專利名稱：：在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中生產(chǎn)外源蛋白的方法以及從其中純化蛋白的方法在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中生產(chǎn)外源蛋白的方法以及從其中純化蛋白的方法本分案申請(qǐng)是基于申請(qǐng)?zhí)枮?00480031507.8，申請(qǐng)日為2004年09月29日，發(fā)明名稱同上的中國(guó)專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
：在過(guò)去十年已經(jīng)由制藥工業(yè)通過(guò)提取或通過(guò)重組技術(shù)來(lái)普遍地生產(chǎn)涉及人保健的蛋白因子和激素。涉及所需基因的遺傳構(gòu)建體在細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中成功地得到了表達(dá)。然而，使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)獲得復(fù)雜的蛋白質(zhì)，如需要適當(dāng)糖基化模式的那些，涉及高成本的方法。在過(guò)去十年已經(jīng)日益增長(zhǎng)地使用重組DM技術(shù)來(lái)生產(chǎn)商業(yè)上重要的生物材料。為此，已經(jīng)克隆了編碼各種醫(yī)學(xué)上重要的人蛋白質(zhì)的DNA序列。這些包括胰島素、纖溶酶原激活劑、otl-抗胰蛋白酶和凝固因子VIII和IX。目前，即使使用新出現(xiàn)的重組DNA技術(shù)，通常也從血液和組織中純化這些蛋白質(zhì)，這是昂責(zé)而費(fèi)時(shí)的方法，可能帶有傳播感染物質(zhì)如導(dǎo)致ADIS和肝炎的那些的風(fēng)險(xiǎn)。盡管在細(xì)菌中表達(dá)DNA序列來(lái)生產(chǎn)所需的醫(yī)學(xué)上重要的蛋白質(zhì)看起來(lái)是有吸引力的提議，實(shí)際上通常證明細(xì)菌作為宿主不能令人滿意，因?yàn)橥庠吹鞍自诩?xì)菌細(xì)胞中不穩(wěn)定并且沒(méi)有得到正確地加工。認(rèn)識(shí)到這個(gè)問(wèn)題，已經(jīng)嘗試了在哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)物中表達(dá)所克隆的基因并已經(jīng)在一些情況下證明了是可行的策略。然而，動(dòng)物細(xì)胞的批量發(fā)酵是昂貴的且需要技術(shù)的過(guò)程。因此存在對(duì)用于生產(chǎn)生物物質(zhì)如正確修飾的真核多肽的高產(chǎn)量，低成本方法的需要。在該方法中不存在對(duì)人感染性的物質(zhì)將是一個(gè)優(yōu)勢(shì)。為了在奶中獲得大量的人蛋白質(zhì)，獲得所需基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物如牛的可能性已經(jīng)引起了工業(yè)的極大興趣。文獻(xiàn)中的幾個(gè)小組報(bào)道了生產(chǎn)人血清清蛋白、cc抗胰蛋白酶的成功以及在轉(zhuǎn)基因牛或山羊中的一些其它實(shí)例。之前已經(jīng)在小鼠或大鼠中進(jìn)行了許多實(shí)驗(yàn)，通常優(yōu)選將轉(zhuǎn)基因表達(dá)限制于乳腺中，因?yàn)槭褂肞酪蛋白或乳清蛋白啟動(dòng)子，其只響應(yīng)哺乳期雌性中的乳腺轉(zhuǎn)錄因子。異源蛋白專門(mén)在奶中的表達(dá)意欲避免對(duì)宿主動(dòng)物健康的不利影響并提供容易的純化方法。目前人們致力于建立幾個(gè)系統(tǒng)來(lái)提高細(xì)胞轉(zhuǎn)染或選擇的產(chǎn)量，并選擇同源胎兒體細(xì)胞的來(lái)源來(lái)提高克隆動(dòng)物的存活和免疫狀況。另一方面，出于農(nóng)業(yè)和生物藥物的目的，存在對(duì)體細(xì)胞核移植的巨大興趣，主要是使原種家畜的繁殖和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的工程化變成可能。簡(jiǎn)要地，核移植(NT)包括受體卵母細(xì)胞的去核，接著將供體細(xì)胞移植至受體胞質(zhì)體緊密并置的卵周隙中，并使它們?nèi)诤?。通過(guò)化學(xué)或物理激活來(lái)人工誘導(dǎo)發(fā)育。通過(guò)體細(xì)胞核移植來(lái)產(chǎn)生克隆的后代已經(jīng)在綿羊(Campbell,K.H.等，iV""re380:64-66(1996),1996;Wells,D.N.等，"/o"e拜"7:385-393(1997);Wilmut，I.等，斑810-813(1997));山羊(Baguisi，A.等，射S/"ec/wo/":456-461(1999))和牛(Cibelli，J.B.等，Sc/e扁觀1256-1258(19981);Kato，Y.等，斑2095-2098(1998);Wells，D.N.等，ye/rod尸e""/erJft369-378(1998))中獲得了成功。存在幾個(gè)影響NT結(jié)果的因素，包括去核、融合、激活和供體-受體細(xì)胞周期同步性的方法。已經(jīng)獲得了受體卵母細(xì)胞去核的高效率，使用DNA特異性活體染料來(lái)顯現(xiàn)染色質(zhì)(Stice，S.L.和Keefer,C.L.，A'o7Wepro(/715-719(1993);Westhusin,M.E.等，/We;rof/Fe"http://夕J:475-480(1992))。供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞的融合取決于脈沖場(chǎng)中細(xì)胞對(duì)準(zhǔn)的準(zhǔn)確度、供體細(xì)胞和受體卵母細(xì)胞的接觸和供體細(xì)胞的大小(Collas，P.等，^23/萬(wàn)/oc力e邁2M:1-9(1993))。NT重建胚胎的激活已經(jīng)得到精心的改進(jìn)并且發(fā)育成胚泡的速度等于體外授精的卵母細(xì)胞(Liu，L等，#。//e/rocT齡伙298-307(1998))。已經(jīng)實(shí)現(xiàn)NT胚胎的成功發(fā)育，使用成熟的卵母細(xì)胞(Willadsen,S.M.,iV""re觀63-65(1986))、合子(McGrath，J.和Solter,D.，ZerWo/#/《37-55(1985))和卵裂期的胚胎(Tsunoda,Y.等，/je/rocT尸e"http://夕f:275-281(1992))作為受體胞質(zhì)體；然而，這取決于供體核的來(lái)源。受體胞質(zhì)體和供體細(xì)胞之間的細(xì)胞周期的相容性是影響NT胚胎發(fā)育的一個(gè)重要因素。需要適當(dāng)?shù)耐交瘉?lái)保持重建胚胎的倍性。有絲分裂的細(xì)胞周期具有以下連續(xù)的期復(fù)制前間期(G1)、DNA合成(S)、有絲分裂前間期(G2)和有絲分裂(M)。在單個(gè)細(xì)胞周期過(guò)程中，在有絲分裂前所有基因組DNA復(fù)制一次。移植至去核成熟卵母細(xì)胞(中期II)中的間期供體核經(jīng)歷幾次形態(tài)改變。融合后，但在供體核包膜分解(NEBD)之前，染色體濃縮(PCC)。這些改變通過(guò)BJ頃工fMDT7、A古"A劃(MAPK)的活性來(lái)誘導(dǎo)(Collas，P.和Robl，J.M.,AeprocTO:455-465(1991))。在所有減數(shù)分裂和有絲分裂的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了MPF和MAPK活性且在中期最高，這些高含量在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞中還誘導(dǎo)了停止于中期II。