專利名稱：在奶中產(chǎn)生外源蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動物的制作方法
在奶中產(chǎn)生外源蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動物
背景技術：
在過去十年中已經(jīng)由制藥工業(yè)通過提取或通過重組技術來普遍地生產(chǎn)人保健中 所涉及的蛋白因子和激素。涉及所需基因的遺傳構(gòu)建體在細菌、酵母或哺乳動物細胞系中 成功地得到了表達。然而，使用哺乳動物細胞培養(yǎng)物來獲得復雜蛋白質(zhì)，如需要適當糖基化 模式的那些，涉及高成本的方法。 在過去十年間已經(jīng)日益增長地使用重組DNA技術來生產(chǎn)商業(yè)上重要的生物材料。 為此，已經(jīng)克隆了編碼各種醫(yī)學上重要的人蛋白質(zhì)的DNA序列。這些包括胰島素、纖溶酶原 激活劑、al-抗胰蛋白酶和凝固因子VIII和IX。目前，即使使用新興的重組DNA技術，通 常也從血液和組織中純化這些蛋白質(zhì)，這是昂貴而費時的方法，可能帶有傳播傳感因子如 導致AIDS和肝炎的那些的風險。 盡管在細菌中表達DNA序列來生產(chǎn)所需的醫(yī)學上重要的蛋白質(zhì)看起來是有吸引 力的提議，但實際上細菌作為宿主常常證明是不能令人滿意的，因為外源蛋白在細菌細胞 中不穩(wěn)定并且沒有被正確地加工。 認識到這個問題，已經(jīng)嘗試了在哺乳動物組織培養(yǎng)物中表達所克隆的基因并已經(jīng) 在一些情況下證明了是可行的策略。然而，動物細胞的批量發(fā)酵是昂貴的且需要技術的過 程。 因此存在對用于生產(chǎn)生物物質(zhì)如正確修飾的真核多肽的高產(chǎn)率，低成本方法的需 要。在這種方法中不存在對人具傳染性的因子將是一個優(yōu)勢。 為了在奶中獲得大量的人蛋白質(zhì)，獲得所需基因的轉(zhuǎn)基因動物如牛的可能性已經(jīng) 引起了工業(yè)的極大興趣。文獻中的幾個小組報道了他們生產(chǎn)人血清清蛋白、a抗胰蛋白酶 的成功以及在轉(zhuǎn)基因奶牛或山羊中的一些其它實例。 之前已經(jīng)在小鼠或大鼠中進行了許多實驗，將轉(zhuǎn)基因表達限制于乳腺中往往是優(yōu) 選的，因為使用P酪蛋白或乳清蛋白啟動子，其只響應哺乳期雌性中的乳腺轉(zhuǎn)錄因子。
專門在奶中表達異源蛋白意欲避免對宿主哺乳動物健康的不利影響并提供容易 的純化方法。 在細菌或細胞培養(yǎng)物中表達異源蛋白可能由于該重組蛋白對宿主哺乳動物的毒 性作用而受到阻礙或阻止。在文獻中可以找到許多實例，其中在特定的系統(tǒng)中不能表達某 種蛋白，甚至是天然非毒性的蛋白，因為它對宿主是有害的，甚至引起宿主的死亡。死亡的 原因可能是細胞內(nèi)的高濃度蛋白，高濃度的分泌蛋白或與該蛋白的特異性相互作用和在外 源宿主中引起細胞病變活性的一些細胞成分。 已經(jīng)研發(fā)了幾種方法來克服這些缺陷，以實現(xiàn)毒性蛋白的異源基因表達，包括使 用融合蛋白，修飾原始蛋白序列，分開表達蛋白的不同多肽等。(參見，Protein E鄧ression and Purification(蛋白表達和純化)，2001年8月，22(3) :422-9)。 在轉(zhuǎn)基因牛中表達重組蛋白時，可以產(chǎn)生相似的作用。在轉(zhuǎn)基因哺乳動物的產(chǎn)生 中，將細胞轉(zhuǎn)染以獲得攜帶目標外源基因的轉(zhuǎn)基因克隆，然后將其用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因哺乳動 物。該方法通常導致該目標序列插入到宿主基因組中，如果使用特異性的啟動子，這是隨后
7應當導致異源蛋白在靶組織或腺體中的事件，或如果使用通用啟動子，將導致全身表達。蛋
白表達的水平將取決于多種因素，包括基因組.:,:::入發(fā)生的位置。 即使當通過組織特異性啟動子指導基因表達時，使用幾種蛋白，在許多不同哺乳
動物物種中，已經(jīng)觀察到外源蛋白滲漏至外周循環(huán)系統(tǒng)中(參見Life Sciences, 2006年1
月25日;78(9) : 1003-9，Epub2005年9月15日;和Journal of Biotechnology,2006年7
月13日；124(2) :469-72， Epub 2006年5月23日)。根據(jù)表達的水平、滲漏的水平、異源
蛋白的性質(zhì)、物種(宿主和外源蛋白)之間的關系和異源蛋白與宿主受體相互作用的能力，
這種滲漏可能具有相關的生物學后果。鑒于與宿主同源蛋白的相似性，這些通過轉(zhuǎn)基因表
達的蛋白中的一些可以對外源宿主發(fā)揮其天然的生物活性并可以引起能導致哺乳動物死
亡的病理作用(參見，Endocrinologyl997年7月;138(7) :2849-55)。此外，可能的是異
源蛋白不是通過與相應同源宿主受體的相互作用影響哺乳動物的健康，而是通過當一些異
源蛋白在細菌中表達時發(fā)生的毒性、非特異性作用影響哺乳動物的健康。 本發(fā)明提供了通常與在轉(zhuǎn)基因哺乳動物中表達對該哺乳動物具有毒性作用的蛋
白相關的缺陷的創(chuàng)新性解決方法。 發(fā)明概述 本發(fā)明涉及非人哺乳動物，將其用于生產(chǎn)可能對哺乳動物具有毒性的目標蛋白。 該哺乳動物的特征在于以下的事實其是轉(zhuǎn)基因的，用于在其奶中生產(chǎn)失活形式的目標蛋 白。目標蛋白的失活形式是目標蛋白對表達目標蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物是沒有毒性的 目標蛋白形式。如在此所用的，毒性意指引起嚴重的傷害或死亡。目標蛋白的失活形式可 以在表達失活形式的目標蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物中具有一些生物活性；然后，目標蛋 白的失活形式對非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物是無毒的(即，哺乳動物沒有死亡或沒有遭受嚴重的 傷害)。可以在體外激活失活形式的蛋白。這種失活蛋白，可能是蛋白的非天然物質(zhì)，可以 是，但不限于，重組修飾的人胰島素前體。目標蛋白可以是，但不限于，重組人胰島素。非人 轉(zhuǎn)基因哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的哺乳動物。 本發(fā)明進一步涉及提供用于在哺乳動物的乳房細胞中表達失活形式的目標蛋白 的質(zhì)粒，其中表達通過P酪蛋白啟動子來調(diào)控。 本發(fā)明進一步涉及使用非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物生產(chǎn)對非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物可能有 毒的目標蛋白的方法。通過將蛋白表達為失活蛋白來避免蛋白的潛在毒性。這種失活蛋白， 可能是蛋白的非天然物質(zhì)，可以是，但不限于，修飾的人胰島素前體。目標蛋白可以是，但不 限于，重組人胰島素。非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的哺乳動物。
本發(fā)明還涉及生產(chǎn)重組胰島素的方法，包括制備非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，該轉(zhuǎn)基因 動物在其奶中產(chǎn)生重組的修飾胰島素前體，從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物獲得奶，從奶中純化前 體，將純化的前體接受酶切割和轉(zhuǎn)肽作用，以產(chǎn)生重組胰島素，并將重組胰島素純化。重組 胰島素可以是，但不限于，重組人胰島素。轉(zhuǎn)基因哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的哺乳 動物。 附圖簡述

圖1顯示了表達質(zhì)粒p 13 mhuIP的略圖，其含有編碼修飾的人胰島素前體(mhuIP)
的基因序列和指導其表達至乳房細胞中的啟動子。 圖2顯示了起始構(gòu)建體的略圖，其含有編碼mhuIP的序列。
圖3顯示了表達質(zhì)粒pNJK IP的略圖，其含有編碼修飾的人胰島素前體(mhuIP) 的基因序列，指導其表達至乳房細胞中的啟動子和雞P球蛋白絕緣子的編碼序列的片段。
圖4顯示了表達質(zhì)粒pPKLE IP的略圖，其含有編碼修飾的人胰島素前體(mhuIP) 的基因序列，指導其表達至乳房細胞中的啟動子，牛a乳清蛋白基因的編碼序列的大部分 和腸激酶切割位點。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)對哺乳動物可能有毒的目標蛋白的非人哺乳動物。該哺乳動 物的特征在于以下事實其是轉(zhuǎn)基因的，用于在其奶中生產(chǎn)失活形式的目標蛋白。術語失活 蛋白指的是目標蛋白對表達目標蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物為無毒的形式。在本發(fā)明進一 步的實施方案中，術語失活蛋白指的是沒有進一步翻譯后修飾而缺乏生物活性的蛋白。失 活蛋白的實例包括前體蛋白(即，前肽)，含有修飾(即，與天然蛋白相比時，氨基酸的取代、 添加或缺失)的蛋白，該修飾使得蛋白質(zhì)在生物上失活，而沒有進一步加工，或修飾的前體 蛋白(即，與天然前肽相比時含有氨基酸取代、添加或缺失的前肽)。換句話說，通過將蛋白 表達為沒有殺滅表達目標蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的失活蛋白來避免目標蛋白的潛在 毒性。這種失活蛋白，可能是蛋白的非天然物質(zhì)，可以是，但不限于，以下的前體、修飾前體 或修飾形式抗體、激素、生長因子、酶、凝血因子、阿樸脂蛋白、受體、藥品、藥物、生物藥品、 保健食品、致癌基因、腫瘤抗原、腫瘤抑制劑、細胞因子、病毒抗原、寄生蟲抗原和細菌抗原。 優(yōu)選，失活蛋白是不會在表達修飾的胰島素前體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物中引起低血糖的重 組修飾的胰島素前體。更優(yōu)選，失活蛋白是重組修飾的胰島素前體，最優(yōu)選，是重組修飾的 人胰島素前體。目標蛋白可以是，但不限于，重組胰島素，更優(yōu)選，重組哺乳動物胰島素，最 優(yōu)選，重組人胰島素。該非人哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的哺乳動物。轉(zhuǎn)基因哺乳 動物的其他物種可以是，但不限于，豬物種、綿羊物種、公山羊物種或嚙齒動物物種。
