專利名稱：一種用轉(zhuǎn)基因植物表達醫(yī)用蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
基因工程領(lǐng)域背景技術(shù)1，植物生物反應(yīng)器是國際生物工程藥物研究的前沿領(lǐng)域。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以農(nóng)作物為表達系統(tǒng)生產(chǎn)試劑和藥物、單克隆抗體、酶制劑和結(jié)構(gòu)蛋白、抗原(疫苗)等，安全廉價，與微生物和轉(zhuǎn)基因動物相比，具有明顯的優(yōu)越性。80年代提出利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)人類所需要的各種藥物原料的分子農(nóng)業(yè)(molecular farming)的概念，目前部分產(chǎn)品已經(jīng)上市并贏利。1995年《Science》發(fā)表利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗的設(shè)想。植物生物反應(yīng)器打破了傳統(tǒng)的醫(yī)藥生產(chǎn)模式，開創(chuàng)了生物醫(yī)藥工程學和植物基因工程交叉的新領(lǐng)域，具有良好的產(chǎn)業(yè)化前景。
2，幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是廣泛感染于人類消化道的微需氧菌，已確認是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因子，并被WHO列為與胃癌發(fā)生密切相關(guān)的病原菌，認為是人類第I類致癌原(Group I carcinogen)。由于常規(guī)藥物治療存在副作用大，耐藥菌株逐漸增多等缺點。因此，疫苗的使用將是預(yù)防Hp感染的最有效方法。幽門螺桿菌基因工程疫苗一直是國內(nèi)外研究的熱點，但迄今尚無產(chǎn)品問世。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用植物作為生物反應(yīng)器大量生產(chǎn)廉價、安全的口服Hp疫苗不僅具有較高的科研價值，而且具有巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。Hp存在多種保護性抗原，如尿素酶(urease)、細胞毒素相關(guān)蛋白A(cytotoxin assiociated protein，CagA)、空泡毒素A(vaculoting cytotoxinA，VacA)等，其中尿素酶主要活性部位存在于細菌表面，表達量高且高度保守，尿素酶B亞單位因具有無毒性和很強的免疫原性，而成為Hp疫苗有效成份的候選者?；魜y毒素B亞單位(CTB)是霍亂毒素(CT)的免疫原部分，霍亂毒素及其B亞單位是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強的、能刺激機體粘膜反應(yīng)的免疫原。據(jù)文獻報道，以CTB為免疫佐劑配合Hp相關(guān)抗原口服免疫蒙古沙鼠，能使其產(chǎn)生針對Hp感染的保護性免疫。
3，我國是慢性胃疾病的高發(fā)國家，胃癌位居我國惡性腫瘤死亡的前列，因此，預(yù)防和根治Hp感染對大幅度降低慢性胃病及胃癌的發(fā)生，保護人民身體健康具有極其重要的意義。病理學研究表明，細胞毒素相關(guān)蛋白A(Cag A)是Hp菌株具有高毒力的標志。Cag A蛋白具有免疫保護作用，是Hp重要的保護性蛋白抗原。但是目前還無法人工培養(yǎng)Hp和制備防治Hp的免疫藥物。本發(fā)明采用植物生物反應(yīng)器的原理，以農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒為載體，將外源基因Hp cagA或ureB基因和粘膜免疫佐劑CTB融合基因轉(zhuǎn)入水稻基因組中，使轉(zhuǎn)基因植物大量、穩(wěn)定表達Hp的CagA或ureB蛋白抗原，在蒙古沙鼠模型中驗證其防治Hp感染的作用。

發(fā)明內(nèi)容