通過(guò)授精或用鈣離子載體激活來(lái)減少M(fèi)PF和MAPK是完成減數(shù)分裂、第二極體發(fā)射、精核解凝和前核形成的信號(hào)。周期。二倍體G。/d核濃縮成單染色單體，但是四倍體G2核濃縮成雙染色單體。然而，S期的核在移植時(shí)顯示出特征性的"粉碎"外觀；PCC產(chǎn)生大范圍的DNA破壞。因此，可以在激活時(shí)或激活之前將G!或G。的核移植至中期II的卵母細(xì)胞中來(lái)產(chǎn)生正確的倍性。第二種方法是將核移植至之前激活的S期的卵母細(xì)胞中，這種情況中，可以使用G,、G?；騍期的供體細(xì)胞。因?yàn)镸PF和MAPK是低的；染色質(zhì)解凝，并經(jīng)歷DNA復(fù)制沒(méi)有PCC和NEBD。已經(jīng)在小鼠中報(bào)道了第三種同步化方案，其中通過(guò)胚胎重建來(lái)產(chǎn)生活的后代的發(fā)育，使用G2或中期供體細(xì)胞和去核的中期2卵母細(xì)胞(Cheong，H.T.等，Wo/腳rod化'958-963(1993);Kwon，0.Y.和Kono，T.,戶roc#a〃JcadSc/〃WW:13010-13013(1996))。報(bào)道了從NT重建胚胎中極體的擠出，導(dǎo)致單個(gè)二倍體胚胎和二倍體極體(Kwon,0.Y.和Kono，T.，/Yoc;V"/Jcat/iW夕義13010-13013(1996))。然而，沒(méi)有報(bào)道在牛、綿羊或豬中NT進(jìn)入去核MII卵母細(xì)胞后極體的形成，提示物種之間在完整紡錘體的力學(xué)控制形成和極體的擠出中的差異。已經(jīng)提出供體細(xì)胞和受體細(xì)胞周期的階段對(duì)于為供體細(xì)胞核重編程度也是重要的。增加供體核移植和合子轉(zhuǎn)錄之間的時(shí)間可以促進(jìn)核重編程序。為此，幾位作者在融合后幾小時(shí)激活了卵母細(xì)胞(Cibelli，J.B.等,5We鮮廁1256-1258(1998));Wakayama，T.等，W""re規(guī)369-374(1998);Wells,D.N.等，5/o//e/iY^fft996-1005(1999))。其它報(bào)道應(yīng)用了順序核移植(SUce，S.L.和Keefer，C.L.,Ae/7ro￡f化715-719(1993))。增加供體核重編程序時(shí)間的未考察過(guò)的方法是在間期II之前通過(guò)核移植。在生發(fā)泡破裂(GVBD)后，通過(guò)卵母細(xì)胞胞質(zhì)MPF和MAPK的實(shí)質(zhì)性增加來(lái)調(diào)控所有的核事件，其防止了核被膜的重建和進(jìn)入S期直至授精或激活。因此，成熟^母細(xì)胞可以是用于間期或G2供體細(xì)胞的通用受體。如果激活在細(xì)胞分裂之前誘導(dǎo)了S期，甚至Gt或G。也可以用作供體細(xì)胞。當(dāng)G2或M的卵裂球用作供體細(xì)胞時(shí)，核重編程序是可能的(Cheong，H.T.等,5/o/ieprod":958-963(1993);Kwon，0.Y.和Kono，T.,Jcad5W夕J:13010-13013(1996);Liu,L.等，及e/rod47:255-264(1997))。一種解釋是作為染色體濃縮的結(jié)果置換了染色質(zhì)中的一些因子。實(shí)際上，對(duì)于核移植，已經(jīng)認(rèn)為NEBD和PCC是核重編程序的形態(tài)學(xué)征兆。此外，授精時(shí)精子染色質(zhì)極端濃縮，它的體積比體細(xì)胞核的體積小得多，且卵母細(xì)胞具有除去精核蛋白的能力。在精子-卵母細(xì)胞融合的過(guò)程中，卵母細(xì)胞染色體也被濃縮。可能是濃縮的染色質(zhì)構(gòu)象具有一些生物關(guān)聯(lián)。因而，通過(guò)中期核移植模擬這種情況，中期去核的受體可以提高NT結(jié)果。然而，少數(shù)研究者已經(jīng)在家畜中使用該方法并使用卵裂球作為供體細(xì)胞(Liu，L.，等，M7Weprod47:255-264(1997))。本發(fā)明的一個(gè)目的是表征現(xiàn)有的體細(xì)胞核移植并將其精心改進(jìn)成用于從成體供體細(xì)胞生產(chǎn)遺傳上相同的牛的可靠而經(jīng)濟(jì)的技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于在其奶中以意想不到的高水平產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素。重組生長(zhǎng)激素可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的動(dòng)物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及提供目標(biāo)蛋白在哺乳動(dòng)物乳房細(xì)胞中表達(dá)的質(zhì)粒，其中表達(dá)受到P酪蛋白啟動(dòng)子的調(diào)控。目標(biāo)蛋白可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。本發(fā)明還涉及制造在其奶中產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的不同方法。重組生長(zhǎng)激素可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的動(dòng)物。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，包括制造在其奶中產(chǎn)生所述蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，從所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物獲得所述奶并從奶中純化所述蛋白質(zhì)。目標(biāo)蛋白可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的動(dòng)物。本發(fā)明還涉及從轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物奶中生產(chǎn)和純化重組生長(zhǎng)激素的方法。重組生長(zhǎng)激素可以是，但不限于，人成長(zhǎng)激素。非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的動(dòng)物。圖1A-1B顯示了從轉(zhuǎn)基因奶牛收集的每日奶體積，該轉(zhuǎn)基因奶牛是通過(guò)融合去核的卵母細(xì)胞和之前用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞而獲得的，該質(zhì)粒含有編碼人生長(zhǎng)激素(hGH)的基因和指導(dǎo)其表達(dá)至乳房細(xì)胞的啟動(dòng)子。圖2A-2C顯示了從相同轉(zhuǎn)基因奶牛收集的奶中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌計(jì)數(shù)。圖3A-3B顯示了在相同轉(zhuǎn)基因奶牛的奶中含有的hGH的生物活性。圖4A顯示了在相同轉(zhuǎn)基因奶牛的奶中產(chǎn)生的hGH的每日質(zhì)量。該量值和從轉(zhuǎn)基因奶牛收集的每日奶體積一起作圖表示圖4B中。圖5A顯示了在相同轉(zhuǎn)基因奶牛的血清中的hGH和胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)的濃度，和在相同轉(zhuǎn)基因奶牛的奶中產(chǎn)生的hGH的每曰質(zhì)量。