分泌表達外源蛋白的酵母轉化子及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種分泌表達外源蛋白的酵母轉化子及其制備方法，所述方法步驟為：正向引物5’端引入XhoI，對應Kex2識別區(qū)域P1’位點分別引入20種氨基酸密碼子，反向引物5’端引入NotI，得20對引物；以目標基因CDS序列cDNA或DNA為模板擴增，TA克隆得載體群P1’-CDS-pMD20-T；構建酵母真核表達載體群P1’-CDS-pPICZαA；轉化載體群至酵母，篩選陽性轉化子，并接到YPD平板，得相同拷貝數(shù)的轉化子群甲醇誘導，分析蛋白產(chǎn)量，即得表達水平最高的轉化子。本發(fā)明制備方法通過對Kex2的P1’氨基酸殘基的優(yōu)選以提高Kex2蛋白酶識別底物的活性，從而提高酵母分泌表達重組蛋白的產(chǎn)量。
【專利說明】分泌表達外源蛋白的酵母轉化子及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及應用重組DNA技術生產(chǎn)基因工程蛋白藥物技術，具體來說，特別涉及一種通過重組載體構建和酵母轉化子篩選獲得外源蛋白高水平分泌表達的酵母轉化子及其制備方法。
【背景技術】[0002]KEX2是巨大的前體蛋白轉化酶家族的成員，該蛋白家族與細菌枯草桿菌素相關。Kex2在病原性酵母Candida albicans上的同源蛋白是一個毒性因子。該蛋白的真核同源蛋白包括furin，PCI, PC2和其他用于處理諸如前體胰島素、前體胰高血糖素和前體神經(jīng)肽等等分泌激素的前體蛋白轉化酶。這些基因的缺失被認為與諸如糖尿病和癌癥等重大疾病關系密切。
[0003]KEX2基因編碼了一個參與細胞內蛋白前體加工的依賴于Ca2+的中性絲氨酸蛋白酶。Kex2蛋白是膜綁定蛋白，它最早定位于內質網(wǎng)膜并最終在反式高爾基體網(wǎng)絡發(fā)揮功能，在反式高爾基體囊泡和晚期的內吞體膜泡上循環(huán)。
[0004]Kex2最初以一個無活性的前體形式被表達出來，這個前體蛋白含有多個結構域，有一些最終會被切除掉以形成成熟的蛋白。Kex2酶原的結構域包括:一個N末端內質網(wǎng)信號肽，后面接著一個前體結構域，一個催化結構域，一個P結構域，功能未知但是在該蛋白所屬的前體蛋白轉化酶家族中保守而且對于該蛋白的體內催化活性是必須的，一個高糖基化的絲氨酸/蘇氨酸富集區(qū)域，一個單次跨膜結構域和一個含有反式高爾基體網(wǎng)絡定位信號的深入胞漿的尾部。在Kex2的激活過程中，該蛋白的N末端會經(jīng)歷多次翻譯后修飾步驟。首先，信號肽在翻譯的同時就在內質網(wǎng)內被切除；然后通過分子內部的自身介導的切除作用移除掉作為分子伴侶和自身抑制子的前體結構域，這個酶分子就被激活了 ；之后還有進一步的在高爾基體中通過Stel3雙肽氨肽酶進行N末端修飾，最后生成成熟的Kex2。
[0005]Kex2作為一個對底物序列有嚴格選擇性的蛋白內切酶，其底物選擇性已經(jīng)了解的比較清楚了。這里先介紹一種被科學界廣泛接受的命名底物及相關的蛋白酶上單個氨基酸殘基的方法:從被酶切斷的肽鍵開始，往底物的N末端數(shù)過去，底物的氨基酸依次被標示為Pl，P2，P3，P4，……，與它們綁定并相互作用的酶分子的氨基酸依次被標示為SI，S2，S3，S4,……；同理，往底物的C末端數(shù)過去，底物的氨基酸依次被標示為P1’，P2’，P3’，P4’，……，與它們綁定并相互作用的酶分子的氨基酸依次被標示為SI’，S2’，S3’，S4，，......。
[0006]國外雖已有報道，較好的Kex2活性會帶來較高的酵母天然外激素的分泌表達量，但我們的方案是在該報道已經(jīng)獲得的最優(yōu)水平的條件之上，進一步進行的優(yōu)化。目前，對于Kex2，公認的底物特異性為:P1嚴格特異的只能識別Arg ；P2可識別堿性氨基酸殘基，如Lys7Arg和鳥氨酸；P4可識別脂肪族或者堿性氨基酸殘基；對于被裂解肽鍵的另外一側，一般認為沒有特別的選擇性，只是在Ρ1位點比較排斥體積較大的側鏈；所以，沒有報道Kex2的Ρ1'殘基的選擇性的特殊形式，更沒有報道這會顯著影響酵母分泌表達水平，并進而可以利用來極大的提高重組蛋白的酵母分泌表達的水平。