以防治Hp感染為例，將與Hp免疫原性相關(guān)基因?qū)胨?，并利用特異表達啟動子使基因在水稻籽粒中表達，通過選育和蒙古沙鼠免疫試驗，獲得具有能夠表達免疫活性醫(yī)用蛋白的水稻品系。
●構(gòu)建不含抗生素選擇標記的高效、特異和安全的表達載體。
●攻克植物生物反應(yīng)器的關(guān)鍵技術(shù)，建立了功能性作物的技術(shù)平臺。
●研究目的基因表達產(chǎn)物(免疫蛋白含量)隨世代和環(huán)境變化的規(guī)律。
●選育具有較高免疫活性的株系進行生產(chǎn)技術(shù)的公關(guān)。
具體實施例方式
實施例1以通過農(nóng)桿菌介導法將CagA和CTB融合基因?qū)胨緸槔１緦嵤├慌懦渌脑囼灧椒ê痛胧?，包括試驗材料等?br> 一、表達載體的構(gòu)建1.根據(jù)genebank中公布的CagA以及CTB基因的序列分別設(shè)計引物CagA-F 5-’CGCGAGGATCCATGACTAACGAAACTATTGA-3’(BamHI)；CagA-R 5-′GCGACGGtaCCTTAAGATTTTTGGAAACCAC-3′(KpnI)；CTB-F 5-’CGGCGGGTACCATGATTAAATTAAAATTTGG-3’(KpnI)；CTB-F 5-’CGGCGGGTACCATGATTAAATTAAAATTTGG-3’(KpnI)；CTB-R 5-’GGATACTCGAGGGATCCTTAATTTGCCATACTAATTG-3’(XhoI，BamHI)。
CTB-R 5-’GGATACTCGAGGGATCCTTAATTTGCCATACTAATTG-3’(XhoI，BamHI)。
從H.pylori DS115DNA中擴增CagA和CTB基因的全序列。為下一步克隆方便，在各引物的5’端設(shè)計酶切位點。
2.BamH+KpnI雙酶切CagA基因純化片段和中間載體pbluescriptII KS(+)，回收約3.4kb的CagA基因片斷及約3kb的中間載體pbluescriptII KS(+)片斷，定量按3∶1的比例將兩個片斷混和進行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取重組菌株，提取質(zhì)粒酶切鑒定。得到重組中間質(zhì)粒KS-CagA。
3.KpnI+XhoI雙酶切CTB基因純化片斷和質(zhì)粒KS-CagA，回收約400bp的CTB基因片斷及約6.4kb的KS-CagA質(zhì)粒片斷，定量按3∶1的比例將兩個片斷混和進行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取重組菌株，提取質(zhì)粒酶切鑒定。得到含有CagA-CTB串連基因的重組中間質(zhì)粒KS-CagA-CTB。
4.BamHI單酶切中間載體KS-CagA-CTB和經(jīng)改造的pCAMBIA1301雙元載體，回收約3.8kb的CagA-CTB串連基因片斷和約12kb的pCAMBIA1301雙元載體片斷，將pCAMBIA1301雙元載體片斷進行去磷酸化，定量按3∶1的比例將兩個片斷混和進行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌。挑取重組菌株，提取質(zhì)粒酶切鑒定。最終得到可用于農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化植物的雙元表達載體p1301-CagA-CTB。
二、農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備取-70℃保存的農(nóng)桿菌EHA105于含50μg/ml利福平、卡那霉素平板上劃線，28℃培養(yǎng)。挑取單菌落接種于5ml YM液體培養(yǎng)基中，220rpm 28℃振蕩培養(yǎng)12-16hr。取2ml菌液轉(zhuǎn)接于100ml YM液體培養(yǎng)基中，28℃220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.5。轉(zhuǎn)入無菌離心管，5000rpm離心5min，去上清液。加入10ml預(yù)冷的0.1M的CaCl2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置20min。4℃5000rpm離心5min，去上清。加入4ml預(yù)冷的含15％甘油的0.1M的CaCl2溶液，輕輕懸浮。農(nóng)桿菌懸浮液分裝于無菌Eppendorf管中，每管200μl凍存于-70℃。