將轉(zhuǎn)基因奶牛的血清中的hGH濃度和轉(zhuǎn)基因奶牛的奶中產(chǎn)生的hGH的每日質(zhì)量一起作圖表示于圖5B中。在圖5C中，將轉(zhuǎn)基因奶牛的hGH和IGF-1血清濃度的時(shí)間特征一起作圖。圖6A和6B顯示了在通過(guò)在其奶中產(chǎn)生hGH的轉(zhuǎn)基因奶牛的亞克隆而獲得的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因小牛中hGH和胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)的血清濃度。在圖6C和6D中，對(duì)這些轉(zhuǎn)基因小牛中每個(gè)的hGH和IGF-1血清濃度的時(shí)間特征一起作圖。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其特征在于在其奶中以意想不到的高水平產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素。該哺乳動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的其它物種可以是，但不限于，豬物種、綿羊物種、山羊物種或嚙齒動(dòng)物物種。重組生長(zhǎng)激素可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。該分子，也稱為促生長(zhǎng)素，是由191個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)，具有約22kD的分子量。它對(duì)于線性生長(zhǎng)是必要的且其應(yīng)用得到了很好地建立。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其特征在于為了產(chǎn)生更多的含有所述激素的奶在其奶中產(chǎn)生的重組生長(zhǎng)激素自我刺激了動(dòng)物乳腺的事實(shí)。本發(fā)明還涉及質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含可操作地連接于P酪蛋白啟動(dòng)子和P內(nèi)酰胺酶基因的編碼目標(biāo)蛋白的基因。該目標(biāo)蛋白可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。該質(zhì)粒可以是pRPhGH。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，質(zhì)粒另外包括新霉素抗性基因用于遺傳霉素抗性細(xì)胞的選擇。這樣質(zhì)粒的實(shí)例是pRNeo。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，質(zhì)粒包括編碼綠色熒光蛋白如GFP的基因，其在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子的控制下。這樣質(zhì)粒的實(shí)例是pRNeoGreen。本發(fā)明進(jìn)一步涉及質(zhì)粒如上迷的那些，其已經(jīng)通過(guò)限制酶消化而線性化。尤其是，使用限制酶ApaLI并切除p內(nèi)酰胺酶基因。根據(jù)布達(dá)佩斯條約正在進(jìn)行上述質(zhì)粒的保藏程序。保藏單位的名稱和地址是DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH(德國(guó)微生物保藏中心)，MascheroderWeglb,38124Braunschweig,德國(guó)。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候?qū)⑻峁┫鄳?yīng)的保藏號(hào)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及基于含有Neo抗性基因的質(zhì)粒而構(gòu)建的質(zhì)粒，其中在hGH編碼區(qū)上游插入了修飾的較短的P酪蛋白啟動(dòng)子區(qū)，如pVEpcashGH。通過(guò)切除P內(nèi)酰胺酶基因可以從質(zhì)粒pVEPcashGH獲得線性片段。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的方法，使用用于脂質(zhì)體應(yīng)用的陽(yáng)離子脂質(zhì)的組合。還描述了在合適培養(yǎng)基中選擇新霉素抗性細(xì)胞的方法，如選擇綠色熒光轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的方法。小心地挑選這些細(xì)胞，使得避免細(xì)胞損傷。本發(fā)明還涉及將停止于G。或細(xì)胞周期不同時(shí)間的細(xì)胞核移植至去核牛卵母細(xì)胞中的方法。本發(fā)明涉及將轉(zhuǎn)基因胚胎移植至激素刺激的奶牛子宮中的方法。根據(jù)本發(fā)明，公開(kāi)了測(cè)定動(dòng)物健康參數(shù)的方法。為了測(cè)定這些參數(shù)，對(duì)動(dòng)物的血清和奶兩者進(jìn)行了分析。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制造非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的方法，包括獲得編碼生長(zhǎng)激素的基因，將基因克隆進(jìn)質(zhì)粒中，借此將基因可操作地連接至指導(dǎo)基因在乳房細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，形成表達(dá)質(zhì)粒，用該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體細(xì)胞使得質(zhì)粒摻入到細(xì)胞的基因組中，形成轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞，將成熟卵母細(xì)胞去核，形成去核的卵母細(xì)胞，將一個(gè)轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合形成單細(xì)胞胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制造非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的方法，包括從雌性哺乳動(dòng)物中提取體細(xì)胞，任選地為成纖維細(xì)胞，該哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以在其奶中產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素，將成熟卵母細(xì)胞去核，形成去核的卵母細(xì)胞，將一個(gè)轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合形成單細(xì)胞胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制造非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的方法，包括使雌性非人哺乳動(dòng)物超排卵，該哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以在其奶中產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素，將該哺乳動(dòng)物用從雄性非人非轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來(lái)產(chǎn)生胚胎，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制造非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的方法，包括使雌性非人哺乳動(dòng)物超排卵，該哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以在其奶中產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素，將該哺乳動(dòng)物用從雄性非人哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來(lái)產(chǎn)生胚胎，從中獲得精子的哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。