胰島素是負責控制體內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運、利用和貯存的主要激素。胰腺的13細胞分 泌胰島素的單鏈前體，稱為胰島素原。胰島素原由三個結(jié)構(gòu)域組成氨基端B鏈，羧基端A 鏈和中間稱為C肽的連接肽。胰島素原的蛋白水解導致胰島素原鏈中某些堿性氨基酸連同 連接肽(C肽)的去除，以產(chǎn)生生物活性的多肽胰島素。 在實施方案中，修飾蛋白為不是蛋白天然存在形式的蛋白質(zhì)形式。在實施方案中， 修飾的胰島素前體含有氨基端B鏈和羧基端A鏈。然而，修飾的胰島素前體含有修飾的C 肽。在修飾的胰島素前體中，編碼在天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的連接C肽的氨基酸由未 在天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的氨基酸替代。在實施方案中，修飾的C肽含有以下三個氨 基酸Ala-Ala-Lys。此外，修飾的胰島素前體可以含有修飾的B鏈。在實施方案中，修飾的 B鏈含有天然存在的B鏈幾乎所有的C-端氨基酸。 在進一步的實施方案中，修飾的胰島素前體是由53個氨基酸組成的修飾人胰島 素前體，分子量約為6kD。修飾的人胰島素前體含有具有天然存在B鏈氨基酸1-29的修飾B 鏈和具有三個氨基酸Ala-Ala-Lys的修飾C肽。可以將修飾的人胰島素前體接受酶切割和 轉(zhuǎn)肽作用，以產(chǎn)生人胰島素，這對于糖尿病的治療是必需的，并且其應用也是非常確定的。
本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因的用于在其奶中生產(chǎn)重組修飾的人胰島素前體的非人哺乳 動物，其特征在于以下的事實重組修飾的人胰島素前體沒有使哺乳動物不能生存。
本發(fā)明進一步涉及用于生產(chǎn)重組人胰島素的牛物種的轉(zhuǎn)基因哺乳動物。已知人胰
9島素在牛中是有活性的。預期表達成熟形式的人胰島素的?？赡艹尸F(xiàn)出與低血糖相關的癥 狀，因為轉(zhuǎn)基因蛋白可以滲漏至血流中。因此，表達重組人胰島素的轉(zhuǎn)基因?？赡苁遣荒苌?存的。然而，本發(fā)明克服了這種缺陷，并使得可以在轉(zhuǎn)基因哺乳動物中表達可能對轉(zhuǎn)基因哺 乳動物有毒的蛋白。本發(fā)明表達失活形式的目標蛋白。從轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶中純化失活 蛋白，并在體外轉(zhuǎn)化成蛋白的成熟(即，活性)形式。勿庸置疑地，哺乳動物，如牛，將其用 作生產(chǎn)表達時對哺乳動物有害的治療蛋白(例如，人胰島素)的工具構(gòu)成了出乎意料的和 創(chuàng)新性的貢獻。 本發(fā)明進一步涉及在其奶中產(chǎn)生重組修飾的胰島素前體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物， 其基因組包含整合的質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含編碼修飾的胰島素前體的核酸，該核酸可操作地連 接指導該序列在哺乳動物的乳房細胞中表達的啟動子。非人哺乳動物可以是，但不限于，牛 物種的哺乳動物。轉(zhuǎn)基因哺乳動物的其他物種可以是，但不限于，豬物種、綿羊物種、公山羊 物種或嚙齒動物物種。修飾的胰島素前體可以是修飾的哺乳動物胰島素前體，更優(yōu)選，修飾 的人胰島素前體，修飾的牛胰島素前體，修飾的豬胰島素前體，修飾的綿羊胰島素前體，修 飾的公山羊胰島素前體，修飾的嚙齒動物胰島素前體，最優(yōu)選，修飾的人胰島素前體。啟動 子可以是P酪蛋白啟動子。合適的P酪蛋白啟動子包括，但不限于，牛P酪蛋白啟動子 或公山羊13酪蛋白啟動子。其他|3酪蛋白啟動子包括，但不限于，豬13酪蛋白啟動子，綿 羊P酪蛋白啟動子或嚙齒動物P酪蛋白啟動子。整合的質(zhì)粒還可以含有抗生素抗性基因， 如新霉素抗性基因。此外，整合的質(zhì)?？梢允莗PmhuIP。整合的質(zhì)粒還可以是pNJK IP或 p線E IP。 本發(fā)明進一步涉及非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其中在哺乳動物的體細胞和生殖細胞中 都發(fā)現(xiàn)了上述的整合質(zhì)粒。 本發(fā)明進一步涉及在其奶中產(chǎn)生重組修飾的人胰島素前體的牛物種的非人轉(zhuǎn)基 因哺乳動物，其基因組包含整合的質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含編碼修飾的人胰島素前體的核酸和指 導該序列在哺乳動物的乳房細胞中表達的P酪蛋白啟動子。合適的P酪蛋白啟動子包括， 但不限于，牛P酪蛋白啟動子或公山羊P酪蛋白啟動子。其他P酪蛋白啟動子包括，但 不限于，豬13酪蛋白啟動子，綿羊P酪蛋白啟動子或嚙齒動物P酪蛋白啟動子。整合的 質(zhì)粒還可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因。此外，整合的質(zhì)粒可以是pPmhuIP。 整合的質(zhì)粒還可以是pNJKIP或pPKLE IP。 本發(fā)明還涉及包含編碼修飾的胰島素前體的核酸序列和抗性基因的質(zhì)粒，該核酸 序列可操作地連接P酪蛋白啟動子，該抗性基因使得可以選擇抗生素抗性細胞。合適的P 酪蛋白啟動子包括，但不限于，牛P酪蛋白啟動子或公山羊P酪蛋白啟動子。其他P酪 蛋白啟動子包括，但不限于，豬P酪蛋白啟動子，綿羊P酪蛋白啟動子或嚙齒動物P酪蛋 白啟動子。在實施方案中，抗生素抗性基因是新霉素抗性基因，其使得可以選擇遺傳霉素抗 性細胞。這樣的質(zhì)粒的實例是pPmhu IP，如圖1中所示。這樣的質(zhì)粒的其他實例是pNJK
IP，如圖3,"、,:和pPKLE IP，如圖4中所示。 本發(fā)明進一步涉及包含編碼修飾的胰島素前體的核酸序列的質(zhì)粒，其中修飾的胰 島素前體是修飾的哺乳動物胰島素前體。修飾的哺乳動物胰島素前體可以是修飾的人胰島 素前體，修飾的牛胰島素前體，修飾的豬胰島素前體，修飾的綿羊胰島素前體，修飾的公山 羊胰島素前體或修飾的嚙齒動物胰島素前體。在實施方案中，修飾的哺乳動物胰島素前體是修飾的人胰島素前體。 本發(fā)明進一步涉及包含編碼修飾的胰島素前體的核酸序列的質(zhì)粒，該修飾的胰島
素前體不會在表達修飾的胰島素前體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物中引起低血糖。 本發(fā)明進一步涉及包含編碼含有修飾C肽的修飾人胰島素前體的核酸序列的質(zhì)
粒。在修飾的人胰島素前體中，編碼在天然存在的人胰島素原中發(fā)現(xiàn)的連接C肽的氨基酸
由未在天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的氨基酸替代。在實施方案中，修飾的C肽含有以下三
個氨基酸Ala-Ala-Lys。此外，修飾的人胰島素前體可以含有修飾的B鏈。在實施方案中，
修飾的B鏈含有天然存在的B鏈的氨基酸1-29。 本發(fā)明進一步涉及包含編碼修飾的胰島素前體的核酸序列的質(zhì)粒，其進一步包含 一個或多個其他遺傳元件，這些遺傳元件將增強質(zhì)粒穩(wěn)定性，增強從質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的mRNA的穩(wěn) 定性，降低修飾的胰島素前體的降解和/或提高修飾的胰島素前體的表達。合適的遺傳元 件包括，但不限于，調(diào)控元件(例如，啟動子、增強子、絕緣子或轉(zhuǎn)錄終止位點)、不是胰島素 基因編碼序列的片段或不是胰島素基因的編碼序列。在實施方案中，遺傳元件是雞P球蛋 白絕緣子的編碼序列的片段。這樣的質(zhì)粒的實例是pNJK IP，如圖3中所示的。在其他實施 方案中，遺傳元件是牛a乳清蛋白基因的編碼序列的片段。這樣的質(zhì)粒的實例是pPKLE IP，如圖4中所示的。 依據(jù)布達佩斯條約的條款將質(zhì)粒p 13 mhuIP、 pNJK IP和p P KLE IP保藏。保藏的 名禾爾禾口地址是DSMZ-Deutsche Samml皿g vonMikroorganismen皿d Zellkul turen GmbH， Inhoffenstr. 7B，D-3 .... . Braunschweig,德國。p P mhuIP在2008年4月4日保藏于DSMZ， 并給予DSMZ保藏號DSM 21359。 pNJK IP在2008年4月4日保藏于DSMZ，并給予DSMZ保 藏號DSM 21360。 pPKLE IP在2008年6月12日保藏于DSMZ。 本發(fā)明進一步涉及轉(zhuǎn)染上述遺傳構(gòu)建體的方法。在實施方案中，通過將遺傳構(gòu)建 體插入脂質(zhì)體中并將脂質(zhì)體接觸哺乳動物細胞來將上述遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至哺乳動物細胞 中。脂質(zhì)體可以是陽離子脂質(zhì)。 在合適的介質(zhì)中新霉素抗性細胞的選擇方法是本領域技術人員已知的。必需小心 挑選這樣的細胞，以便避免細胞損傷。 本發(fā)明還涉及將停止于G?；蚣毎芷诓煌瑫r間的細胞核移植至l核哺乳動物卵 母細胞，最優(yōu)選牛卵母細胞中的方法。 本發(fā)明涉及將轉(zhuǎn)基因胚胎移植至激素剌激的哺乳動物子宮，最優(yōu)選奶牛的子宮中 的方法。 