三、雙元載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105取1μg左右的質(zhì)粒DNA加入到200ml EHA105感受態(tài)細胞中，混勻后，冰浴30min，-70℃放置10min。再在37℃水浴5min或42℃水浴lmin，接著冰浴2min，加入800mlYM液體培養(yǎng)基28℃，175rpm搖培3hr后涂在含50μg/ml卡那霉素的YM平板上。28℃培養(yǎng)到形成單菌落。也可以將上述雙元載體質(zhì)粒DNA用電激法導入EHA105感受態(tài)細胞，28℃培養(yǎng)到形成單菌落。挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于含50μg/ml卡那霉素的YM液體培養(yǎng)基中，28℃，220rpm搖培16hr，直接用菌液進行PCR鑒定。
四、根癌農(nóng)桿菌介導的水稻轉(zhuǎn)化準備開花后12-15天左右的脆莖水稻未成熟種子，經(jīng)表面滅菌后擠出水稻幼胚置于固體誘導培養(yǎng)基(NB)上，暗培養(yǎng)誘導愈傷組織。約5-7天后剝下愈傷組織，轉(zhuǎn)入新鮮配制的繼代培養(yǎng)基(NB)上，在相同條件下繼代培養(yǎng)5天左右；或者準備水稻成熟胚，同樣條件下誘導愈傷組織，挑選繼代培養(yǎng)5-7天、色澤淡黃的愈傷組織在適量農(nóng)桿菌懸浮液(OD 0.3-0.5)中浸泡15-20min，轉(zhuǎn)入固體共培養(yǎng)基上，26℃黑暗培養(yǎng)2-3天。將共培養(yǎng)后的愈傷組織放在含有50mg/l潮霉素的選擇培養(yǎng)基上，26℃暗培養(yǎng)14天，轉(zhuǎn)到新鮮配制的選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選14天至長出抗性愈傷組織。從經(jīng)兩輪篩選后長出的抗性愈傷組織中，挑選乳黃色致密的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至含有50mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)至12-15hrs/日的光照條件下培養(yǎng)，經(jīng)過15-25天左右，長出綠點。30-40天后進一步分化出小苗。當抗性愈傷組織分化的苗或芽長至約2cm時，將小苗移到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周左右，在溫室內(nèi)移栽入土。
其中YM(液體)培養(yǎng)基KH2PO40.5g/l+甘露醇10g/l+谷氨酰胺2g/l+NaCl0.2g/l+MgSO40.2g/l+酵母浸膏0.3g/l，pH 7.0。
誘導培養(yǎng)基MS(秈稻)/N6(粳稻)大量+MS-Fe鹽+B5微量+B5有機+2，4-D 1.5-4.5mg/l+脯氨酸300-1000mg/l+谷氨酰胺300-1000mg/l+水解酪蛋白500-1000mg/l+麥芽糖/蔗糖20-30g/l+Gelrite 2.5-3.0mg/l，pH5.8。
繼代培養(yǎng)基同誘導培養(yǎng)基，但是2，4-D改為2.0-3.0mg/l。
共培養(yǎng)(固體)培養(yǎng)基MS(秈稻)/N6(粳稻)大量+MS-Fe鹽+B5微量+B5有機+2，4-D 2.0-3.0mg/l+水解酪蛋白500-1000mg/l+肌醇500-2000mg/l+乙酰丁香酮100μM+麥芽糖/蔗糖20-30g/l+Gelrite 2.5-3.0mg/l，pH5.5。
(液體共培養(yǎng)培養(yǎng)基無Gelrite)。
選擇培養(yǎng)基MS(秈稻)/N6(粳稻)大量+MS-Fe鹽+B5微量+B5有機+2，4-D 2.0-3.0mg/l+脯氨酸300-500mg/l+谷氨酰胺300-1000mg/l+水解酪蛋白500-1000m/l+麥芽糖/蔗糖20-30g/l+頭孢霉素250mg/l+潮霉素50mg/l+Gelrite 2.5-3.0mg/l，pH 5.8。