本發(fā)明進(jìn)一步涉及制造非人轉(zhuǎn)基西哺乳動(dòng)物的方法，包括使雌性非人非轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物超排卵，將該哺乳動(dòng)物用從雄性非人哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來(lái)產(chǎn)生胚胎，從中獲得精子的哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。重組生長(zhǎng)激素可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的動(dòng)物。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括制造在其奶中以意想不到的高產(chǎn)量產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，從該非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物獲得奶，并從奶中純化目標(biāo)蛋白。本發(fā)明還涉及在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，該哺乳動(dòng)物是通過(guò)包括以下步驟的方法制得的獲得編碼所述目標(biāo)蛋白的基因，將基因克隆進(jìn)質(zhì)粒中，借此將基因可操作地連接至指導(dǎo)基因在乳房細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，形成表達(dá)質(zhì)粒，用表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體細(xì)胞，任選地為成纖維細(xì)胞，使得質(zhì)粒摻入到所述體細(xì)胞的基因組中，形成轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞，將成熟卵母細(xì)胞去核，形成去核的卵母細(xì)胞，將一個(gè)轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合形成單細(xì)胞胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。本發(fā)明還涉及在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，該哺乳動(dòng)物通過(guò)包括以下步驟的方法制得從雌性哺乳動(dòng)物提取體細(xì)胞，任選地為成纖維細(xì)胞，該哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以在其奶中產(chǎn)生，將成熟的卵母細(xì)胞去核，形成去核的卵母細(xì)胞，將一個(gè)轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合形成單細(xì)胞胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。本發(fā)明還涉及在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，該哺乳動(dòng)物通過(guò)包括以下步驟的方法制得使雌性非人哺乳動(dòng)物超排卵，該哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以在其奶中產(chǎn)生所述的目標(biāo)蛋白，將該哺乳動(dòng)收集胚胎，將胚胎植二受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。本發(fā)明還涉及在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，該哺乳動(dòng)物通過(guò)包括以下步驟的方法制得使雌性非人哺乳動(dòng)物超排卵，該哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以在其奶中產(chǎn)生所述的目標(biāo)蛋白，將該哺乳動(dòng)物用從雄性非人哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來(lái)產(chǎn)生胚胎，從中獲得精子的哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以產(chǎn)生所述的目標(biāo)蛋白，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。本發(fā)明還涉及在非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物中生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，該哺乳動(dòng)物通過(guò)包括以下步驟的方法制得使雌性非人非轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物超排卵，將該哺乳動(dòng)物用從雄性非人哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來(lái)產(chǎn)生胚胎，從中獲得精子的哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的以產(chǎn)生所述的目標(biāo)蛋白，收集胚胎，將胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中，并監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。其特征在于在其奶中以意想不到的高水平產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的其它物種可以是，但不限于，豬物種、綿羊物種、山羊物種或嚙齒動(dòng)物動(dòng)物。目標(biāo)蛋白可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。本發(fā)明進(jìn)一步涉及在其奶中產(chǎn)生重組人生長(zhǎng)激素的牛物種的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，它的基因組包含整合的質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒包含人生長(zhǎng)激素基因和指導(dǎo)所述基因在哺乳動(dòng)物的乳房細(xì)胞中表達(dá)的P酪蛋白啟動(dòng)子。本發(fā)明進(jìn)一步涉及以意想不到的高水平產(chǎn)生hGH的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，但沒(méi)有顯示以這樣高水平的hGH產(chǎn)生所期望的自然生長(zhǎng)。