本發(fā)明進一步涉及制造非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的方法，包括將編碼失活目標蛋白的 核酸序列克隆至質(zhì)粒中，借此將該序列可操作地連接至指導該序列在乳房細胞中表達的啟 動子，形成表達質(zhì)粒；用該表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體細胞使得將質(zhì)粒摻入到細胞的基因組中，形成轉(zhuǎn) 基因體細胞；將成熟卵母細胞去核，形成去核的卵母細胞；將一個轉(zhuǎn)基因體細胞與去核的 卵母細胞融合形成單細胞胚胎；將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中；并監(jiān)視妊娠直到轉(zhuǎn)基 因哺乳動物的出生。目標失活蛋白可以是沒有在哺乳動物中引起低血糖的修飾胰島素前 體。修飾的胰島素前體優(yōu)選是修飾的哺乳動物胰島素前體，更優(yōu)選，修飾的人胰島素前體， 修飾的牛胰島素前體，修飾的豬胰島素前體，修飾的綿羊胰島素前體，修飾的公山羊胰島素 前體或修飾的嚙齒動物胰島素前體，并且最優(yōu)選，修飾的人胰島素前體。非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的哺乳動物。轉(zhuǎn)基因哺乳動物的其他物種可以是，但不限于，豬 物種，綿羊物種，公山羊物種或嚙齒動物物種。啟動子可以是P酪蛋白啟動子。合適的P 酪蛋白啟動子包括，但不限于，牛P酪蛋白啟動子或公山羊P酪蛋白啟動子。其他P酪 蛋白啟動子包括，仁限于，豬P酪蛋白啟動子，綿羊13酪蛋白啟動子或嚙齒動物|3酪
蛋白啟動子。質(zhì)粒還可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因。此外，表達質(zhì)?？梢允?pPmhuIP。表達質(zhì)粒還可以是pNJK IP或pPKLE IP。 本發(fā)明進一步涉及表達失活形式目標蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的制備方法，該 轉(zhuǎn)基因哺乳動物包含編碼含有修飾C肽的修飾胰島素前體的核酸序列。在修飾的胰島素前 體中，編碼在天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的連接C肽的氨基酸由未在天然存在的胰島素原 中發(fā)現(xiàn)的氨基酸替代。在實施方案中，修飾的C肽含有以下三個氨基酸Ala-Ala-Lys。此 外，修飾的人胰島素前體可以含有修飾的B鏈。在實施方案中，修飾的B鏈含有天然存在的 B鏈的幾乎所有C-端氨基酸 本發(fā)明進一步涉及表達失活形式目標蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的制備方法，其 中體細胞可以是成纖維細胞。此外，轉(zhuǎn)基因體細胞可以分離自在其奶中表達失活形式目標 蛋白的雌性轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因體細胞可以是成纖維細胞。 本發(fā)明進一步涉及表達失活形式目標蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的制備方法，其 中編碼失活形式目標蛋白的核酸序列在哺乳動物的體細胞和生殖細胞中都有發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明進一步涉及在其奶中產(chǎn)生重組修飾人胰島素前體的非人牛物種轉(zhuǎn)基因哺 乳動物的制備方法，其基因組包含整合的質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含編碼修飾人胰島素前體的核酸 序列和指導該序列在哺乳動物的乳房細胞中表達的P酪蛋白啟動子。合適的|3酪蛋白啟 動子如上所述。整合的質(zhì)?？梢院锌股乜剐曰颍缧旅顾乜剐曰颉４送?，整合的實 例可以是pPmhuIP。整合的質(zhì)粒還可以是pNJK IP或pPKLEIP。 本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)失活形式的目標蛋白的方法，包括制備在其奶中產(chǎn)生失活 形式目標蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物；從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物獲得奶；從奶中純化失活蛋 白；在體外轉(zhuǎn)換目標蛋白的失活形式；和純化目標蛋白，其中目標蛋白對非人轉(zhuǎn)基因哺乳
動物可能是有毒的。失活蛋白可以是，但不限于，以下的前體、修飾前體或夂:形式抗體、 激素、生長因子、酶、凝血因子、阿樸脂蛋白、受體、藥品、藥物、生物藥、營養(yǎng)補給品、致癌基 因、腫瘤抗原、腫瘤抑制劑、細胞因子、病毒抗原、寄生蟲抗原和細菌抗原。優(yōu)選，失活蛋白可 以是重組修飾的胰島素前體，更優(yōu)選，重組修飾的哺乳動物胰島素，最優(yōu)選，重組修飾的人 胰島素前體。非人哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的哺乳動物。轉(zhuǎn)基因哺乳動物的其他 物種可以是，但不限于，豬物種、綿羊物種、公山羊物種或嚙齒動物物種。 本發(fā)明還涉及在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物中生產(chǎn)失活形式目標蛋白的方法，該轉(zhuǎn)基因 哺乳動物是通過以下方法制得的該方法包括將編碼失活形式目標蛋白的核酸序列克隆至 質(zhì)粒中，借此將該序列可操作地連接至指導該序列在乳房細胞中表達的啟動子，形成表達 質(zhì)粒；用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體細胞，任選成纖維細胞，使得將質(zhì)粒摻入到體細胞的基因組中，形成轉(zhuǎn) 基因體細胞；將成熟卵母細胞去核，形成去核的卵母細胞；將一個轉(zhuǎn)基因體細胞與去核的 卵母細胞融合形成單細胞胚胎；將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中；并監(jiān)視妊娠直到轉(zhuǎn)基 因哺乳動物的出生。目標失活蛋白可以是沒有在哺乳動物中引起低血糖的修飾胰島素前 體。修飾的胰島素前體優(yōu)選是修飾的哺乳動物胰島素前體，更優(yōu)選，修飾的人胰島素前體，修飾的牛胰島素前體，修飾的豬胰島素前體，修飾的綿羊胰島素前體，修飾的公山羊胰島素 前體或修飾的嚙齒動物胰島素前體，并且最優(yōu)選，修飾的人胰島素前體。非人轉(zhuǎn)基因哺乳動 物可以是，但不限于，牛物種的哺乳動物。轉(zhuǎn)基因哺乳動物的其他物種可以是，但不限于，豬 物種，綿羊物種，公山羊物種或嚙齒動物物種。啟動子可以是P酪蛋白啟動子。合適的P 酪蛋白啟動子如上所述。質(zhì)粒還可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基因。此外，表 達質(zhì)?？梢允荘 P mhuIP。質(zhì)粒還可以包含一個或多個其他遺傳元件，這些遺傳元件將增強 質(zhì)粒穩(wěn)定性，增強從質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的mRNA的穩(wěn)定性，降低修飾的胰島素前體的降解和/或提高 修飾的胰島素前體的表達。合適的遺傳元件包括，但不限于，調(diào)控元件(例如，啟動子、增強 子、絕緣子或轉(zhuǎn)錄終止位點)、不是目標蛋白基因編碼序列的片段或不是目標蛋白基因的編 碼序列。表達質(zhì)粒可以是pNJK IP或pPKLE IP。 在實施方案中，使用編碼含有修飾C肽的修飾胰島素前體的核酸序列來克隆表達 失活形式目標蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物。在修飾的胰島素前體中，編碼在天然存在的胰 島素原中發(fā)現(xiàn)的連接C肽的氨基酸由未在天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的氨基酸替代。在實 施方案中，修飾的C肽含有以下三個氨基酸Ala-Ala-Lys。此外，修飾的胰島素前體可以含 有修飾的B鏈。在實施方案中，修飾的B鏈含有天然存在B鏈的幾乎所有的C-端氨基酸。
在進一步的實施方案中，通過其中體細胞是成纖維細胞的方法制得表達失活形式 目標蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物。此外，轉(zhuǎn)基因體細胞可以分離自在其奶中表達失活形式 目標蛋白的雌性轉(zhuǎn)基因動物。轉(zhuǎn)基因體細胞可以是成纖維細胞。 在進一步的實施方案中，表達失活形式目標蛋白的核酸序列在表達失活形式目標 蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的體細胞和生殖細胞中都有發(fā)現(xiàn)。 本發(fā)明進一步涉及在其奶中產(chǎn)生重組修飾人胰島素前體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物 中生產(chǎn)失活形式人胰島素的方法，其基因組包含整合的質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含編碼修飾的人胰 島素前體的核酸序列和指導該序列在哺乳動物的乳房細胞中表達的P酪蛋白啟動子。合 適的13酪蛋白啟動子如上所述。整合的質(zhì)粒可以含有抗生素抗性基因，如新霉素抗性基 因。此外，整合質(zhì)?？梢允莗PmhuIP。整合質(zhì)粒還可以包含一個或多個其他遺傳元件，這些 遺傳元件將增強質(zhì)粒穩(wěn)定性，增強從質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄的mRNA的穩(wěn)定性，降低修飾的胰島素前體的 降解和/或提高修飾的胰島素前體的表達。合適的遺傳元件包括，但不限于，調(diào)控元件(例 如，啟動子、增強子、絕緣子或轉(zhuǎn)錄終止位點)、不是胰島素基因編碼序列的片段或不是胰島 素基因的編碼序列。整合質(zhì)?？梢允莗NJK IP或pPKLE IP。 此外，本發(fā)明涉及從在其奶中產(chǎn)生失活蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶中純化失活形