分化培養(yǎng)基MS(秈稻)/N6(粳稻)大量+MS-Fe鹽+B5微量+B5有機+NAA 0.1-0.5mg/l+KT 4-8mg/l+脯氨酸300-500mg/l+谷氨酰胺300-1000mg/l+水解酪蛋白500-1000mg/l+麥芽糖/蔗糖20-30g/l+頭孢霉素250mg/l+潮霉素50mg/l+Gelrite 2.5-3.0mg/l，pH 5.8。
生根培養(yǎng)基1/2 MS/N6大量+MS-Fe鹽+B5微量+蔗糖10-20g/l+瓊脂0.8％，pH 5.8。
五、轉(zhuǎn)基因植株的檢測和選育在轉(zhuǎn)基因植株(T0)成活后，取樣進行PCR檢測，保留PCR陽性的植株，常規(guī)管理。PCR檢測是任何分子生物學實驗室都能進行的基本檢測技術(shù)。轉(zhuǎn)基因株系的提純和選育同時進行。
方案1、取轉(zhuǎn)基因陽性植株(T0)的穗子進行花藥培養(yǎng)，花藥培養(yǎng)的技術(shù)已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，一般實驗室和技術(shù)人員都可操作，具體方法見中國水稻科學，1993，7227-231；1996，1037-42或者Plant Breeding，1996，115295-300?；ㄋ幣囵B(yǎng)再生植株按單株采收種子。每株系取50-100粒種子按株系在含50mg/l的潮霉素水溶液中發(fā)芽，考查發(fā)芽率。選發(fā)芽率和對照相仿的株系的發(fā)芽種子播種。單本或者多本插，常規(guī)管理，以原始親本為對照。分子檢測和蒙古沙鼠免疫試驗。
方案2、轉(zhuǎn)基因陽性植株(T0)按單株采收種子。每株系取50-100粒種子(T1)在含50mg/l的潮霉素水溶液中發(fā)芽，考查發(fā)芽率，以原始親本為對照。選發(fā)芽率約為對照3/4的株系的發(fā)芽種子播種。單本或者多本插，常規(guī)管理。T2代試驗，對發(fā)芽率和對照無異的株系進行檢測和蒙古沙鼠免疫試驗。種子在含50mg/l的潮霉素水溶液中發(fā)芽，發(fā)芽率正常的株系進入新品種的選育程序。
六、Western Blot檢測方案1.將目的基因與原核表達載體pSBETSH相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1，分別用PCR和酶切的方法篩選陽性克隆。
2.將構(gòu)建好的原核表達載體轉(zhuǎn)入表達菌株BL21(DE3)pLysS，經(jīng)PCR驗證后用于誘導表達。挑取單個陽性菌落到5ml含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日以1∶100稀釋到5ml新鮮的含Kan的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)約2hrs，取1ml作為對照。再在剩余培養(yǎng)液中加IPTG至終濃度達到1mmol/l，誘導表達培養(yǎng)2hrs后取菌液1.5ml，離心收集菌體沉淀，用于SDS-PAGE檢測。
3.將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)plysS，IPTG誘導，進行表達檢測。經(jīng)IPTG誘導后的菌株會出現(xiàn)一條非常明顯的蛋白條帶，與預(yù)期融合蛋白的分子量大小一致，而在空載菌誘導中沒有此蛋白條帶出現(xiàn)。不誘導的重組質(zhì)粒菌中雖有此蛋白帶出現(xiàn)，但條帶比經(jīng)過誘導的重組質(zhì)粒菌條帶要淡。誘導的表達菌株經(jīng)超聲波裂解后的上清中有很濃的表達帶，沉淀中雖有相應(yīng)的條帶，但比上清要弱得多，表明所表達的融合蛋白大部分是可溶的。
4.采用SDS-PAGE，層析等方法對目的蛋白進行純化。取一份蛋白放入研缽，加一定量的生理鹽水充分研磨，用注射器注射小鼠，每只小鼠每次注射0.5ml。每隔7天免疫一次，第三次免疫后3天斷頭取血。血液4℃放置8hrs，14000rpm離心5min，收集上層血清。采用吸附的方法去除非目的蛋白的抗體。