由于轉(zhuǎn)基因牛受到人生長(zhǎng)激素存在的影響，預(yù)期動(dòng)物生長(zhǎng)將超過(guò)非轉(zhuǎn)基因的生長(zhǎng)速率，并患病如糖尿病、高血壓、心血管疾病提高的風(fēng)險(xiǎn)和身體器官的擴(kuò)大，包括肝臟、脾臟、腎臟和心臟。理論上，這樣高含量的hGH應(yīng)使得動(dòng)物不能存活。然而，情況并非如此。哺乳動(dòng)物，如奶牛，在其血液中含有令人擔(dān)憂的高水平的外源激素，但是其完全健康并產(chǎn)生顯著的重組蛋白生產(chǎn)力，構(gòu)成意想不到的和創(chuàng)新的貢獻(xiàn)。本發(fā)明的重組人生長(zhǎng)激素以意想不到的高水平產(chǎn)生。所產(chǎn)生的人生長(zhǎng)激素的含量高于約1.Og/L奶。hGH的含量可以高于約2.Og/L奶。所產(chǎn)生的hGH的含量還可以高于約3.Og/L奶。另一實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的hGH的含量可以高于約4.Og/L奶。仍然另一實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的hGH含量可以高于約5.Og/L奶。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的hGH含量可以高于約6.Og/L奶。仍然進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的hGH含量為約1.Og/L奶至約7.Og/L奶。進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的hGH含量為約2.Og/L奶至約6.Og/L奶。仍然另一實(shí)施方案中，所產(chǎn)生的hGH含量為約2.Og/L奶至約5.Og/L奶。此外，本發(fā)明涉及從轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中純化重組生長(zhǎng)激素的方法，以及所述激素的測(cè)定法。純化方法可以包括色語(yǔ)和濃縮步驟?？梢允褂貌煌愋偷纳?，包括離子交換色語(yǔ)、反相色譜、分子排阻色譜或親和色譜。離子交換色譜可以是陰離子交換色譜。親和色譜可以是免疫親和色鐠。此外，可以進(jìn)行多個(gè)色譜步驟。本發(fā)明進(jìn)一步涉及從產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中純化重組生長(zhǎng)激素的方法，包括將非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶澄清，得到澄清的奶，并對(duì)澄清的奶進(jìn)行色譜，得到純化的重組生長(zhǎng)激素。本發(fā)明進(jìn)一步涉及從產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中純化重組生長(zhǎng)激素的方法，包括將非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶澄清，得到澄清的奶，并對(duì)澄清的奶進(jìn)行膨脹床陰離子交換色謙，得到陰離子交換色譜過(guò)的物料，對(duì)陰離子交換色譜過(guò)的物料進(jìn)行反相色譜，得到反相色譜過(guò)的物料，對(duì)反相色鐠過(guò)的物料進(jìn)行陰離子交換色譜，得到陰離子交換色鐠過(guò)的物料，對(duì)陰離子色鐠交換過(guò)的物料進(jìn)行分子排阻色譜，得到分子排阻色譜過(guò)的物料，將分子排阻色語(yǔ)過(guò)的物料濃縮，得到濃縮的物料，并對(duì)濃縮的物料進(jìn)行分子排阻色鐠，得到純的重組生長(zhǎng)激素。本發(fā)明還涉及從產(chǎn)生重組生長(zhǎng)激素的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶中純化重組生長(zhǎng)激素的方法，包括將非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的奶澄清，得到澄清的奶，并對(duì)澄清的奶進(jìn)行免疫親和色i普，得到免疫親和色鐠過(guò)的物料，對(duì)免疫親和色譜過(guò)的物料進(jìn)行反相色譜，得到反相色譜過(guò)的物料，對(duì)反相色譜過(guò)的原料進(jìn)行陰離子交換色譜，得到陰離子交換色謙過(guò)的物料，對(duì)陰離子交換色譜過(guò)的物料進(jìn)行分子排阻色譜，得到分子排阻色鐠過(guò)的物料，對(duì)分子排阻色鐠過(guò)的物料進(jìn)行濃縮，得到濃縮的物料，并對(duì)濃縮的物料進(jìn)行分子排阻色譜，得到純的重組生長(zhǎng)激素。上述純化方法的重組生長(zhǎng)激素可以是，但不限于，人生長(zhǎng)激素。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以是，但不限于，牛物種的哺乳動(dòng)物。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是本發(fā)明方法和組合物的說(shuō)明，而不是限制。在化學(xué)合適的本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的修改和改進(jìn)在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。實(shí)施例1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建我們生產(chǎn)了帶有大部分牛P酪蛋白基因啟動(dòng)子的構(gòu)建體，包括5，-非編碼P酪蛋白棊因區(qū)的短片段，與人生長(zhǎng)激素基因的編碼序列融合。不同構(gòu)建體中所用的P酪蛋白區(qū)從3.8kbp減小至約1.3kbp。根據(jù)是否包括內(nèi)在的polyA信號(hào)，hGH基因包括約2至2.2kbp。在pUC或pBS類型的通常的克隆栽體的多接頭中容納表達(dá)盒。該啟動(dòng)子確保基因的組織特異性和發(fā)育可調(diào)型表達(dá)在其控制下，如P酪蛋白，和這種情況中的異源hGH。最具代表性的質(zhì)粒是pRPhGH,其攜帶全長(zhǎng)牛P酪蛋白啟動(dòng)子，與人生長(zhǎng)激素基因的編碼序列融合。公開(kāi)的其它構(gòu)建體主要源自如所述的原始的構(gòu)建體，來(lái)提高轉(zhuǎn)染細(xì)胞的選擇或DM進(jìn)入牛細(xì)胞基因組的整合效率。第一階段中，用含有遺傳霉素抗性基因的質(zhì)粒進(jìn)行共轉(zhuǎn)染來(lái)幫助選擇，但是接著，使用其它構(gòu)建體，在含有hGH表達(dá)盒的相同載體中帶有用于新霉素抗性的NPT基因。這樣質(zhì)粒的實(shí)例是pRNeo。獲得用于組成型表達(dá)綠色熒光蛋白的另一種質(zhì)粒，其包括CMV啟動(dòng)子，植物來(lái)源(苜蓿)的增強(qiáng)子和來(lái)自水母丄W"oria的綠色熒光蛋白基因。這樣質(zhì)粒的實(shí)例是pRNeoGreen。此外，生產(chǎn)了另一種質(zhì)粒。這是基于含有Neo抗性基因的質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建的，其中在hGH編碼區(qū)上游插入了修飾的較短的p酪蛋白啟動(dòng)子區(qū)。該質(zhì)粒是pVEPcashGH。生產(chǎn)了其它構(gòu)建體，其中通過(guò)ApaLI限制酶切除了p內(nèi)酰胺酶區(qū)，并在瓊脂糖凝膠電泳和凝膠提取后純化含有完整表達(dá)盒的線性片段。