式目標蛋白的方法。純化方法可以包括色譜和過'—，驟?？梢允褂貌煌愋偷纳V，并包
括離子交換色譜或反相色譜。離子交換色譜可以是陽離子交換色譜。此外，可以進行多個 色譜步驟。 本發(fā)明進一步涉及從在其奶中產(chǎn)生失活蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶中純化 失活形式目標蛋白的方法，包括從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物獲得奶，將非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的 奶澄清，獲得澄清的奶，并使澄清的奶接受色譜，獲得純失活蛋白。色譜步驟可以包括離子 交換色譜或反相色譜。反相色譜可以使用反相基質(zhì)，如C4或C18反相基質(zhì)。此外，可以進 行多個色譜步驟。 本發(fā)明進一步涉及從在其奶中產(chǎn)生失活蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶中純化
13失活形式目標蛋白的方法，包括從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物獲得奶，將非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的 奶澄清，獲得澄清的奶，并使澄清的奶接受陽離子交換色譜，獲得陽離子交換色譜處理過的 材料，使陽離子交換色譜處理過的材料接受反相色譜，獲得純失活蛋白。 本發(fā)明的失活蛋白可以是重組的修飾胰島素前體，優(yōu)選，重組修飾的哺乳動物胰 島素前體，更優(yōu)選，重組修飾的人胰島素前體，重組修飾的牛胰島素前體，重組修飾的豬胰 島素前體，重組修飾的綿羊胰島素前體，重組修飾的公山羊胰島素前體或重組修飾的嚙齒 動物胰島素前體，并最優(yōu)選，重組修飾的人胰島素前體。此外，修飾的胰島素前體沒有在表 達修飾胰島素前體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物中引起低血糖。在修飾的胰島素前體中，編碼在 天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的連接C肽的氨基酸由未在天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的氨 基酸替代。在實施方案中，修飾的C肽含有以下三個氨基酸Ala-Ala-Lys。此外，修飾的胰 島素前體可以含有修飾的B鏈。在實施方案中，修飾的B鏈含有天然存在B鏈的幾乎所有 的C-端氨基酸。非人哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的哺乳動物。轉(zhuǎn)基因哺乳動物的 其他物種可以是，但不限于，豬物種、綿羊物種、公山羊物種或嚙齒動物物種。
本發(fā)明進一步涉及將失活形式的目標蛋白轉(zhuǎn)化成成熟(即，活性)形式目標蛋白 的方法，然后純化目標蛋白。轉(zhuǎn)化可以包括目標蛋白前體的酶切割。酶切割可以涉及胰蛋 白酶水解(trypsinolysis)。目標蛋白的純化可以包括色譜步驟。這些色譜步驟可以包括 反相色譜。反相色譜可以使用反相基質(zhì)，C4或C18反相基質(zhì)。此外，可以進行多個色譜步 驟。 本發(fā)明進一步涉及將重組修飾的胰島素前體轉(zhuǎn)化成重組胰島素的方法，然后純化 重組胰島素。轉(zhuǎn)化可以包括重組修飾的胰島素前體的酶切割和轉(zhuǎn)肽作用。酶切割可以涉及 胰蛋白酶水解。重組胰島素的純化可以包括色譜步驟。這些色譜步驟可以包括反相色譜或 離子交換色譜。此外，可以進行多個色譜步驟。 本發(fā)明還涉及將重組修飾的胰島素前體轉(zhuǎn)化成重組胰島素的方法，然后純化重組 胰島素。該方法包括使重組修飾的胰島素前體接受胰蛋白酶水解和轉(zhuǎn)肽作用，形成胰蛋白 酶水解和轉(zhuǎn)肽的材料，使胰蛋白酶水解和轉(zhuǎn)肽的材料接受第一個反相色譜，形成第一個反 相色譜處理過的材料，使第一個反相色譜處理過的材料接受第二個反相色譜，形成第二個 反相色譜處理過的材料，并使第二個反相色譜處理過的材料接受第三個反相色譜，形成純 的重組胰島素。反相色譜的步驟包括使用反相基質(zhì)，優(yōu)選C4或C18反相基質(zhì)。
重組胰島素和重組修飾的胰島素前體可以分別是，重組哺乳動物胰島素和重組修 飾的哺乳動物胰島素前體，更優(yōu)選，各自為重組人胰島素和重組修飾的人胰島素前體，重組 牛胰島素和重組修飾的牛胰島素前體，重組豬胰島素和重組修飾的豬胰島素前體，重組綿 羊胰島素和重組修飾的綿羊胰島素，重組公山羊胰島素和重組修飾的公山羊胰島素，或重 組嚙齒動物胰島素和重組修飾的嚙齒動物胰島素前體，最優(yōu)選，重組人胰島素和重組修飾 的人胰島素前體。此外，修飾的胰島素前體不會在表達修飾胰島素前體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳 動物中引起低血糖。在修飾的胰島素前體中，編碼在天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的連接C 肽的氨基酸由未在天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的氨基酸替代。在實施方案中，修飾的C肽 含有以下三個氨基酸Ala-Ala-Lys。此外，修飾的胰島素前體可以含有修飾的B鏈。在實 施方案中，修飾的B鏈含有天然存在B鏈的幾乎所有的C-端氨基酸。 本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)目標蛋白的方法，包括制備在其奶中產(chǎn)生失活形式目標蛋
14白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物獲得奶，從奶純化失活蛋白，通過將純化 的失活蛋白接受酶切割在體外轉(zhuǎn)化失活蛋白，并最終純化目標蛋白。 本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)重組胰島素的方法，包括制備在其奶中產(chǎn)生重組修飾的胰 島素前體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物獲得奶，從奶純化重組修飾的胰 島素前體，通過使純化的前體接受酶切割和轉(zhuǎn)肽作用在體外將前體轉(zhuǎn)化成重組胰島素，并 最終純化重組胰島素。 此外，本發(fā)明還涉及生產(chǎn)重組胰島素的方法，包括制備在其奶中產(chǎn)生重組修飾的 胰島素前體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物，從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物獲得奶，將奶澄清，獲得澄清的 奶，使澄清的奶接受陽離子交換色譜，獲得陽離子交換色譜處理過的材料，使陽離子交換色 譜處理過的材料接受反相色譜，形成純的重組修飾的胰島素前體，使純的重組修飾的胰島 素前體接受胰蛋白酶水解和轉(zhuǎn)肽作用，獲得胰蛋白酶水解和轉(zhuǎn)肽的材料，使胰蛋白酶水解 和轉(zhuǎn)肽的材料接受第一個反相色譜，形成第一個反相色譜處理過的材料，使第一個反相色 譜處理過的材料接受第二個反相色譜，形成第二個反相色譜處理過的材料，并使第二個反 相色譜處理過的材料接受第三個反相色譜，形成純的重組胰島素。 重組胰島素和重組修飾的胰島素前體各自可以是，重組哺乳動物胰島素和重組修
飾的哺乳動物胰島素前體，更優(yōu)選，各自為重組人胰島素和重組修飾的人胰島素前體，重組
牛胰島素和重組修飾的牛胰島素前體，重組豬胰島素和重組修飾的豬胰島素前體，重組綿
羊胰島素和重組修飾的綿羊胰島素，重組公山羊胰島素和重組修飾的公山羊胰島素，或重
組嚙齒動物胰島素和重組修飾的嚙齒動物胰島素前體，最優(yōu)選，重組人胰島素和重組修飾
的人胰島素前體。非人哺乳動物可以是，但不限于，牛物種的哺乳動物。轉(zhuǎn)基因哺乳動物的
其他物種可以是，但不限于，豬物種、綿羊物種、公山羊物種或嚙齒動物物種。反相色譜的步
驟包括使用反相基質(zhì)，優(yōu)選C4或C18反相基質(zhì)。 以下實施例是本發(fā)明的各個方面和特征的說明，而非限制。 實施例1 表達質(zhì)粒的構(gòu)建 產(chǎn)生了構(gòu)建體，其含有大部分的牛13酪蛋白基因啟動子，包括5'非-編碼13酪 蛋白基因區(qū)的短片段，與修飾的人胰島素前體的編碼序列融合。短的非翻譯片段是P酪蛋 白基因的第一個外顯子的片段。所用的P酪蛋白基因為約3.8kb。 通過將修飾的人胰島素前體(mhuIP)的編碼序列和大部分的牛13酪蛋白基因啟 動子基因(對應于來自P酪蛋白基因5'區(qū)的3，800bp)插入合適的載體中來進行表達質(zhì) 粒pPmhuIP的構(gòu)建(參見圖1)。該啟動子確?；蛟谄淇刂葡陆M織特異性地和發(fā)育調(diào)控 地表達，在這種情況下為異源修飾的人胰島素前體。 為了轉(zhuǎn)基因細胞的正確選擇，在質(zhì)粒中包括編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因。該基 因使得可以用抗生素遺傳霉素來選擇轉(zhuǎn)基因細胞，并且其在SV40啟動子的控制下。
其他構(gòu)建體可以源自用來提高轉(zhuǎn)染細胞選擇或DNA整合至牛細胞基因組中的效 率的原始構(gòu)建體。 通過限制酶分析和DNA測序來分析構(gòu)建體。之前通過熒光抗體識別在乳腺細胞系
中測試了構(gòu)建體表達mhuIP的能力。 以下詳細地描述了質(zhì)粒p 13 mhuIP的制備。