5.提取轉(zhuǎn)基因植物的蛋白質(zhì)，SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，再分別用原核表達的蛋白質(zhì)和標準蛋白作為對照。SDS-PAGE分離后的凝膠(不染色)置于轉(zhuǎn)移緩沖液中(含20％甲醇和0.037％SDS的Tris-Gly緩沖液)浸泡30min，然后將已浸泡過的凝膠，硝酸纖維濾膜，濾紙及海綿依次疊放在支架上。轉(zhuǎn)移2---5hrs，轉(zhuǎn)移完成后，用蒸餾水沖洗硝酸纖維素膜。把硝酸纖維素膜放入培養(yǎng)皿中，加入封閉液，在搖床上平臺上于室溫封閉1hr，棄去封閉液，按0.1ml/cm2的量加入用封閉液稀釋的第一抗體(鼠抗血清)。在室溫下反應(yīng)2hrs。放射自顯影曝光3min至10min。顯影后清水漂洗，再定影。
實施例2以通過基因槍轟擊法將UreB+CTB融合基因和CagA+CTB融合基因同時導入水稻中花11為例。本實施例不排除其它的試驗方法和措施，包括試驗材料等。
一、表達載體的構(gòu)建本試驗采用分別構(gòu)建UreB+CTB融合基因表達載體和CagA+CTB融合基因表達載體(一)UreB+CTB融合基因表達載體的構(gòu)建1.合成有關(guān)引物，序列為CTB 5’primer 5’-GGCGGGTACCATGATTAAATTAAAATTTGG-3’CTB 3’primer 5’-ACCGCCGGATCCACCGCCACCATTTGCCATACTAATTGCGG-3’ureB 5’primer5’-GGTGGATCTGGTGGCGGCGGATCTAAAAAGATTAGCAGAAAAG-3’ureB 3’primer5’-TGCACTGCAGCTAGAAAATGCTAAAGAGTTG-3’Linker5’-AGATCCGCCGCCACCAGATCCACCACCGCCGGATCCACCGCCACC-3，
Wx pro 5’primer5’-CCCGAGCTCCACGTCAGATCGAGACCAAG-3’Wx pro 3’primer5’-GTAATTGTTGTAAAAATAGGTTGTCTAGCTGTTGCTGT-3’ΩK 5’primer5’-TATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTAC-3’ΩK 3’primer5’-CCCGGTACCCGCCATGGTTTATTGTAAATAGTAATTGTAATGTTGTTTGTTG-3’NOS ter 5’primer5’-CGCCTGCAGCGTTCAAACATTTGGCAAT-3’NOS ter 3’primer5’-CGCAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGAT-3’2.PCR法構(gòu)建CTB-ureB融合基因從H.pylori DS115中抽提H.pylori DNA，吸取少量抽提產(chǎn)物和少量含CTB基因的質(zhì)粒pGEM-CTB，反應(yīng)體系中加入CTB 5’primer、Linker和ureB 3’primer三條引物，擴增獲得CTB-ureB融合基因。
3.PCR法改造Wx pro序列，構(gòu)建Wx pro-ΩK融合序列ΩK5’和3’引物直接退火延伸獲得產(chǎn)物ΩK。以質(zhì)粒p13W4為模板，Wxpro5’primer和Wxpro 3’primer為引物，進行PCR反應(yīng)，獲得Wxpro-ΩK融合序列。
4.PCR法合成NOS終止子序列在50μl體系中，加入p13W4和其它各組分，進行PCR反應(yīng)，5.CTB-ureB融合基因的克隆純化后的CTB-ureB PCR產(chǎn)物用Pst I和Kpn I雙酶切，然后與用同樣酶切的pUCl9連接，獲得CTB-ureB融合基因重組子pUCU。
6.CTB-ureB融合基因植物表達載體的構(gòu)建用Hind III和Pst I雙酶切p13W4中擴增得到的NOS終止子序列，與用相同酶切的pCAMBIA1300連接，得到質(zhì)粒pCN。從質(zhì)粒pUCU上用Pst I和Kpn I切下CTB-ureB片段，然后與用相同酶切的pCN連接，獲得質(zhì)粒pCUN。再用Sac I和Kpn I雙酶切pCUN和Wx pro-ΩK，最后進行連接，得到質(zhì)粒pWCUN，完成CTB-ureB融合基因植物表達載體的構(gòu)建。
(二)UreB+CTB融合基因表達載體的構(gòu)建同實施例1。