【發(fā)明內容】

[0007]基于此，本發(fā)明提供一種高水平分泌表達外源蛋白的酵母轉化子及其制備方法，該方法通過優(yōu)化酵母Kex2蛋白酶活性和提升其表達量，獲得重組的外源基因的高水平分泌表達的酵母轉化子。
[0008]解決上述技術問題的具體技術方案如下:
[0009]一種獲得外源蛋白高水平分泌表達的酵母轉化株的方法，包括以下步驟:
[0010](I)設計合成一系列克隆外源基因⑶S的引物:在正向引物對應于Ρ1'的位置，即Kex2剪切位點C末端方向的第一個氨基酸，分別引入20種天然氨基酸的密碼子，正向引物5’端設計XhoI位點，XhoI位點和Ρ1'位點之間的區(qū)域由原始的酵母分泌表達載體的對應序列(AAAAGA)填充，Ρ1'位點下游至引物3’末端為PCR反應擴增序列互補區(qū)域，從XhoI位點開始到被擴增的CDS應融合在同一個表達框下，反向引物的3’區(qū)域與被擴增的外源基因3’末端互補，5’端引入NotI位點用于插入酵母分泌表達載體，即得20對系列引物；
[0011](2) TA克隆感興趣的某種外源基因⑶S:利用步驟(1)所述的系列引物，每個正向引物一個PCR反應，都搭配同一個反向引物，以含有目標基因完整CDS序列的cDNA或者其他DNA分子為模板，擴增出完整的基因片段，回收PCR產(chǎn)物TA連接入TA克隆載體pMD20_T，得到系列Ρ1'變化載體群Ρ1' -⑶S-pMD20-T，經(jīng)過測序驗證所有載體Ρ1'位點氨基酸密碼子與設計相同，并且外源基因也是正確的可表達序列；
[0012](3)亞克隆構建酵母真核表達載體:將步驟(2)所述的系列Ρ1'變化載體群Pl’-CDS-pMD20-T和酵母分泌表達載體pPICZ α Α,經(jīng)過XhoI和NotI雙酶切消化，分別回收插入片段和載體片段，用Solution I連接試劑連接上述回收片段，得到pPICZ a A重組的系列Ρ1'變化重組載體群Ρ1' -CDS-pPICZ α A ；
[0013](4)轉化重組酵母分泌表達載體至酵母宿主中:將步驟(3)所得的重組載體群Ρ1'-⑶S-pPICZ a A經(jīng)SacI單酶切線性化后，回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)氯化鋰轉化法轉入畢赤酵母Pichia pastoris的X-33宿主菌中，經(jīng)過zeocin90_110 μ g/ml篩選得到陽性轉化子,用PCR反應驗證陽性轉化子；
[0014](5)確定酵母轉化子拷貝數(shù):將步驟(4)所得的陽性酵母轉化子轉接到含有zeocin的濃度水平遞增的YH)平板上，用于確定轉化子的外源基因整合拷貝數(shù)，所有能夠在同一 zeocin濃度水平的YPD平板上生長而不能在下一更高濃度水平生長的酵母轉化子視為具有相同的外源基因整合拷貝數(shù)，每個重組載體酵母轉化子都確定了具有抗相同zeocin濃度水平的酵母克隆各5-6個，篩選分泌表達量最高的特定P1’氨基酸的重組載體轉化子須在拷貝數(shù)相同的各Ρ1'變化系列載體轉化子Ρ1' -CDS之間進行比較得出結論；
[0015](6)酵母轉化子的液體培養(yǎng)及甲醇誘導表達:將步驟(5)所得的有相同外源基因整合拷貝數(shù)的Pr變化轉化子群Pr -CDS及空載轉化子對照接種至BMGY液體培養(yǎng)基，于25-30°C搖床培養(yǎng)至0D_為1.8-2.2，收集酵母細胞，并于BMMY液體培養(yǎng)基重懸，稀釋至0D_值為0.8-9-1.1，并繼續(xù)在25-30°C搖床培養(yǎng)以誘導外源重組基因分泌表達，離心酵母培養(yǎng)物收集上清；