p P mhuIP的制備 形成起始構(gòu)建，其包括編碼mhuIP (含有修飾C肽的人胰島素原)的序列。mhuIP
與人胰島素原相似，除了 mhuIP中的C肽比天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的C肽短。 圖2描繪了起始構(gòu)建的略圖。開始時，可以找到編碼牛信號肽的區(qū)域，接著是編碼
胰島素B鏈(缺乏C-端氨基酸)的序列。然后，可以找到編碼三個氨基酸的間隔區(qū)的區(qū)域，
Ala-Ala-Lys，其后是編碼.、"島素全部A鏈的序列，最后是編碼mRNA polyA的區(qū)域。三個
氨基酸間隔區(qū)，Ala-Ala-Lys，替代天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的C肽。 通過從6個重疊重建mhuIP序列產(chǎn)生了起始構(gòu)建，6個重疊是含有限制酶Bam HI
和Not I的識別位點的化學合成的寡核苷酸。引物序列如下所示 Insl :
CCCCCCCGGCCCG-3'
Ins2 :
CGGGCCGGGGGGGGG-3'
Ins3 :
TGCTGTACCAG-3'
Ins4 :
CTGGTACAGCA-3'
Ins5 :
TGCTGTGCCGTCTGT-3'
Ins6 :TGGGGCTTGGCCCAGGGCCCCCAAGACACACAGCAGGCACAGCA-3' 通過PCR進行重建過程。從引物Insl和Ins2 (產(chǎn)物f12) 、 Ins3和Ins4 (產(chǎn)物f34) 以及Ins5和Ins6 (產(chǎn)物f56)的混合物產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。然后在單個混合物中使用f12和f34 重疊片段來進行相同的過程，其獲得了產(chǎn)物f14。最終，在含有f56的混合物中在PCR中使 用f14產(chǎn)物，以擴增大約410bp的片段，其含有全長mhuIP (fl6)。 —旦獲得了片段fl6，將其克隆至合適的載體中，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌細菌細 胞中，用于進一步擴增帶有其相應插入片段的克隆載體。載體源自pBKCMV。 pBKCMV是獲自 Invitrogen Co. (Carlsbad, CA)的表達載體，其編碼CMV啟動子，新霉素抗性基因和卡那霉 素抗性基因。用3. 8kb牛13酪蛋白啟動子替代CMV啟動子，并使用Bam HI和Not I限制 位點將片段H6克隆至所得到的載體中。 擴增后，進行限制測試，以檢查克隆的插入片段的同一性。通過測序獲得最終的證 實。 此后，在4kb的牛13酪蛋白啟動子下游的質(zhì)粒載體中定向插入起始構(gòu)建體(BamHi/Not 1)。質(zhì)粒載體還含有新霉素抗性基因。所得到的載體pPmhuIP，其是最終的構(gòu)建 體，含有P酪蛋白啟動子，編碼mhuIP的序列和新霉素抗性基因。 人胰島素原由三個結(jié)構(gòu)域組成氨基末端B鏈(30個氨基酸)，羧基末端A鏈(21 個氨基酸)和中間稱為C肽的連接肽(31個氨基酸)。mhuIP不同于天然存在形式的人胰 島素原，因為B鏈的C-端氨基酸已經(jīng)除去，并且編碼C肽的氨基酸已經(jīng)由通常未在C肽中 發(fā)現(xiàn)的三個氨基酸Ala-Ala-Lys替代。在C肽切割后，形成了成熟的人胰島素，其僅由A鏈 和B鏈組成。表達人胰島素原的轉(zhuǎn)基因哺乳動物是無法生存的，因為宿主肽酶可以切割并 除去C肽，形成成熟的胰島素。如上所述，非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物中成熟人胰島素的表達可能 殺死哺乳動物，因為成熟的人胰島素可能滲漏至哺乳動物的血流中。相反，使用P P mhuIP 制得的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物表達修飾的人胰島素前體，其不會引起轉(zhuǎn)基因哺乳動物產(chǎn)生任 何明顯的低血糖并且對轉(zhuǎn)基因哺乳動物是無毒的。不希望受到以下的限制，因為編碼修飾 的人胰島素前體的三個氨基酸間隔區(qū)的區(qū)域不同于天然存在的人胰島素原中發(fā)現(xiàn)的C肽， 宿主肽酶沒有識別和切割三個氨基酸間隔區(qū)。因此，修飾的人胰島素前體保持失活并且沒 有在轉(zhuǎn)基因動物中引起低血糖，這是所要求保護的本發(fā)明的重要優(yōu)點。
選擇克隆，其含有13酪蛋白啟動子和正確融合的mhuIP，以在該啟動子控制下僅 表達mhuIP。 該表達質(zhì)粒的大小為約8. 4kbp。
體細胞的轉(zhuǎn)染 然后將質(zhì)粒p 13 mhuIP用于轉(zhuǎn)染體細胞的初級培養(yǎng)物，使用磷酸鈣或脂質(zhì)體方法。 通常將胎牛成纖維細胞用于轉(zhuǎn)染。 通過將遺傳霉素加入培養(yǎng)物中來選擇轉(zhuǎn)染的細胞。2至8周的時間段后，對遺傳霉 素有抗性的細胞適于用作供體細胞來獲得轉(zhuǎn)基因克隆。通過PCR來分析轉(zhuǎn)染的選擇細胞， 以證實細胞含有表達盒。
實施例2 卵母細胞去核和成熟去核卵母細胞中的中期核移植
牛卵母細胞的收集和體外成熟 從屠宰場卵巢中吸出牛卵母細胞并使之在TCM-199+5% FCS+3mMHEPES+殺真菌藥 中成熟。然后將選定的卵母細胞置于TCM-199+細胞周期蛋白依賴激酶中，在5% C02的氣 氛和39°CT 20小時。此后，將卵母細胞置于TCM-199+5% FCS+FSH(促卵泡激素)+抗生素 中，在5% C02的氣氛和39°CT 24小時。通過在含有l(wèi)mg/ml牛睪丸透明質(zhì)酸酶的PBS中 渦旋2分鐘來將成熟卵母細胞去核。
實施例3
使用卵丘細胞的核移植
去核 使用Narishige水壓顯微操作器和Nikon Diaphot顯微鏡將卵母細胞機械去 核。用20iim斜角和尖銳的移液管進行去核。之前用5iig/ml Bisbenzimidine (Hoechst 333421)染料將卵母細胞染色20分鐘。通過在紫外線下觀察染色的染色體來將中期去核。 在吸入移液管后，測定中期染色體。將轉(zhuǎn)基因體細胞轉(zhuǎn)染至卵周隙中，并與去核卵母細胞緊 密相對。
融合、激活和胚胎培養(yǎng) 將轉(zhuǎn)基因體細胞和去核的卵母細胞人工地排列在融合室中，使得待融合的膜與電 極平行。使用玻璃胚胎操作移液管來進行。 使用持續(xù)15 ii s的180伏特/cm的一個電脈沖進行融合(BTXElectro細胞操作儀 200"并用BTX Optimizer-Gr即hic脈沖分析儀。用于脈沖胚胎的室由安放在玻璃顯微鏡載 玻片上的相隔O. 5mm的兩個0. 5mm不銹鋼金屬絲電極構(gòu)成。融合后三小時，通過在TL-HEPES 中與5 y M離子要素一起培養(yǎng)4分鐘和在TCM-199中用2mM 6-DMAP培養(yǎng)3小時來誘導激活。
然后在5% C02+5% 02+90% N2的氣氛下，在SOF培養(yǎng)基中將激活的卵母細胞培養(yǎng) 6.5天，直到產(chǎn)生胚細胞。 此后，將胚胎移植至代孕母牛中。通常，每只受體奶牛非外科手術地移植兩個胚細 胞，并且在30-35天時通過超聲波檢查來確定妊娠。 使植入的奶牛正常地經(jīng)過妊娠直到自然分娩。最后，外科方法(Caesarea)可以用 于分娩。在頭48小時期間給新生兒喂養(yǎng)富含Ig的初乳，然后使用合成的食物，之后使用天 然的食物(所有這些食物都不含動物來源的化合物)。 _ Sigma Chemical Co. ， St. Louis， M0， USA 2BTX Inc. ， San Diego， Ca， USA 實施例4 對轉(zhuǎn)基因小牛進行的測試 該實施例中，我們呈現(xiàn)了對特定的轉(zhuǎn)基因小牛所進行測試的完整描述，該轉(zhuǎn)基因 小牛是作為實施例1至3中所述方法的結(jié)果而獲得的。盡管如此，應當保持清楚的是對作 為其它獲得轉(zhuǎn)基因小牛方法的.".，.而出生的牛可以進行同一套的測定，這些其他方法如 轉(zhuǎn)基因雌性的亞克隆、轉(zhuǎn)基因雌性的超排卵，接著人工授精，或用來自對所需蛋白為轉(zhuǎn)基因 的公牛的精子將轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因雌性人工授精。 通過對從小牛白細胞中純化得到的DNA進行PCR反應，使用來自非轉(zhuǎn)基因jersey 小牛的DNA作為負對照，證明了在轉(zhuǎn)基因小牛細胞的基因組中包括牛13酪蛋白啟動子和編 碼修飾的人胰島素前體的序列。可以作為不同于小牛的同源P酪蛋白基因的獨特DNA片 段一起發(fā)現(xiàn)它們。 使用Pharmacia自動測序儀，證實了插入的序列對應于克隆質(zhì)粒中所含的編碼修 飾的人胰島素前體的序列。插入的序列包括分泌信號和終止子。將控制修飾的人胰島素前 體序列在我們的小牛中表達的牛13酪蛋白啟動子也進行了測序。所有那些元件與其預期 的理論序列精確地一致，該理論序列來自用于轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了克隆的細胞的遺傳構(gòu)建體。
實施例5 從奶中純化重組的mhuIP，將mhuIP轉(zhuǎn)化成人胰島素和人胰島素的純化
從轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的發(fā)酵獲得為研發(fā)從奶中純化前 體的程序所需量的重組mhuIP蛋白。為此，在通過甲醇可誘導的啟動子的控制下，將編碼 mhuIP的序列亞克隆至酵母分泌信號序列下游的表達載體中，并在酵母細胞中轉(zhuǎn)化。
此后，進行合適克隆的選擇并從選定的克隆制得液體培養(yǎng)物。 在含有作為碳源的甘油、少量元素的培養(yǎng)基中進行轉(zhuǎn)化的酵母克隆的發(fā)酵。將甲得0.5克mhuIP/升培養(yǎng)物。