二、表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌和質(zhì)粒的提取1.感受態(tài)細胞的制備電擊轉(zhuǎn)化用感受態(tài)細胞的制備從LB培養(yǎng)基(Tryptone 10g/l，Yeast extract5g/l，NaCl 5g/l，瓊脂20g/l，pH 7.0)平板上挑取新活化的大腸桿菌單菌落，接種于裝有50ml LB液體培養(yǎng)基的250ml的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16hr，直至對數(shù)生長后期。從該菌懸液中取出2.0ml，轉(zhuǎn)入裝有200ml LB液體培養(yǎng)基的500ml的細菌培養(yǎng)瓶中(按1∶100的體積比例加入)，37℃再振蕩培養(yǎng)大約3hr至OD600達到0.5左右。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管(250ml平底離心管)，冰上放置10min，然后4℃，4,000g離心15min(水平轉(zhuǎn)頭最好)，盡量去凈上清液。加入200ml(同原菌液等體積)滅菌預(yù)冷的10％的甘油，輕輕顛倒混勻后，4℃，4,000g離心15min。倒掉上清，將沉淀用100ml(原菌液體積的1/2)滅菌預(yù)冷的10％的甘油洗一遍。4℃，4,000g離心15min，將沉淀用50ml(原菌液體積的1/4)滅菌預(yù)冷的10％的甘油再洗一遍，倒掉上清，加入10ml左右預(yù)冷的10％甘油，混勻后迅速分裝到EP管中，每管40μl，迅速放入液氮中速凍，最后放于-80℃?zhèn)溆谩?br> 也可以制備用于熱擊轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞菌的活化和菌液培養(yǎng)同前，200ml培養(yǎng)好的菌液冰上放置10min，然后于4℃，4,000g離心5min，加入40ml冰冷的CaCl2溶液(0.1M CaCl2，0.01M Tris，pH 7.0，10mM DTT)輕輕懸浮沉淀，混勻后冰浴20min。4℃，4,000g離心5min，加入4ml冰冷的0.1M CaCl2溶液輕輕懸浮沉淀，混勻后冰浴2-5hr。加滅菌甘油至總體積的15％(v/v)，混勻后冰浴12-18hr。第二天取出混勻后迅速分裝到EP管中，每管100μl，放入液氮中速凍，最后放于-80℃?zhèn)溆谩?br> 2.轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物用于電擊轉(zhuǎn)化前要經(jīng)過乙醇沉淀，70％乙醇清洗，真空干燥后溶于4μl無菌ddH2O。電擊轉(zhuǎn)化具體步驟如下打開電擊轉(zhuǎn)化儀，將參數(shù)設(shè)置為電壓2.5KV，電容25μF，電阻200Ω。從-80℃冰箱中取出感受態(tài)細胞，放置冰上，待其融化后，加入2μl連接產(chǎn)物，快速輕輕吸吐混勻，冰浴1min。將上混合物轉(zhuǎn)入-20℃預(yù)冷的電擊轉(zhuǎn)化杯中(加后輕甩，使菌液鋪滿杯底)，用吸水紙將杯壁外的水擦凈，電擊。取出轉(zhuǎn)化杯，立即加入1ml SOC培養(yǎng)基(LB+10mM MgCl2+10mM MgSO4+20mM過濾除菌的葡萄糖)并混勻，將上述混合物轉(zhuǎn)入一滅菌的離心管中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)1hr，取200μl涂板。
連接產(chǎn)物可直接用于熱擊轉(zhuǎn)化，從-80℃取出感受態(tài)細胞，放置冰上，待其融化后，將連接產(chǎn)物全部加入其中，快速輕輕吸吐混勻，冰浴30min。于42℃水浴中放置1min，取出冰浴2min左右。加入500μl SOC培養(yǎng)基，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)1hr。取200μl涂板。
3.重組克隆的篩選與鑒定用無菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化后生長的單菌落接種于含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)16hr，用于質(zhì)粒提取。然后通過酶切質(zhì)粒、電泳檢測，對重組轉(zhuǎn)化子進行鑒定。
