濕法球磨聯(lián)合酶法提取菜籽多肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了濕法球磨聯(lián)合酶法提取菜籽多肽的方法，包括以下步驟：取脫脂脫殼干燥菜籽粕，粉碎過40目篩后，加入物料重量5倍的水，加入纖維素酶5-10u/g，采用球磨機(jī)在轉(zhuǎn)速為250-400rpm條件下對黑豆豆粕粉進(jìn)行濕法粉碎1-3h得到超細(xì)粉體懸濁液；（2）于超細(xì)粉體懸濁液中補(bǔ)充水量至干物濃度為50-100g/l，調(diào)整pH至7.0，加入蛋白酶40u/g，維持溫度55℃、pH7.0、水解1-2h；（3）酶解液在10000rpm條件下離心15min，殘?jiān)^續(xù)加入殘?jiān)亓?-10倍的水，加入20u/g的蛋白酶，在溫度55℃、pH7.0、水解1-2h，離心，合并2次上清液，即得到粗制多肽溶液。本發(fā)明纖維素溶解使得蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)更加容易水解，還可提高蛋白質(zhì)的水解速率，另外，使多肽轉(zhuǎn)化率大幅度提高。
【專利說明】濕法球磨聯(lián)合酶法提取菜籽多肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品加工【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及濕法球磨聯(lián)合酶法提取菜籽多肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]油菜是重要的油料作物之一，我國油菜產(chǎn)量居世界第一位。一般情況下，油菜籽經(jīng)加工可得約3506菜籽油和65%左右菜籽柏。菜籽柏中富含粗蛋白質(zhì)，粗脂肪，卵磷脂，多種維生素，氨基酸等，其蛋白質(zhì)中可消化蛋白質(zhì)含量可達(dá)27.8%。此外，菜籽柏中還含有較高膽堿，生物素，葉酸，煙酸及硫氨素，核黃素等B族維生素和Ca，P，F(xiàn)e, Se, Cu，Zn，Mn等多種微量元素。菜籽柏的粗蛋白質(zhì)含量一般在35% — 45%，為優(yōu)質(zhì)的全價(jià)植物蛋白，對其進(jìn)行開發(fā)利用具有重要的經(jīng)濟(jì)意義與社會意義。但是，目前我國對菜籽柏的利用相當(dāng)有限，僅用作肥料或按少量比例添加到反芻動物和淡水魚類的養(yǎng)殖飼料中，這造成了一定的資源浪費(fèi)。
[0003]近年來，越來越多的研究表明肽比蛋白質(zhì)具有更優(yōu)秀的性質(zhì)?，F(xiàn)代生物代謝研究發(fā)現(xiàn):由多個(gè)氨基酸結(jié)合而成的低聚肽比游離氨基酸更容易被消化吸收，其中尤以二肽，三肽吸收為最快最好。相比于原料蛋白及相同組成的氨基酸，酶解產(chǎn)物多肽能表現(xiàn)出良好的持水力，凝膠性，表面活性等物理功能特性及抗氧化，降血脂，調(diào)節(jié)免疫力等多種生理功能，而這些是原料蛋白質(zhì)和組成游離氨基酸所不具備的。因此，將菜籽柏用來加工高附加值產(chǎn)品，具有顯著的社會意義和經(jīng)濟(jì)意義。
[0004]蛋白質(zhì)的水解方法一般包括酸堿降解法和酶解法。酸堿法水解動物蛋白是利用蛋白質(zhì)在不同PH下溶解度不同，先在極端條件下使絕大部分蛋白質(zhì)溶解，去掉不溶解物，再調(diào)PH至蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)沉淀回收?；瘜W(xué)降解法以其操作簡單，成本低，蛋白質(zhì)收率高等特點(diǎn)成為早期蛋白質(zhì)水解的主要手段，但化學(xué)法水解蛋白質(zhì)存在許多缺陷，如:(I)環(huán)境污染大；(2)水解產(chǎn)物成分復(fù)雜，鹽分過高，使用范圍受到很大限制，不適合應(yīng)用于食品，保健品，化妝品等原料；(3)酸堿法難以控制反應(yīng)進(jìn)程，不能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的定位水解。綜合考慮，近幾年已經(jīng)很少采用化 學(xué)法水解蛋白質(zhì)，取而代之的是酶法水解蛋白質(zhì)。
[0005]蛋白酶能在溫和的條件下水解食物類蛋白，不會造成大的環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)定位水解，易于實(shí)現(xiàn)水解進(jìn)程的控制，從而使肽類的應(yīng)用性和功能性變廣，滿足市場的需求。但是酶解蛋白質(zhì)并不是一個(gè)簡單的工藝過程，它涉及到很多步驟。第一步就是篩選合適的酶，因?yàn)槊覆粌H影響反應(yīng)的速率，產(chǎn)物的得率，而且直接影響到產(chǎn)品的風(fēng)味，理化特性和生理活性；第二步菜籽中蛋白的溶出，菜籽中結(jié)構(gòu)是復(fù)雜的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，蛋白不易溶出，無法與酶結(jié)合水解。目前酶解過程中，主要是直接將菜籽餅粉碎水解，此過程菜籽蛋白大部分不溶于水，酶解效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種條件溫和，無污染，效率高，菜籽多肽制備方法，從而進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)提高菜籽的附加值。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出如下技術(shù)方案:濕法球磨聯(lián)合酶法提取菜籽多肽的方法，包括以下步驟:
(I)濕法微粉碎:取脫脂脫殼干燥菜籽柏，粉碎過40目篩后，以脫脂脫殼干燥菜籽柏的重量計(jì)，加入物料重量5倍的水，加入纖維素酶5-10u/g，采用球磨機(jī)在轉(zhuǎn)速為250-400rpm條件下對黑豆豆柏粉進(jìn)行濕法粉碎l_3h得到超細(xì)粉體懸濁液。
[0008](2)酶水解:于超細(xì)粉體懸濁液中補(bǔ)充水量至干物濃度為50_100g/l，調(diào)整pH至7.0,以脫脂脫殼干燥菜籽柏的重量計(jì)，加入蛋白酶40u/g，維持溫度55°C、pH7.0、水解l-2h ;所述干物指脫脂脫殼干燥菜籽柏的重量。
[0009](3)酶解液在IOOOOrpm條件下離心15min,取下層殘洛,繼續(xù)加入殘洛重量5_10倍的水，以脫脂脫殼干燥菜籽柏重量計(jì)，加入20u/g的蛋白酶，在溫度55°C、pH7.0、水解l_2h，離心，合并2次上清液，即得到粗制多肽溶液。
[0010]優(yōu)選的，所述步驟(I)中球磨機(jī)為行星式球磨機(jī)。
[0011]優(yōu)選的，所述步驟(2)中利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氫氧化鈉和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸調(diào)整pH。
[0012]優(yōu)選的,所述步驟(2)或(3)中所述蛋白酶為Flavourzyme蛋白酶。
[0013]本發(fā)明將濕法球磨微粉碎對菜籽餅進(jìn)行預(yù)處理，至中位徑可至5um左右；結(jié)合蛋白酶進(jìn)行水解，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理多肽得率大幅度提高。通過大量試驗(yàn)研究，最終獲得了最佳步驟。
[0014]材料:脫脂脫殼干燥菜籽柏、堿性蛋白酶。
[0015]本發(fā)明的技術(shù)方案，將球磨超微粉碎、水、纖維素酶三者聯(lián)合，對脫脂菜籽柏進(jìn)行超微粉碎，顆粒細(xì)化，纖維素溶解使得蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)更加容易水解，還可提聞蛋白質(zhì)的水解速率，另外，使多肽轉(zhuǎn)化率大幅度提高。采用雙縮脲法檢測溶液中多肽的含量，計(jì)算脫脂菜籽柏多肽的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)75%。
[0016]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明，但不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0018]實(shí)施例1
取脫脂脫殼干燥菜籽柏(500g)，粉碎過40目篩后，置于至于瑪瑙罐中，加入物料重量5倍(2500ml)的水，加入纖維素酶5u/g (共2500u)，采用行星式球磨機(jī)(XQM-20L，南京科析試驗(yàn)儀器研究所)在轉(zhuǎn)速為400rpm條件下對黑豆豆柏粉進(jìn)行濕法粉碎Ih得到超細(xì)粉體懸濁液；超細(xì)粉體懸濁液中補(bǔ)充水量(2500ml)至干物濃度為100g/l，利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氫氧化鈉和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸，調(diào)整PH至7.0，以脫脂脫殼干燥菜籽柏重量計(jì)，加入Flavourzyme 蛋白酶 40u/g(共 20000u),維持溫度 55°C、pH7.0、水解 2h。酶解液在 IOOOOrpm條件下離心15min，以脫脂脫殼干燥菜籽柏重量計(jì)，殘?jiān)^續(xù)加入10倍的水(共5000ml)，加入20u/g的Flavourzyme蛋白酶(共IOOOOu),在溫度55°C、pH7.0、水解Ih,離心,合并2次上清液，即得到粗制多肽溶液。
[0019]粗制多肽溶液超濾分離， 截留分子量為IOKDa以下的多肽，納濾液在一 45°C真空冷凍干燥得得菜籽多肽。將多肽溶液經(jīng)過凝膠層析、離子交換層析和RT-HPLC后收集的活性組分進(jìn)行醋酸纖維素薄膜電泳，電泳為一條單一條帶，說明收集的活性多肽純度較高，質(zhì)譜測定其分子量為1251.2Da。