—旦發(fā)酵結(jié)束，進行純化步驟來獲得純產(chǎn)物。 最初的目標是從酵母培養(yǎng)物獲得純的重組mhuIP。因此，用純水將轉(zhuǎn)化的巴斯德 畢赤酵母培養(yǎng)物的上清液稀釋十倍，并使用冰醋酸將其PH調(diào)節(jié)至3. 0。證實該溶液的傳導 率，使得其沒有呈現(xiàn)高于7mS/cm的值。此后進行純化過程，以獲得用于研發(fā)從轉(zhuǎn)基因哺乳 動物的奶中純化重組mhuIP的方法的起始材料，并進一步將其轉(zhuǎn)化成重組人胰島素。
首先，使上述溶液接受陽離子交換色譜步驟，使用SP S印haroseFF樹脂 (Amersham)，以100cm/h的流速。使用5%醋酸進行柱的裝載(每mL樹脂裝載10mL上清 液)和平衡。為了蛋白質(zhì)的洗脫，使用pH 3的5%醋酸1M NaCl的梯度，在25個柱體積
的總體積中，從ioo : o的溶液比例開始，直到達到o : ioo的溶液比例。 在第二個純化步驟中，使來自陽離子交換色譜的洗出液接受反相色譜。用純水將 之前的洗出液稀釋五倍，并用三氟醋酸(TFA)將pH調(diào)節(jié)至3。 將所得到的溶液裝載至含有C4 Baker Wide Pore樹脂的柱中。將流動設定為 100cm/h的速率。為了裝載和平衡，使用了 0. 1 %的TFA/水。為了洗脫，使用0. 1 % TFA/
水-乙腈梯度，在50個柱體積的總體積中，從i00 : o的溶液比例開始，直到達到o : ioo
的溶液比例。 之前純化步驟的總產(chǎn)率大約為42%，并獲得了純度高于95%的mhuIP。 研發(fā)了以下的方法，其包括從奶中純化重組mhuIP(因為轉(zhuǎn)基因哺乳動物將在其
奶中分泌前體)，將重組mhuIP轉(zhuǎn)化成重組人胰島素和重組人胰島素的最終純化。通過將純
的重組mhuIP(獲自巴斯德畢赤酵母，如上所述)與常規(guī)牛奶混合來獲得用于該研發(fā)的起始材料。 研發(fā)了徹底的純化方法。該方法包括以下步驟通過切向過濾獲得奶泡，稀釋所 獲得的洗出液來獲得最終保留在酪蛋白膠束中的重組mhuIP更好的溶解度(澄清)；并將 該溶液通過陽離子交換色譜柱。使所得到的溶液接受反相色譜(C4)步驟，此后使富含重組 mhuIP的級分接受胰蛋白酶水解和轉(zhuǎn)肽作用。最后，進行重組人胰島素的純化，因為在制造 生物藥品時，將目標蛋白純化至同質(zhì)性以避免產(chǎn)品中可能污染物的存在是強制性的。
用于從奶中純化重組mhuIP，之后轉(zhuǎn)化成重組人胰島素和重組人胰島素最終純化
的程序包括以下次序的步驟(a)切向流過;:',,、:」:.請)，(b)陽離子交換色譜，(c)反相色 譜(C4)， (d)胰蛋白酶分解和轉(zhuǎn)肽作用，(e)反相色譜(C4)， (f)反相色譜(C4)和(g)反相 色譜(C18)。
澄清 將鮮奶與足量的純重組mhuIP混合，重組mhuIP如之前所述在巴斯德畢赤酵母 中產(chǎn)生。此后，將產(chǎn)物接受切向流過濾步驟。濾器孔徑大小為O. lym，并且該方法產(chǎn)率為 80%。 陽離子交換色譜 對從之前步驟得到的材料進行色譜處理，使用陽離子交換基質(zhì)。用冰醋酸將待色 譜的溶液的pH調(diào)節(jié)至3. 0。檢查傳導率，使其不高于7mS/cm。 使用流速為100cm/h的SP S印harose FF樹脂(Amersham)進行色譜步驟。使用 5%醋酸進行柱的裝載和平衡。為了蛋白質(zhì)的洗脫，使用pH 3的5%醋酸1M NaCl的梯
19度，在25個柱體積的總體積中，從100 : o的溶液比例開始，直到達到o : ioo的溶液比例。 色譜步驟具有90%的產(chǎn)率。測定選定的含有重組mhuIP的級分的總蛋白(通過 Bradford方法)和目標蛋白(通過Western印跡)，并貯存于2-8°C 。
反相色譜(1) 然后使從之前步驟得到的材料接受反相色譜，使用C4 Baker WidePore樹脂。將 流動設定為100cm/h的速率。為了裝載和平衡，使用了 0. 1X的TFA/水。為了洗脫，使用 0. 1XTFA/水-乙腈梯度，在50個柱體積的總體積中，從100 : O的溶液比例開始，直到達
到o : ioo的溶液比例。 該步驟具有68%的產(chǎn)率。
胰蛋白酶水解和轉(zhuǎn)肽作用
用胰蛋白酶處理從之前步驟得到的材料。 為了胰蛋白酶水解，用胰蛋白酶(以200iiM的濃度)在12。C下將10mM mhuIP溶 液培養(yǎng)24小時。 —旦結(jié)束培養(yǎng)，進行轉(zhuǎn)肽反應，以在人胰島素B鏈的位置30添加蘇氨酸。為此，制 備含有0.8M Thr-0bu，50% DMF/EtOH(1 : 1) ， 26% H20，醋酸，10mM mhuIP禾口 200 ii M胰蛋 白酶的溶液，并使轉(zhuǎn)肽反應進行直到完全。 —旦轉(zhuǎn)肽步驟已經(jīng)結(jié)束，使所得到的溶液接受三次連續(xù)的反相色譜步驟，以產(chǎn)生
純的重組人胰島素。 反相色譜(2) 使從之前步驟得到的材料接受反相色譜。 首先，使用50mM NaH2P04，pH 5. 0將之前消化的材料稀釋至0. 125mg/mL。此后，加 入50 ii L醋酸/100mL溶液。然后樣品是清澈的，pH大約為4. 5，并且樣品是即可裝載的。
緩沖液組成如下所述移動相A (MPA) :210mL硫酸鹽緩沖液+790mL純水(大約48mS的傳導率)。
移動相B(MPB) :105mL硫酸鹽緩沖液+40%乙腈，純水q. s. p.至1L。
1L硫酸鹽緩沖液含有132. lgr. NH4S04， 14mL H2S04，并且將其pH調(diào)節(jié)至2. 00。
裝載后，如下以100cm/h的流速進行洗脫首先，使用MPA-MPB梯度，在135mL的 總體積中，從IOO : 0的溶液比例開始，直到達到55 : 45的溶液比例；此后，使用另一個 MPA-MPB梯度，在360mL的總體積中，從55 : 45的溶液比例開始，直到達到25 : 75的溶液 比例；并且最后，使用最終的MPA-MPB梯度，在50mL的總體積中，從25 : 75的溶液比例開 始，直到達到0 : IOO的溶液比例。 所獲得的級分含有純度超過98%的重組人胰島素，并且該步驟的產(chǎn)率大約為 85%。 反相色譜(3) 對于該步驟，通過將其pH調(diào)節(jié)至7. 4，對從之前步驟獲得的材料進行調(diào)節(jié)。
然后使用C4Baker Wide Pore基質(zhì)對所得到的溶液進行色譜。將流動設定為 100cm/h的速率。為了裝載和平衡，使用了 0. 1 %的TFA/水。為了洗脫，使用0. 1 % TFA/
水-乙腈梯度，在50個柱體積的總體積中，從100 : o的溶液比例開始，直到達到o : ioo
的溶液比例。
該步驟具有大約65%的產(chǎn)率。
反相色譜(4) 對于最終的反相色譜步驟，通過將其pH調(diào)節(jié)至3. O，對從之前步驟獲得的材料進 行調(diào)節(jié)。 然后使用C18反相基質(zhì)對調(diào)節(jié)過的材料進行色譜。將流動設定為100cm/h的速率。 為了裝載和平衡，使用了 0. 1 %的TFA/水。為了洗脫，使用0. 1 % TFA/水-乙腈梯度，在50
個柱體積的總體積中，從ioo : o的溶液比例開始，直到達到o : ioo的溶液比例。 該步驟具有大約61%的產(chǎn)率。 實施例6 表達質(zhì)粒pNJK IP的構(gòu)建 產(chǎn)生了在轉(zhuǎn)基因牛乳腺中中表達mhuIP的備選構(gòu)建體，其含有大部分的公山羊13 酪蛋白基因啟動子，其與雞P球蛋白絕緣子的編碼序列的片段融合。絕緣子是保護啟動子 不受鄰近調(diào)控元件影響的DNA序列元件，鄰近的調(diào)控序列包括鄰近的抑制基因表達的沉默 序列。產(chǎn)生了這種含有雞P球蛋白絕緣子的備選構(gòu)建體，以阻斷P酪蛋白啟動子受任何 鄰近沉默序列的抑制。 進行了這種備選質(zhì)粒的構(gòu)建，首先，通過從pBCl (其是可從Invitrogen Co. (Carlsbad,CA)獲得的商業(yè)載體)切除15kb片段，其含有雞P球蛋白絕緣子的2.4kb 片段，3. lkb的公山羊13酪蛋白啟動子序列，包括來自公山羊13酪蛋白基因的內(nèi)含子和非 翻譯外顯子，內(nèi)含子和非翻譯外顯子之間的來自公山羊13酪蛋白基因的Xho I克隆位點， 以及來自3' 13酪蛋白基因組序列的poly A信號和側(cè)翼區(qū)。 將該15kb片段克隆至p!3mhuIP的主鏈中。首先，從p P mhuIP切除3. 8kb牛P酪 蛋白啟動子和mhuIP片段。使用Sal I和Not I限制位點將15kb片段插入該載體中。然 后，將410bp mhuIP fl6片段克隆至位于15kb片段中的Xho I克隆位點(在來自公山羊P 酪蛋白基因的內(nèi)含子和非翻譯外顯子之間，如上所述)。 將所得到的載體(pNJK IP，圖3)轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的大腸桿菌細菌細胞中，用于進一 步擴增含有其對應插入片段的克隆載體。 擴增后，進行限制位點分析來檢查mhuIP fl6片段插入片段的方向。通過測序獲
得最終的證實。
實施例7 表達質(zhì)粒p P KLEIP的構(gòu)建 產(chǎn)生了在轉(zhuǎn)基因牛乳腺中中表達mhuIP的備選構(gòu)建體，其含有大部分的牛13酪 蛋白基因啟動子，包括|3酪蛋白基因的第一個外顯子的短的非翻譯片段，其與大部分的牛 a乳清蛋白基因的編碼序列融合，接著為腸激酶切割位點，其接著為修飾的人胰島素前體 (mhuIP)的編碼序列。該備選構(gòu)建體表達a乳清蛋白-mhuIP融合蛋白。由于其較大的序 列，該備選構(gòu)建體應當產(chǎn)生具有較高穩(wěn)定性的mRNA。此外，因為a乳清蛋白是在牛乳腺中 天然表達的蛋白，該備選構(gòu)建體應當最小化mhuIP降解和提高mhuIP表達。
為了產(chǎn)生該構(gòu)建體，首先，使用來自牛外周血的白細胞的DNA作為模板來進行PCR 反應，以克隆大部分的a乳清蛋白基因。PCR產(chǎn)物包含約700bp的a乳清蛋白直到第二個 外顯子結(jié)束，并包括a乳清蛋白信號序列。