4.質(zhì)粒的提取將過夜培養(yǎng)的細菌轉(zhuǎn)入1.5ml EP管，13,000rpm離心30s收集菌體；倒掉大部分上清，留約50-100μl(包括沉淀的菌體)；加300μl TENS(含有0.1M NaOH和0.5％SDS的TE緩沖液)，渦旋混和直至混合物發(fā)粘；加入150μl 3M醋酸鈉(pH5.2)，混勻；13,000rpm離心10min，取上清，加入900μl無水乙醇，混勻；放置-20℃ 30min；13,000rpm離心5min，用70％的乙醇將沉淀洗兩遍，真空干燥后溶于適量的TE緩沖液。
三、基因槍轟擊導入外源基因取開花后12-15天左右的水稻未成熟種子，經(jīng)表面消毒后擠出水稻幼胚置于固體誘導培養(yǎng)基(NB)上，暗培養(yǎng)誘導愈傷組織。約5-7天后剝下愈傷組織，轉(zhuǎn)入新鮮配制的繼代培養(yǎng)基(NB)上，在相同條件下繼代培養(yǎng)5天左右。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到高滲培養(yǎng)基上，愈傷組織緊密地排在培養(yǎng)皿的中央，培養(yǎng)過夜。
稱取60mg直徑1μm的金粉于1.5ml的離心管內(nèi)，加1ml無水酒精，振蕩1min，10000rpm離心10sec，棄上清，重復一次，將金粉懸浮于1ml無菌水中，-20℃保存。吸取50μl金粉懸浮液，加20μl 0.1M亞精胺，50μl 2.5M CaCl2，2.5μg UreB+CTB融合基因表達載體DNA和2.5μg CagA+CTB融合基因表達載體DNA。振蕩3min，10000rpm離心20sec，棄上清，無水酒精漂洗2次，加60μl無水酒精定容。取20μl金粉懸液置于1100psi型的可裂膜上，晾干后用BiolisticTM PDS-1000基因槍，真空度28，壓力1100psi轟擊愈傷組織。每皿愈傷組織轟擊2次。
轟擊后的材料轉(zhuǎn)入新鮮配制的繼代培養(yǎng)基(NB)上黑暗恢復培養(yǎng)。2-7天后轉(zhuǎn)入含有50mg/l潮霉素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)抗性愈傷，26℃暗培養(yǎng)14天，轉(zhuǎn)到新鮮配制的選擇培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選14天至長出抗性愈傷組織。從經(jīng)兩輪篩選后長出的抗性愈傷組織中，挑選乳黃色致密的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至含有50mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基上，先暗培養(yǎng)3天，然后轉(zhuǎn)至12-15hrs/日的光照條件下培養(yǎng)，經(jīng)過15-25天左右，長出綠點。30-40天后進一步分化出小苗。當抗性愈傷組織分化的苗或芽長至約2cm時，將小苗移到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩周左右，在溫室內(nèi)移栽入土。
其中誘導培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)劑與例1的相同，高滲培養(yǎng)基為誘導培養(yǎng)基+2，4-D 1.5-4.5mg/l+0.5mol/l甘露醇，pH 5.8。
轉(zhuǎn)基因植株的檢測和選育可以與例1的相同，分子檢測后挑選同時檢出UreB和CagA的單株或者株系供品種選育。
實施例3以通過花粉管導入法將含UreB+CTB融合基因和CagA+CTB融合基因的雙價基因?qū)霝槔?。本實施例不排除其它的試驗方法和措施，包括試驗材料等?br> 一、雙價基因表達載體的構(gòu)建構(gòu)建方法如例1和例2，區(qū)別是將兩個融合基因構(gòu)建到同一個表達載體中。
二、表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌和質(zhì)粒的提取1.感受態(tài)細胞的制備與例2的相同。
2.轉(zhuǎn)化與例2的相同。
3.重組克隆的篩選與鑒定與例2的相同。