通過(guò)限制酶和DNA測(cè)序來(lái)分析構(gòu)建體，并預(yù)先在乳腺細(xì)胞系中通過(guò)熒光抗體識(shí)別測(cè)試它們進(jìn)行hGH表達(dá)的能力。將作為涉及遺傳構(gòu)建體這部分的實(shí)例來(lái)詳細(xì)描述質(zhì)粒pVEPcashGH的制備。pVEPcashGH的制備該構(gòu)建體的目的是提供P酪蛋白啟動(dòng)子區(qū)的最小延伸以指導(dǎo)下游立即融合的hGH基因，與其在宿主生物中的polyA信號(hào)一起的特定可調(diào)型轉(zhuǎn)錄。使用pVEX作為原始載體允許使用通過(guò)已經(jīng)存在于該質(zhì)粒中的tk啟動(dòng)子調(diào)控的新霉素抗性基因。通過(guò)用Stul和Ndel限制來(lái)消除包括554bp的早期SV40啟動(dòng)子，最后的位點(diǎn)用Klenow填補(bǔ)，且自我連接所得到的載體。PCR擴(kuò)增來(lái)自3.8kbp原始基因啟動(dòng)子區(qū)的1.3kbp片段后獲得了P酪蛋白短的啟動(dòng)子，使用以下寡聚物作為引物PB15，TCTACTCGAGGATCATCTATCTGTCCCAAAG(SEQIDNO:1)和PB25，CTAGGATCCAATGATCTGATTTTGTGG(SEQIDNO:2)該片段包括1230bp的規(guī)范啟動(dòng)子加49bp的P酪蛋白基因的第一個(gè)非編碼外顯子。通過(guò)PCR技術(shù)獲得了hGH基因片段，基于原始的?；蚪MhGH克隆，使用以下的寡聚物作為引物PB45，CTAGGATCCATGGCTACAGGTAAGCGCC(SEQIDNO:3)和GHTE5，ATGCTGTGTCTGGACGTCCT(SEQIDNO:4)用Klenow酶將p酪蛋白啟動(dòng)子片段平截并插入pVEX的BamHI填補(bǔ)的位點(diǎn)。選擇重組克隆后，我們選擇適于使用位于pVEX下游的唯一HindIII位點(diǎn)的特定方向來(lái)插入hGH編碼區(qū)。為此，將hGH片段也平截了并填補(bǔ)了質(zhì)粒HindIII位點(diǎn)。選擇含有P酪蛋白啟動(dòng)子和恰當(dāng)融合的hGH的克隆使得只在該啟動(dòng)子的控制下表達(dá)hGH。該質(zhì)粒的大小約為8.5kbp。體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染然后將質(zhì)粒pRPhGH(與另一帶有遺傳霉素抗性基因的質(zhì)粒一起)、pRNeo、pRNeoGreen或pVEPcashGH用于轉(zhuǎn)染體細(xì)胞的初級(jí)培養(yǎng)物，使用磷酸鈣或脂質(zhì)體方法。通常使用胎牛成纖維細(xì)胞來(lái)待轉(zhuǎn)染。將遺傳霉素加入培養(yǎng)物中來(lái)選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。2至8周后，對(duì)遺傳霉素具有抗性的細(xì)胞適于用作供體細(xì)胞來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因克隆。通過(guò)PCR分析轉(zhuǎn)染的所選擇的細(xì)胞含有表達(dá)盒，以確保合適的核移植來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎。實(shí)施例2卵母細(xì)胞的去核和成熟去核卵母細(xì)胞中的中期核移植牛卵母細(xì)胞的收集和體外成熟從屠宰場(chǎng)卵巢中吸出牛的卵母細(xì)胞并在TCM-199+5%FCS中于39^成熟24小時(shí)。在使用前用C02平衡成熟培養(yǎng)基至少2小時(shí)。在含有l(wèi)mg/ml牛睪丸透明質(zhì)酸酶的溫?zé)酺L-HEPES中渦旋2分鐘使成熟的卵母細(xì)胞棵露。使用卵丘細(xì)胞進(jìn)行核移植去核寸吏用Narishige液壓顯樣i操作器和NikonDiaphot顯樣i鏡將卵母細(xì)胞機(jī)械去核。用20lam斜角的和削尖的吸管進(jìn)行去核。之前用g/ml的bisbenzimidine(Hoechst333421)染料將卵母細(xì)胞染色20分鐘。在紫外線下通過(guò)觀察被染色的染色體將中期去核。在吸管之內(nèi)抽吸后評(píng)估中期染色體。將轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞移植至卵周隙中并嚴(yán)格地與去核的卵母細(xì)胞相對(duì)。融合將轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞和去核的卵母細(xì)胞在融合室中人工對(duì)準(zhǔn)使得待融合的膜平行于電極。使用玻璃的胚胎操作吸管來(lái)進(jìn)行。通過(guò)電方式進(jìn)行融合使用180伏特/cm的一個(gè)電脈沖進(jìn)行融合15us(BTXElectroCellManipulator200)2并用BTXOptimizer-GraphicPulseAnalyzer來(lái)監(jiān)控。用于脈沖胚胎的室由相隔0.5mm放置于玻璃的顯微鏡載玻片上的兩個(gè)0.5mm的不銹鋼絲電極組成。監(jiān)控假定合子的融合、溶胞和斷裂。發(fā)育能力的評(píng)估在授精后48小時(shí)評(píng)價(jià)合子的斷裂并在7至9天后評(píng)價(jià)發(fā)育成桑椹胚或胚泡。'SigmaChemicalCo.,St.Louis,M0，USA2BTXInc.，SanDiego，Ca，USA實(shí)施例3細(xì)胞和胚胎培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)中測(cè)試不同的供體細(xì)胞、培養(yǎng)系統(tǒng)和卵母細(xì)胞受體處理，目的在于簡(jiǎn)化?？寺〕绦蛑械姆椒ú⑻岣吲咛サ拇婊盥?。當(dāng)成體成纖維細(xì)胞用作供體細(xì)胞時(shí)，使用了重建胚胎的三種培養(yǎng)系統(tǒng)TCM-199+5%FCS，Menezo+5%FCS(兩者都含有VERO細(xì)胞作為共培養(yǎng)物)和無(wú)共培養(yǎng)物但是具有較低02濃度的S0F。當(dāng)供體細(xì)胞是遺傳上和非遺傳上修飾的胎兒成纖維細(xì)胞時(shí)，也將S0F培養(yǎng)基用于培養(yǎng)重建的胚胎。最后，當(dāng)遺傳上修飾的胎兒成纖維細(xì)胞用作供體細(xì)胞時(shí)，之前用roscovitine(R)處理受體卵母細(xì)胞來(lái)中止減數(shù)分裂并最佳化受體的適用性。從屠宰場(chǎng)卵巢中吸出卵母細(xì)胞并在TCM-199+5%FCS中于39°C成熟24小時(shí)。對(duì)于R處理的組，在成熟之前，在TCM-199+5%FCS中將卵母細(xì)胞與25jaMR在39t;溫育24小時(shí)。在含有l(wèi)mg/ml牛睪丸透明質(zhì)酸的TLHEPES中渦旋3分鐘使成熟的卵母細(xì)胞棵露。評(píng)估中期并在紫外線下(<6秒)通過(guò)用Hoechst33342(5mg/ml)觀察將卵母細(xì)胞去核。將來(lái)自Augus公牛的成體成纖維細(xì)胞和來(lái)自45天大的Jersey雌性胎兒的胎兒成纖維細(xì)胞用作供體細(xì)胞。使用脂質(zhì)體進(jìn)行用含有新霉素抗性基因的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染。用遺傳霉素選擇10-15天后，通過(guò)電脈沖將G。/G,期的供體細(xì)胞與去核的卵母細(xì)胞融合。3小時(shí)后，通過(guò)在TL-HEPES中與5jnM離子霉素孵育4分鐘和與2mM6-DMAP賻育3小時(shí)來(lái)誘導(dǎo)激活。然后用TL-HEPES洗滌卵母細(xì)胞并在TCM-199+5%FCS+10g/l清蛋白中或在Menezo+2°/。