第一個PCR反應使用了以下寡核苷酸NES :GGA GGT GAG CAG TGT GGT GACALB :GAA GTT ACT CAC TGT CAC AGG AGA 然后，進行了第二個PCR反應，使用以下寡核苷酸 SIG :TCA CCA AAA TGA TGT CCT TTG TCLAC :TGT CAC AGG AGA TGT TAC AGA 通過該程序，獲得了 620bp片段并使用Sma I限制位點克隆至pUC中(pUC a乳清 蛋白)。 通過PCR從內(nèi)部的IP克隆質(zhì)粒獲得帶有mhuIP基因的片段，使用以下的寡核苷 酸 EKB :tag get age gat gat gat gat aaa ttc gtt aac cag cac ctg
CadAr :tca gcg gec gc tta gtt gca gta gtt 所得到的260bp片段包括編碼腸激酶識別位點的短序列，該腸激酶識別位點在 mhuIP的編碼序列的上游。腸激酶切割位點使得IP可以與剩余的肽分離。然后用NheI消 化260bp片段并插入pUC a乳清蛋白中相當?shù)腦ba I限制位點。選擇所得到的構(gòu)建體，其 中260bp片段位于構(gòu)建體方向中的a乳清蛋白基因的下游。該構(gòu)建體具有大部分的牛a 乳清蛋白基因的編碼序列，包括a乳清蛋白信號序列，接著是腸激酶識別位點，其進一步 接著修飾的人胰島素前體(mhuIP)的編碼序列。 首先用EcoRI消化pUC a乳清蛋白質(zhì)粒，并用Klenow處理所得到的粘性末端。此 外，進行了NotI消化并分離所得到的基因片段。在位于所述啟動子區(qū)域3'端的唯一BamH I位點中消化帶有P酪蛋白啟動子的PBK質(zhì)粒，用于待連接的a乳清蛋白基因融合體。因 此，還將BamHI位點鈍化來連接來自該片段的EcoR I鈍化端，在給插入片段的NotI端提供 同源末端之前，還進行了 pBK質(zhì)粒的NotI消化。 然后將pPKLE IP轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌細菌細胞中，用于帶有其對應插入片段
的克隆載體的進一步擴增。 擴增后，通過測序獲得最終的證實。 現(xiàn)在已經(jīng)充分地描述了本發(fā)明，本領域普通技術人員將會理解可以在寬泛而等價 范圍的條件、制劑和其他參數(shù)內(nèi)進行本發(fā)明，而不影響本發(fā)明或其任何實施方案的范圍。在 此引用的所有專利和出版物在此以其整體全部引入作為參考。
權(quán)利要求
生產(chǎn)胰島素的方法，包括a)制備在其奶中產(chǎn)生修飾的胰島素前體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物；b)從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物獲得奶；c)從奶中純化修飾的胰島素前體，得到純的修飾的胰島素前體；d)將純的修飾的胰島素前體轉(zhuǎn)化成胰島素；和e)純化胰島素。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物通過包括以下步驟的方法制得a) 將編碼修飾的胰島素前體的核酸序列克隆至質(zhì)粒中，由此將該序列可操作地連接到 將指導該序列在乳房細胞中表達的啟動子上，得到表達質(zhì)粒；b) 用表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體細胞，使得質(zhì)粒摻入到體細胞的基因組中，得到轉(zhuǎn)基因體細胞；c) 將成熟的卵母細胞去核，得到去核的卵母細胞；d) 將一個轉(zhuǎn)基因體細胞與去核的卵母細胞融合，得到單細胞胚胎；e) 將胚胎植入受體哺乳動物的子宮中；禾口f) 監(jiān)控懷孕直到轉(zhuǎn)基因哺乳動物的出生。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中啟動子是|3酪蛋白啟動子，并且其中修飾的胰島素前體是 修飾的哺乳動物胰島素前體。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中修飾的哺乳動物胰島素前體是修飾的人胰島素前體、修飾 的牛胰島素前體、修飾的豬胰島素前體、修飾的綿羊胰島素前體、修飾的公山羊胰島素前體 或修飾的嚙齒動物胰島素前體。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中修飾的哺乳動物胰島素前體是修飾的人胰島素前體。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中表達質(zhì)粒進一步包含新霉素抗性基因。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中表達質(zhì)粒是p 13 mhuIP。
8. 權(quán)利要求6的方法，其中表達質(zhì)粒是pNJK IP。
9. 權(quán)利要求6的方法，其中表達質(zhì)粒是p 13 KLE IP。
10. 權(quán)利要求2的方法，其中哺乳動物是在其奶中產(chǎn)生修飾的人胰島素前體的牛，其基 因組包含整合的質(zhì)粒，其中該質(zhì)粒包含編碼修飾的人胰島素前體的序列和指導該序列在哺 乳動物的乳房細胞中表達的P酪蛋白啟動子。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中質(zhì)粒進一步包含新霉素抗性基因。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中質(zhì)粒是pPmhu IP。
13. 權(quán)利要求ll的方法，其中質(zhì)粒是pNJK IP。
14. 權(quán)利要求2的方法，其中哺乳動物是在其奶中產(chǎn)生融合蛋白的牛，該融合蛋白包含 a乳清蛋白的片段、腸激酶切割位點和修飾的人胰島素前體，該牛的基因組包含整合的質(zhì) 粒，其中該質(zhì)粒包含編碼融合蛋白的序列和指導該序列在哺乳動物的乳房細胞中表達的P 酪蛋白啟動子。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中質(zhì)粒進一步包含新霉素抗性基因。
16. 權(quán)利要求15的方法，其中質(zhì)粒是pPKLE IP。
17. 權(quán)利要求2的方法，其中體細胞是成纖維細胞。
18. 權(quán)利要求2的方法，其中通過從用于在其奶中生產(chǎn)修飾的胰島素前體的雌性轉(zhuǎn)基 因動物分離來獲得轉(zhuǎn)基因體細胞。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中轉(zhuǎn)基因體細胞是成纖維細胞。
20. 權(quán)利要求1、2或18的方法，其中哺乳動物屬于牛物種、豬物種、綿羊物種、公山羊物 種或嚙齒動物物種。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中哺乳動物屬于牛物種。
22. 權(quán)利要求1、2或18的方法，其中胰島素和修飾的胰島素前體分別為哺乳動物胰島 素和修飾的哺乳動物胰島素前體。
23. 權(quán)利要求22的方法，其中哺乳動物胰島素和修飾的哺乳動物胰島素前體各自為人 胰島素和修飾的人胰島素前體、牛胰島素和修飾的牛胰島素前體、豬胰島素和修飾的豬胰 島素前體、綿羊胰島素和修飾的綿羊胰島素前體、公山羊胰島素和修飾的公山羊胰島素前 體、或嚙齒動物胰島素和修飾的嚙齒動物胰島素前體。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中哺乳動物胰島素和修飾的哺乳動物胰島素前體各自為人 胰島素和修飾的人胰島素前體。
25. 權(quán)利要求1、2或18的方法，其中修飾的胰島素前體不會在非人轉(zhuǎn)基因動物中引起 低血糖。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中修飾的胰島素前體包含修飾的C肽。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中修飾的C肽包含通常未在天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的氨基酸。
28. 權(quán)利要求27的方法，其中修飾的C肽包含以下三個氨基酸Ala-Ala-Lys。
29. 權(quán)利要求26的方法，其中修飾的胰島素前體進一步包含修飾的B鏈。
30. 權(quán)利要求29的方法，其中修飾的B鏈包含天然存在B鏈的幾乎所有C-末端氨基酸。
31. 權(quán)利要求1、2或18的方法，其中在哺乳動物的體細胞和生殖細胞中都發(fā)現(xiàn)了編碼 修飾的胰島素前體的序列，其可操作地八'..指導該核酸序列在乳房細胞中表達的啟動 子上。
32. 從在其奶中產(chǎn)生修飾的胰島素前體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶中純化修飾的胰島 素前體的方法，包括a) 將非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶澄清，得到澄清的奶；禾口b) 將澄清的奶進行色譜處理，得到純的修飾的胰島素前體。
33. 權(quán)利要求32的方法，其中色譜是離子交換色譜或反相色譜。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中進行多個色譜步驟。
35. 權(quán)利要求33的方法，其中離子交換色譜是陽離子交換色譜。
36. 從在其奶中產(chǎn)生修飾的胰島素前體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶中純化修飾的胰島 素前體的方法，包括a) 將非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶澄清，得到澄清的奶；b) 使澄清的奶接受陽離子交換色譜，得到陽離子交換色譜處理過的材料；禾口c) 使陽離子交換色譜處理過的材料接受反相色譜，得到純的修飾的胰島素前體。
37. 權(quán)利要求32或36的方法，其中修飾的胰島素前體是修飾的哺乳動物胰島素前體。
38. 權(quán)利要求37的方法，其中修飾的哺乳動物胰島素前體是修飾的人胰島素前體、修 飾的牛胰島素前體、修飾的豬胰島素前體、修飾的綿羊胰島素前體，修飾的公山羊胰島素前體或修飾的嚙齒動物胰島素前體。
