時PCR的基因表達定量解析
[0110]為了對靶基因(⑶S2657基因)的表達量定量，進行了實時PCR。WlygSRNA(total RNA)為模板，使用 PrimeScriptlst strand cDNA Synthesis Kit (TAKARA ΒΙΟINC.)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(30°C 10分鐘、42°C 50分鐘、95°C 5分鐘)，制備cDNA。以稀釋的cDNA溶液為模板，添加SYBR Premix Ex Taq (TAKARA BIO INC.)和引物，使用7500實時PCR系統(tǒng)(Real Time PCR System, Applied Biosystems),在 95°C維持 30 秒鐘后，以 95°C 5 秒鐘、60°C 34秒鐘反應(yīng)40個循環(huán)。另外，基因表達量以16SrRNA為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，進行樣品間的校正。結(jié)果用應(yīng)力樣品表達量相對于非應(yīng)力樣品表達量的相對值表示。在表1中表示使用的引物。
[0111][表1]
[0112]
【權(quán)利要求】
1.一種賦予過氧化氫耐性的基因，其特征在于: 編碼選自以下的(a)~(C)中的蛋白質(zhì)， (a):由序列編號2所不的氣基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b):由在(a)的氨基酸序列中缺失、取代或添加了I個或多個氨基酸的氨基酸序列組成且具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)； (c):由具有與(a)的氨基酸序列85%以上的同一性的氨基酸序列組成且具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)。
2.一種賦予過氧化氫耐性的基因，其特征在于: 包括選自以下的(d)~(f)中的多核苷酸， (d):由序列編號I所示的堿基序列組成的多核苷酸； Ce):與由與(d)的堿基序列互補的堿基序列組成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交、且編碼具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)的多核苷酸； (f):由具有與(d)的堿基序列85%以上的同一性的堿基序列組成且編碼具有賦予過氧化氫耐性能力的蛋白質(zhì)的多核苷酸。
3.一種對微生物賦予或強化過氧化氫耐性的方法，其特征在于: 在該微生物中導(dǎo)入權(quán)利要求1或2所述的基因或改變該微生物具有的該基因。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于: 基因的改變?yōu)闄?quán)利要求1或2所述的基因的表達增強。
5.一種微生物，其特征在于: 導(dǎo)入或改變了權(quán)利要求1或2所述的基因。
6.如權(quán)利要求5所述的微生物，其特征在于: 微生物為革蘭氏陽性細菌。
7.如權(quán)利要求6所述的微生物，其特征在于: 革蘭氏陽性細菌為乳桿菌屬細菌。
8.如權(quán)利要求7所述的微生物，其特征在于: 乳桿菌屬細菌為干酪乳桿菌。
9.一種飲料和/或食品，其特征在于: 含有權(quán)利要求5~8中任一項所述的微生物。
10.一種醫(yī)藥品，其特征在于: 含有權(quán)利要求5~8中任一項所述的微生物。
11.一種過氧化氫耐性微生物的篩選方法,其特征在于: 測定權(quán)利要求1或2所述的基因的有無和/或其表達量。
12.—種重組載體，其特征在于: 包含權(quán)利要求2所述的多核苷酸或其一部分。
13.—種宿主微生物,其特征在于: 包含權(quán)利要求12所述的重組載體。
14.一種核酸片段，其特征在于: 與權(quán)利要求2所述的多核苷酸特異性雜交。
15.一種DNA陣列或DNA芯片，其特征在于:包含權(quán)利要求2所述的多核苷酸`或其一部分。
【文檔編號】C12N15/09GK103732742SQ201280011277
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年3月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月4日
【發(fā)明者】世良田雅紀(jì), 木脅真祐美, 飯野透 申請人:株式會社益力多本社