FCS中(兩者都含有VER0細(xì)胞)，或在S0F培養(yǎng)基和5%C02+5%02+90°/。^中共培養(yǎng)。通常，每個(gè)受體奶牛非外科手術(shù)地移植兩個(gè)胚泡，并通過(guò)超聲波在30-35天測(cè)定懷孕。記錄卵裂(48小時(shí))、發(fā)育成胚泡(第7至9天)并通過(guò)Chi-square來(lái)分析。在S0F中培養(yǎng)胚胎時(shí)，卵裂率和發(fā)育成胚泡較高。然而，沒(méi)有觀察到由于不同培養(yǎng)條件或供體細(xì)胞來(lái)源的懷孕率的差異。中止減數(shù)分裂成熟24小時(shí)沒(méi)有損害受體卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。因此，用roscovitine處理可以用于提高NT方法中的卵母細(xì)胞的有效性。參見(jiàn)以下的表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>欄中具有不同上標(biāo)的百分?jǐn)?shù)是有差異的(P<0.05)。使植入的奶牛正常通過(guò)懷孕直至自然分娩。最后，chirurgic方法(Caesarea)可以用于分娩。在頭48小時(shí)期間給新生兒喂養(yǎng)富含Ig的初乳，然后使用合成的，之后天然的食物(所有都不含動(dòng)物來(lái)源的化合物)。實(shí)施例4對(duì)轉(zhuǎn)基因小牛和所產(chǎn)生的重組蛋白進(jìn)行的測(cè)試該實(shí)施例中，我們呈現(xiàn)了對(duì)特定的轉(zhuǎn)基因小牛及其產(chǎn)生的重組蛋白所進(jìn)行測(cè)試的完整描述，該轉(zhuǎn)基因小牛是作為實(shí)施例1至3中所述方法的結(jié)果而獲得的。盡管如此，尚須清楚的是對(duì)作為其它獲得轉(zhuǎn)基因小牛方法，如以下實(shí)施例5和6中所述的那些方法的結(jié)果而出生的動(dòng)物進(jìn)行了同一套的測(cè)定。通過(guò)對(duì)從小牛白細(xì)胞中純化得到的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用非轉(zhuǎn)基因jersey小牛的DNA作為負(fù)對(duì)照，證明了在轉(zhuǎn)基因小牛細(xì)胞的基因組中包括牛P酪蛋白啟動(dòng)子和hGH編碼基因?？梢宰鳛椴煌趧?dòng)物的同源P酪蛋白基因的單一DNA片段一起發(fā)現(xiàn)它們。使用Pharmacia自動(dòng)測(cè)序儀，證實(shí)了插入的基因序列100°/。對(duì)應(yīng)于hGH編碼基因。其包括內(nèi)含子、分泌信號(hào)和終止子。將控制在我們的小牛中相同hGH基因表達(dá)的牛P酪蛋白啟動(dòng)子也進(jìn)行了測(cè)序。所有那些元件與其預(yù)期的理論序列精確地一致，該理論序列來(lái)自用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的遺傳構(gòu)建體，從該細(xì)胞產(chǎn)生了克隆。一旦已知該實(shí)驗(yàn)遺傳階段的正確性，我們便轉(zhuǎn)向證明所產(chǎn)生的重組蛋白是所期望的并在每一個(gè)物理和化學(xué)特性方面都與天然hGH相一致。為此，我們不得不從小牛獲得奶，由于當(dāng)動(dòng)物處于產(chǎn)奶時(shí)間時(shí)，P酪蛋白啟動(dòng)子使得重組蛋白只在乳腺中表達(dá)。然后通過(guò)激素處理來(lái)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因小牛使其到滿十個(gè)月時(shí)產(chǎn)奶。到那個(gè)時(shí)間小牛稱重為240kg(約530lbs)。所述處理的第一階段包括通過(guò)皮下途徑，聯(lián)合給予雌激素(雌二醇苯甲酸酯，Histeren,InstitutoRosenbusch)和孕激素(甲孕酮醋酸酯，Pronal,Aton)，包括5次連續(xù)應(yīng)用每種藥物，劑量分別為0.1mg/kg和0.25mg/kg，每48小時(shí)(即，第1、3、5、7和9天，假定處理開(kāi)始于第一天)。第二個(gè)階段包括通過(guò)皮下途徑，給予地塞米術(shù)>(Decadron,Sidus)和催產(chǎn)素(Orasthin,HoechstMarionRoussel);將總量為20mg的前者在第18至20天的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行注射(每天為所述總量的三分之一)，而在第21至23天應(yīng)用三次50IU的后者。上述信息總結(jié)于表2中表2_<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>如所期望的，在處理結(jié)束后奶牛開(kāi)始產(chǎn)生初乳，然后所產(chǎn)生流體的品質(zhì)逐漸變成奶。將收集的流體適當(dāng)?shù)乇４娌氐椎胤治觥?duì)初乳和奶(為了簡(jiǎn)化，初乳和奶在下文中都稱為"奶"，除了當(dāng)應(yīng)該進(jìn)行區(qū)分時(shí))進(jìn)行了幾個(gè)測(cè)試，其結(jié)果顯示于圖1-4中。首先，測(cè)量所收集奶的體積。開(kāi)始的奶生產(chǎn)力(頭五個(gè)泌乳日)約為1，650mL/天。在第一個(gè)產(chǎn)奶月中，每天進(jìn)行兩次手工擠奶，一次在上午，一次在下午(可以注意每個(gè)乳房對(duì)終體積的貢獻(xiàn))；而從第二個(gè)月起，因?yàn)槟痰漠a(chǎn)生開(kāi)始增加，每天進(jìn)行三次擠奶(在上午、中午和下午)。每天的體積以或多或少的連續(xù)方式增加，直至頭次擠奶后三個(gè)月達(dá)到接近于10,000mL。在每日奶體積對(duì)日期的曲線(圖IB)中可以觀察到關(guān)于該主題的詳細(xì)信息(圖1A)。與奶體積的測(cè)量平行，對(duì)奶進(jìn)行了微生物學(xué)測(cè)定，其結(jié)果(圖2A)顯示于每mlCFU(菌落形成單位)對(duì)日期的相應(yīng)曲線中(圖2B-2C)。還通過(guò)在NB2細(xì)胞培養(yǎng)物中的體外生物活性測(cè)定評(píng)估了(hGH的)生物活性(圖3A-3B)。證明了小母牛的奶中產(chǎn)生的重組hGH的生物活性在母親的誤差等級(jí)內(nèi)，處于人天然hGH的正常值。此外，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡研究了所獲得的奶，檢測(cè)了其中主要的條帶，對(duì)應(yīng)于完整hGH。還發(fā)現(xiàn)了對(duì)應(yīng)于斷裂變體和聚集體的其它次要條帶，如在這些生產(chǎn)系統(tǒng)中所預(yù)期的。利用關(guān)于生物活性和每日體積的信息，可以使用公式1來(lái)計(jì)算hGH的日產(chǎn)量，其中mhGH是以毫克計(jì)的每日產(chǎn)生的hGH質(zhì)量；BA，以國(guó)際單位表示的生物活性；SA，hGH的比活性(3IU/mg);和V，每日收集奶的體積。數(shù)據(jù)顯示于圖4A中。hGH每日質(zhì)量的曲線顯示于圖4B中。為了建立hGH每日質(zhì)量和每日奶體積之間的直觀關(guān)聯(lián)，也將后者作圖表示于圖4B中。邁力^=_^_(公式1)可以從該信息觀察到，奶中hGH的每日質(zhì)量和每日奶體積隨著奶牛的發(fā)育趨于增加(盡管，前者以更大的比例)，其構(gòu)成重組激素生產(chǎn)力(每升奶中的hGH克數(shù))的上升趨勢(shì)?？梢宰⒁獾皆撋a(chǎn)力從產(chǎn)物是初乳時(shí)的約每升2ghGH(頭次擠奶)至從第二個(gè)泌乳月起的每升奶5ghGH的平均量。