39. 權(quán)利要求38的方法，其中修飾的哺乳動物胰島素前體是修飾的人胰島素前體。
40. 權(quán)利要求32或36的方法，其中非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物屬于牛物種。
41. 權(quán)利要求32或36的方法，其中非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物是豬、綿羊、山羊或嚙齒動物。
42. 權(quán)利要求32或36的方法，其中修飾的胰島素前體不會在非人轉(zhuǎn)基因動物中引起低 血糖。
43. 權(quán)利要求42的方法，其中修飾的胰島素前體包括修飾的C肽。
44. 權(quán)利要求43的方法，其中修飾的C肽包含通常未在天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的氨基酸。
45. 權(quán)利要求44的方法，其中修飾的C肽包含以下三個氨基酸Ala-Ala-Lys。
46. 權(quán)利要求43的方法，其中修飾的胰島素前體進一步包含修飾的B鏈。
47. 權(quán)利要求46的方法，其中修飾的B鏈包含天然存在B鏈的幾乎所有C-末端氨基酸。
48. 將修飾的胰島素前體轉(zhuǎn)化成胰島素，并純化胰島素的方法，包括a) 對修飾的胰島素前體進行酶切割和轉(zhuǎn)肽作用，得到切割的和轉(zhuǎn)肽的材料，b) 使切割的和轉(zhuǎn)肽的材料接受色譜處理，得到純的胰島素。
49. 權(quán)利要求48的方法，其中酶切割是胰蛋白酶水解。
50. 權(quán)利要求48的方法，其中色譜是反相色譜。
51. 權(quán)利要求50的方法，其中進行多個色譜步驟。
52. 權(quán)利要求51的方法，其中進行三個色譜步驟。
53. 權(quán)利要求52的方法，其中色譜步驟包括使用反相基質(zhì)。
54. 權(quán)利要求53的方法，其中反相基質(zhì)是C4或C18反相基質(zhì)。
55. 將修飾的胰島素前體轉(zhuǎn)化成胰島素，并純化胰島素的方法，包括a) 對修飾的胰島素前體進行胰蛋白酶水解和轉(zhuǎn)肽作用，得到胰蛋白酶水解和轉(zhuǎn)肽的材料；b) 使胰蛋白酶水解和轉(zhuǎn)肽的材料接受第一個反相色譜，得到第一個反相色譜處理過的 材料；c) 使第一個反相色譜處理過的材料接受第二個反相色譜，得到第二個反相色譜處理過 的材料；和d) 使第二個反相色譜處理過的材料接受第三個反相色譜，得到純的胰島素。
56. 權(quán)利要求55的方法，其中反相色譜步驟包括使用反相基質(zhì)。
57. 權(quán)利要求56的方法，其中反相色譜基質(zhì)是C4或C18反相基質(zhì)。
58. 權(quán)利要求48或55的方法，其中胰島素和修飾的胰島素前體分別為哺乳動物胰島素 和修飾的哺乳動物胰島素前體。
59. 權(quán)利要求58的方法，其中哺乳動物胰島素和修飾的哺乳動物胰島素前體各自為人 胰島素和修飾的人胰島素前體、牛胰島素和修飾的牛胰島素前體、豬胰島素和修飾的豬胰 島素前體、綿羊胰島素和修飾的綿羊胰島素前體、公山羊胰島素和修飾的公山羊胰島素前 體、或嚙齒動物胰島素和修飾的嚙齒動物胰島素前體。
60. 權(quán)利要求59的方法，其中哺乳動物胰島素和修飾的哺乳動物胰島素前體分別為人胰島素和修飾的人胰島素前體。
61. 權(quán)利要求48或55的方法，其中修飾的胰島素前體不會在非人轉(zhuǎn)基因動物中引起低 血糖。
62. 權(quán)利要求61的方法，其中修飾的胰島素前體包括修飾的C肽。
63. 權(quán)利要求62的方法，其中修飾的C肽包含通常未在天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的氨基酸。
64. 權(quán)利要求63的方法，其中修飾的C肽包含以下三個氨基酸Ala-Ala-Lys。
65. 權(quán)利要求62的方法，其中修飾的胰島素前體進一步包含修飾的B鏈。
66. 權(quán)利要求65的方法，其中修飾的B鏈包含天然存在B鏈的幾乎所有C-末端氨基酸。
67. 權(quán)利要求1的方法，其中從奶中純化修飾的胰島素前體包括a) 將非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶澄清，得到澄清的奶；禾口b) 使澄清的奶接受色譜處理，得到純的修飾的胰島素前體。
68. 權(quán)利要求67的方法，其中色譜是離子交換色譜或反相色譜。
69. 權(quán)利要求68的方法，其中進行多個色譜步驟。
70. 權(quán)利要求68的方法，其中離子交換色譜是陽離子交換色譜。
71. 權(quán)利要求1的方法，其中修飾的胰島素前體轉(zhuǎn)化成胰島素，包括a) 使修飾的胰島素前體接受酶切割和轉(zhuǎn)肽作用，得到切割和轉(zhuǎn)肽的材料；b) 使切割和轉(zhuǎn)肽的材料接受色譜處理，得到純的胰島素。
72. 權(quán)利要求71的方法，其中酶切割是胰蛋白酶水解。
73. 權(quán)利要求71的方法，其中色譜是反相色譜。
74. 權(quán)利要求73的方法，其中進行多個色譜步驟。
75. 權(quán)利要求74的方法，其中進行三個色譜步驟。
76. 權(quán)利要求75的方法，其中色譜步驟包括使用反相基質(zhì)。
77. 權(quán)利要求76的方法，其中反相基質(zhì)是C4或C18反相基質(zhì)。
78. 生產(chǎn)胰島素的方法，包括a) 制備在其奶中產(chǎn)生修飾的胰島素前體的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物；b) 從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物獲得奶；c) 將奶澄清，得到澄清的奶；d) 使澄清的奶接受陽離子交換色譜，得到陽離子交換色譜處理過的材料；e) 使陽離子交換色譜處理過的材料接受反相色譜，得到純的修飾的胰島素前體；f) 使純的修飾的胰島素前體接受胰蛋白酶水解和轉(zhuǎn)肽作用，得到胰蛋白酶水解和轉(zhuǎn)肽 的材料；g) 使胰蛋白酶水解和轉(zhuǎn)肽的材料接受第一個反相色譜，得到第一個反相色譜處理過的 材料；h) 使第一個反相色譜處理過的材料接受第二個反相色譜，得到第二個反相色譜處理過 的材料；和i) 使第二個反相色譜處理過的材料接受第三個反相色譜，得到純的胰島素。
79. 權(quán)利要求78的方法，其中反相色譜步驟包括使用反相基質(zhì)。
80. 權(quán)利要求79的方法，其中反相基質(zhì)是C4或C18反相基質(zhì)。
81. 權(quán)利要求78的方法，其中胰島素和修飾的胰島素前體分別為哺乳動物胰島素和修 飾的哺乳動物胰島素前體。
82. 權(quán)利要求81的方法，其中哺乳動物胰島素和修飾的哺乳動物胰島素前體各自為人 胰島素和修飾的人胰島素前體、牛胰島素和修飾的牛胰島素前體、豬胰島素和修飾的豬胰 島素前體、綿羊胰島素和修飾的綿羊胰島素前體、公山羊胰島素和修飾的公山羊胰島素節(jié) 體或嚙齒動物胰島素和修飾的嚙齒動物胰島素前體。
83. 權(quán)利要求82的方法，其中哺乳動物胰島素和修飾的哺乳動物胰島素前體各自為人 胰島素和修飾的人胰島素前體。
84. 權(quán)利要求78的方法，其中非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物屬于牛物種。
85. 權(quán)利要求78的方法，其中非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物是豬、綿羊、山羊或嚙齒動物。
86. 權(quán)利要求78的方法，其中修飾的胰島素前體不會在非人轉(zhuǎn)基因動物中引起低血糖。
87. 權(quán)利要求86的方法，其中修飾的胰島素前體包含修飾的C肽。
88. 權(quán)利要求87的方法，其中修飾的C肽包含通常未在天然存在的胰島素原中發(fā)現(xiàn)的氨基酸。
89. 權(quán)利要求88的方法，其中修飾的C肽包含以下三個氨基酸Ala-Ala-Lys。
90. 權(quán)利要求87的方法，其中修飾的胰島素前體進一步包含修飾的B鏈。
91. 權(quán)利要求90的方法，其中修飾的B鏈包含天然存在B鏈的幾乎所有C-末端氨基
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)對哺乳動物可能有毒的目標蛋白的非人轉(zhuǎn)基因動物。該哺乳動物的特征在于以下事實其是轉(zhuǎn)基因的，用于在其奶中產(chǎn)生失活形式的目標蛋白，優(yōu)選重組人胰島素。不可能在轉(zhuǎn)基因哺乳動物中產(chǎn)生重組人胰島素，因為該分子在哺乳動物中具有一定程度的生物活性，并可能對哺乳動物是有毒的。因此，本發(fā)明涉及克隆遺傳構(gòu)建體，該遺傳構(gòu)建體包含編碼修飾的人胰島素前體的序列，該序列處于表達載體中的β酪蛋白啟動子的控制下。本發(fā)明還包括將該表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至胎牛體細胞，如成纖維細胞中，并通過核移植將牛卵母細胞去核來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎。本發(fā)明產(chǎn)生了能夠在其乳腺中產(chǎn)生修飾的人胰島素前體的轉(zhuǎn)基因牛。此后，可以收集這些轉(zhuǎn)基因哺乳動物的奶，可以在體外將修飾的人胰島素前體轉(zhuǎn)化成重組的人胰島素，并將重組的人胰島素純化至作為純生物藥品的同質(zhì)性。
文檔編號C12P21/02GK101755054SQ200880022856
公開日2010年6月23日 申請日期2008年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者A·普里恩科, A·比爾卡維馳, C·梅洛, M·克瑞斯庫洛, N·筑德維克茲, N·費爾南德茲 申請人:斯特林貝爾德生物技術北美公司