4.質(zhì)粒的提取與例2的相同。
三、花粉管導入外源基因本操作在水稻(中花11號)抽穗開花時進行，事先需要觀察中花11號在當?shù)氐氖蓟〞r間和揚花高峰時間。在清晨水稻始花前挑選當天將有大約20個小穗開花的穗子，剪去已經(jīng)開花的所有小穗。在水稻揚花的高峰期，剪去全部沒有開花的小穗。1hrs后，每個小穗剪去大約2/3的內(nèi)穎，柱頭和約1/3的花柱，保留外穎。用移液槍將10μl質(zhì)粒DNA滴在花柱的切口上，質(zhì)粒DNA的濃度為50-300μg/ml。1hrs后用同樣體積和濃度的質(zhì)粒DNA再滴一次，然后套袋并掛牌。25-30天后采收穗子脫粒，種子(T0)干燥后保存。由T0種子長出的水稻植株稱為T1代植株。
轉(zhuǎn)基因植株的檢測和選育可以與例1的相同。分子檢測后挑選同時檢出UreB和CagA的單株或者株系供品種選育。
本發(fā)明的預(yù)期效果1.應(yīng)用含有與Hp免疫原性相關(guān)基因的Ti載體已經(jīng)成功地轉(zhuǎn)化了水稻，，說明該Ti載體具有很好的實用性。
2.轉(zhuǎn)基因水稻可以穩(wěn)定表達與Hp免疫原性相關(guān)基因，蒙古沙鼠口服后可產(chǎn)生相關(guān)的抗體。
權(quán)利要求
1.一種用轉(zhuǎn)基因植物表達醫(yī)用蛋白的方法，其特征是以防治Hp感染為例，將與Hp免疫原性相關(guān)基因?qū)胨?，并利用特異表達啟動子使基因在水稻籽粒中表達，通過品種選育和蒙古沙鼠免疫試驗，獲得具有能夠表達免疫活性醫(yī)用蛋白的水稻。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的醫(yī)用蛋白可以是CagA(細胞毒素相關(guān)蛋白A)、ureB(尿素酶B亞單位)、CagA與免疫佐劑CTB(霍亂毒素B亞單位)的融合蛋白、ureB與CTB的融合蛋白。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是所述的導入采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、基因槍轟擊、原生質(zhì)體培養(yǎng)或花粉管導入的方法。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所導入的基因為單價基因、雙價基因或多價基因。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述的選育是對轉(zhuǎn)基因植物直接進行選育或以轉(zhuǎn)基因植物為親本進行的雜交轉(zhuǎn)育。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其基因表達的檢測方法為Westernblotting檢測。
7.如權(quán)利要求4或5或6所述的方法，其特征是所述的免疫活性試驗是采用蒙古沙鼠的免疫試驗。
全文摘要
技術(shù)領(lǐng)域基因工程領(lǐng)域本發(fā)明要解決如何在植物體特定組織中表達醫(yī)用蛋白，提高醫(yī)用蛋白表達量，并保證醫(yī)用蛋白免疫活性的問題。本發(fā)明以防治Hp感染為例，采用植物生物反應(yīng)器原理，將與Hp免疫原性相關(guān)Hp cagA或ureB和粘膜免疫佐劑CTB融合基因轉(zhuǎn)入水稻基因組中，并利用特異表達啟動子使在轉(zhuǎn)基因水稻籽粒中大量、穩(wěn)定表達，通過品種選育和蒙古沙鼠免疫試驗，獲得含有高免疫活性醫(yī)用蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻，作為防治Hp感染的疫苗來源。今后，人們尤其是高危人群，在醫(yī)生指導下，食用一定量的功能性大米或其制品，以達到根治和預(yù)防Hp感染、降低Hp相關(guān)性疾病的發(fā)病率、增強預(yù)防胃癌能力的目的。
文檔編號C12P21/02GK1800406SQ20051006046
公開日2006年7月12日 申請日期2005年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月24日
發(fā)明者胡國成, 付亞萍, 孫宗修, 劉文真, 斯華敏 申請人:胡國成, 付亞萍, 孫宗修, 劉文真, 斯華敏