[0020]采用雙縮脲法檢測溶液中多肽的含量，計(jì)算脫脂菜籽柏多肽的轉(zhuǎn)化率為72.11%。
[0021]檢測方法:游離氨基酸采用甲醛滴定法；蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法。多肽采用雙縮脲法檢測。
[0022]多肽轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式:轉(zhuǎn)化率=(Τ2-Τ1)/(Ρ1_Ρ2)
式中:Τ2為酶解后多肽含量；T1為酶解前多肽含量；P1為酶解前總蛋白含量；P2為酶解前酸溶性蛋白含量。
[0023]實(shí)施例2
取脫脂脫殼干燥菜籽柏(500g)，粉碎過40目篩后，置于至于瑪瑙罐中，加入物料重量5倍(2500ml)的水，加入纖維素酶10u/g (共2500u)，采用行星式球磨機(jī)(XQM-20L，南京科析試驗(yàn)儀器研究所)在轉(zhuǎn)速為400rpm條件下對黑豆豆柏粉進(jìn)行濕法粉碎3h得到超細(xì)粉體懸濁液；超細(xì)粉體懸濁液中補(bǔ)充水量(2500ml)至干物濃度為100g/l，利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氫氧化鈉和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸，調(diào)整PH至7.0，以脫脂脫殼干燥菜籽柏重量計(jì)，加入Flavourzyme 蛋白酶 40u/g(共 20000u),維持溫度 55°C、pH7.0、水解 2h。酶解液在 IOOOOrpm條件下離心15min，以脫脂脫殼干燥菜籽柏重量計(jì)，殘?jiān)^續(xù)加入10倍(共5000ml)的水，力口入20u/g的Flavourzyme蛋白酶(共IOOOOu),在溫度55°C、pH7.0、水解2h,離心,合并2次上清液，即得到粗制 多肽溶液。采用雙縮脲法檢測溶液中多肽的含量，計(jì)算脫脂菜籽柏多肽的轉(zhuǎn)化率為75.64%ο
[0024]檢測方法:游離氨基酸采用甲醛滴定法；蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法。多肽采用雙縮脲法檢測。
[0025]多肽轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式:轉(zhuǎn)化率=(Τ2_Τ1)/ (P1-P2)
式中:Τ2為酶解后多肽含量；T1為酶解前多肽含量；P1為酶解前總蛋白含量；P2為酶解前酸溶性蛋白含量。
[0026]對比例I
采用中國專利CN102533918A中實(shí)施例1的方法制備，步驟(3)后得精制多肽溶液。采用雙縮脲法檢測溶液中多肽的含量，計(jì)算脫脂菜籽柏多肽的轉(zhuǎn)化率為61.93%。
[0027]盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解:在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
【權(quán)利要求】
1.濕法球磨聯(lián)合酶法提取菜籽多肽的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)濕法微粉碎:取脫脂脫殼干燥菜籽柏，粉碎過40目篩后，以脫脂脫殼干燥菜籽柏的重量計(jì)，加入物料重量5倍的水，加入纖維素酶5-10u/g，采用球磨機(jī)在轉(zhuǎn)速為250-400rpm條件下對黑豆豆柏粉進(jìn)行濕法粉碎l_3h得到超細(xì)粉體懸濁液； (2)酶水解:于超細(xì)粉體懸濁液中補(bǔ)充水量至干物濃度為50-100g/l，調(diào)整pH至7.0，以脫脂脫殼干燥菜籽柏的重量計(jì)，加入蛋白酶40u/g，維持溫度55°C、pH7.0、水解l_2h ； (3)酶解液在IOOOOrpm條件下離心15min,取下層殘洛,繼續(xù)加入殘洛重量5_10倍的7jC,以脫脂脫殼干燥菜籽柏的重量計(jì)，加入20u/g的蛋白酶，在溫度55°C、pH7.0、水解l_2h，離心，合并2次上清液，即得到粗制多肽溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中球磨機(jī)為行星式球磨機(jī)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的氫氧化鈉和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鹽酸調(diào)整pH。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)或(3)中所述蛋白酶為Flavourzyme 蛋 白酶。
【文檔編號】C12P21/06GK103436581SQ201310401899
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月6日
【發(fā)明者】莊義慶, 吳琴燕, 楊敬輝 申請人:江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所