[0016](7)篩選表達水平最高的重組載體轉化子:通過分析步驟(6)所得上清中外源重組蛋白的產(chǎn)量，即得產(chǎn)量最高的特定Ρ1’氨基酸的重組載體轉化子。
[0017]在一些實施例中，步驟(1)中所述20種天然氨基酸的密碼子的正向引物為:
【權利要求】
1.一種分泌表達外源蛋白的酵母轉化子的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)設計克隆外源基因⑶S的引物:正向引物的5’端引入XhoI位點，并在對應于Kex2蛋白酶識別區(qū)域的Ρ1'位點分別引入20種天然氨基酸的密碼子，反向引物的5’端引入NotI位點，得20對系列引物； (2)TA克隆感興趣的外源基因CDS:以含有步驟(1)所述20對系列引物感興趣的目標基因完整⑶S序列的cDNA或者DNA為模板，用步驟(1)所述系列引物擴增出完整的⑶S基因片段，回收PCR產(chǎn)物TA連接入TA克隆載體pMD20-T，得到系列P1’變化載體群Ρ1' -⑶S-pMD20-T，經(jīng)過測序驗證所有載體Ρ1'位點氨基酸密碼子與設計相同，且外源基因⑶S確定為正確的可表達序列； (3)亞克隆構建酵母真核表達載體群:將步驟(2)所得的載體群Ρ1'-⑶S-pMD20-T和酵母表達載體pPICZaA，分別經(jīng)XhoI和NotI雙酶切消化并回收，用Solution I連接試劑連接，得系列Pl ’變化載體群Ρ1' -⑶S-pPICZ a A ； (4)轉化重組載體群至酵母宿主中:將步驟(3)所得的系列Ρ1'變化載體群Ρ1'-⑶S-pPICZ a A經(jīng)SacI單酶切線性化后，回收酶切產(chǎn)物，再經(jīng)氯化鋰轉化法轉入畢赤酵母Pichia pastoris的X-33宿主菌中，經(jīng)zeocin90_110 μ g/ml篩選得到陽性轉化子； (5)確定酵母轉化子拷貝數(shù):將步驟(4)所得的陽性轉化子轉接到含zeocin濃度遞增的YPD平板，獲得具有相同外源基因整合拷貝數(shù)的轉化子群Ρ1' -CDS ； (6)酵母轉化子的液體培養(yǎng)及甲醇誘導表達:將步驟(5)所得的有相同外源基因整合拷貝數(shù)的轉化子群Ρ1'-⑶S及空載轉化子接種至BMGY培養(yǎng)基，25-30°C搖床培養(yǎng)至OD6tltl為.1.8-2.2，收集酵母細胞用BMMY培養(yǎng)基重懸，稀釋至OD600為0.9-1.1，甲醇誘導110_130h,離心并收集上清； (7)篩選表達水平最高的重組載體轉化子:通過分析步驟(6)所得的上清中外源重組蛋白產(chǎn)量，即得表達水平最高的Ρ1'氨基酸的重組載體轉化子。
2.根據(jù)權利要求1所述的分泌表達外源蛋白的酵母轉化子的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述20種天然氨基酸的密碼子的正向引物分別為:
3.根據(jù)權利要求1所述的分泌表達外源蛋白的酵母轉化子的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述zeocin的濃度為100 μ g/ml。
4.根據(jù)權利要求1所述的分泌表達外源蛋白的酵母轉化子的制備方法，其特征在于，步驟(5)中所述YPD平板的zeocin的濃度依次為200 μ g/ml、500 μ g/ml和1000 μ g/ml。
5.根據(jù)上述權利要求1-4任一項所述制備方法獲得的酵母轉化子。
【文檔編號】C12R1/84GK103525712SQ201310317850
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年7月25日 優(yōu)先權日:2013年7月25日
【發(fā)明者】吳東海, 楊松, 劉月紅, 李侍武, 徐愛民, 李鵬, 劉彭濤 申請人:中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院