因此，隨著生產(chǎn)力的提高獲得了意想不到高產(chǎn)量的人生長(zhǎng)激素，隨著流體的品質(zhì)從初乳變成奶以或多或少連續(xù)的方式。盡管目前每天產(chǎn)生的hGH質(zhì)量是相當(dāng)顯著的，但是應(yīng)該注意到，因?yàn)槟膛＿€沒(méi)有完全生長(zhǎng)，每天產(chǎn)生的重組蛋白的質(zhì)量上升趨勢(shì)應(yīng)該會(huì)在將來(lái)持續(xù)，直至達(dá)到最大值。對(duì)奶進(jìn)行測(cè)試的同時(shí)，對(duì)奶牛的血清進(jìn)行了一套不同的測(cè)定，其結(jié)果顯示于圖5A-5C中。首先，進(jìn)行奶牛血清中hGH濃度的測(cè)量。將結(jié)果(圖5A)與奶中hGH的每日質(zhì)量一起作曲線于圖中，使得可以比較兩個(gè)量值(圖5B)。(人)血清中GH的參考范圍是0.06-5ng/ml。假定對(duì)于牛是假設(shè)的相似范圍，可以注意到，除了開(kāi)始時(shí)，轉(zhuǎn)基因奶牛血清中hGH對(duì)日期的整個(gè)曲線完全超過(guò)所述范圍的上限。盡管該事實(shí)，必須考慮盡管對(duì)于它們的氨基酸序列和3D-結(jié)構(gòu)，hGH和相應(yīng)的牛激素(bGH)非常相似，前者，盡管是完全功能性的，但在牛中不是完全活性的。因此，為了評(píng)估由于在其血清中這些高含量的hGH對(duì)奶牛健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)進(jìn)行了IGF-1(胰島素樣生長(zhǎng)因子1，也稱為促生長(zhǎng)因子C)血清濃度的測(cè)量(圖5A)。生長(zhǎng)激素主要通過(guò)在肝臟中形成的IGF-1執(zhí)行其功能。因?yàn)镮GF-1介導(dǎo)許多體內(nèi)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)激素的代謝作用，所以IGF-1評(píng)估對(duì)于可疑的生長(zhǎng)激素失調(diào)的間接評(píng)價(jià)是有價(jià)值的診斷工具。因此，IGF-1代表生物可利用的生產(chǎn)激素的可靠指示物。這些分析的結(jié)果與對(duì)應(yīng)于hGH的結(jié)果一起顯示于圖5C中，可以同時(shí)觀察兩個(gè)量值。此外，為了具有對(duì)照組并因此建立與對(duì)應(yīng)于轉(zhuǎn)基因奶牛數(shù)據(jù)的比較，測(cè)量了非轉(zhuǎn)基因奶牛組血清中的IGF-1和hGH。對(duì)于非轉(zhuǎn)基因組和轉(zhuǎn)基因奶牛的兩種蛋白質(zhì)測(cè)量的平均值顯示于以下的表3中。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>值得注意的是非轉(zhuǎn)基因組中hGH的平均血清濃度位于假設(shè)參考范圍內(nèi)，而轉(zhuǎn)基因奶牛的平均值完全超過(guò)所述范圍的上限。此外，無(wú)容置疑的是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物血清中的IGF-1平均含量絕對(duì)高于對(duì)應(yīng)于非轉(zhuǎn)基因奶牛的，其構(gòu)成根本的差異。因此，盡管轉(zhuǎn)基因奶牛血清中hGH的高濃度(已知其在人中導(dǎo)致具有嚴(yán)重后果的疾病，如糖尿病、高血壓、心血管疾病提高的風(fēng)險(xiǎn)和身體器官的擴(kuò)大，包括肝臟、脾臟、腎臟和心臟)理論上將使得動(dòng)物不能存活，這明顯地并不能代表對(duì)其健康和保持良好狀態(tài)的障礙。在其血液中具有令人驚訝高含量的外源激素，但是其完全健康并產(chǎn)生突出產(chǎn)量的重組蛋白的奶牛構(gòu)成意想不到的和創(chuàng)新的貢獻(xiàn)，本發(fā)明另一創(chuàng)新的方面是進(jìn)入奶牛血流中的重組hGH,刺激乳腺產(chǎn)生更多的奶。該作用是間接獲得的，即，通過(guò)IGF-1的作用。該分子提高了通過(guò)乳腺的血液流動(dòng)，提供了用于合成乳脂、蛋白質(zhì)和乳糖的關(guān)鍵前體物質(zhì)。因此，IGF-1起指導(dǎo)營(yíng)養(yǎng)物通過(guò)血液流向乳房細(xì)胞的作用，在乳房中它們幫助產(chǎn)生奶。因此，獲得了自我刺激的動(dòng)物，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因奶牛的奶中產(chǎn)生的重組hGH通過(guò)乳腺刺激促進(jìn)了動(dòng)物產(chǎn)生的奶體積的持續(xù)增加，相應(yīng)地在其奶中分泌更多的hGH。實(shí)施例5通過(guò)亞克隆獲得轉(zhuǎn)基因小牛使用1.5mm直徑的針從轉(zhuǎn)基因小牛的耳朵取出五個(gè)組織樣品，為了該目的之前已經(jīng)將針的末端做成了斜角。將樣品在含有抗生素和抗真菌劑的基于PBS的培養(yǎng)基中冷凍運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。然后，將組織樣品在含有10%胎牛血清和抗生素的MEM培養(yǎng)基中在39C和5%0)2氣氛下溫育72小時(shí)。最終，取出組織樣品，使平板周?chē)某衫w維細(xì)胞生長(zhǎng)直至連生。一旦達(dá)到連生，為了獲得它們?cè)贕。期的同步化，將成纖維細(xì)胞至少孵育5天而沒(méi)有改變培養(yǎng)基，通過(guò)用顯微鏡觀察來(lái)評(píng)估。胰蛋白酶作用后，將單個(gè)成纖維細(xì)胞與根據(jù)實(shí)施例2的去核牛卵母細(xì)胞融合，將因此荻得的胚胎在S0F培養(yǎng)基中和5%CO2+5%O2+90%N2氣氛下培養(yǎng)直至胚泡的階段。然后，通常在每個(gè)受體奶牛中非外科手術(shù)地移植兩個(gè)胚泡，并通過(guò)超聲波在30-35天測(cè)定懷孕。使植入的奶牛正常地從懷孕直至自然分娩。最終，可以使用chirurgic方法(Caesarea)來(lái)分娩。在頭48小時(shí)給新生兒喂養(yǎng)富含Ig的初乳，然后使用合成的，之后天然的食物(它們都不含動(dòng)物來(lái)源的化合物)。圖6A和6B顯示了同時(shí)進(jìn)行的通過(guò)亞克隆轉(zhuǎn)基因奶牛獲得的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的hGH和IGF-1血清濃度的測(cè)量，并將這些分析的結(jié)果分別作圖于圖6C和6D中，使得可以同時(shí)觀察每個(gè)動(dòng)物的兩個(gè)量值。由于目前小牛是年輕的，hGH和IGF-1兩者的值仍然位于各自的參照范圍內(nèi)，但是預(yù)期它們將與從中獲得了這兩個(gè)克隆的轉(zhuǎn)基因奶牛一樣升高。實(shí)施例6通過(guò)將超排卵的轉(zhuǎn)基因奶牛人工授精來(lái)獲得轉(zhuǎn)基因小牛該實(shí)施例中將公開(kāi)獲得轉(zhuǎn)基因牛的可替換的方法。該方法包括通過(guò)激素處理使轉(zhuǎn)基因奶牛超排卵；將所述的奶牛人工授精；收集因此產(chǎn)生的胚胎；將所述胚胎植入代孕奶牛中；并產(chǎn)生懷孕直至動(dòng)物的出生。以下呈現(xiàn)了該方法的描述。超排卵在笫1天(即，方法開(kāi)始的那天)的早晨，通過(guò)肌內(nèi)途徑將150iag的前歹'J腺素(D(+)-clorprosteno1，Arsaprost,Arsa)給藥于轉(zhuǎn)基因奶牛。使動(dòng)物接受每天4kg的含有約15%蛋白質(zhì)的膳食(在第1天之前，動(dòng)物已經(jīng)給予2kg食物，含有相同含量的蛋白質(zhì))。在第8天的早晨，陰道內(nèi)放入黃體酮的CIDR(受控內(nèi)部藥物釋放)裝置。此外，通過(guò)肌內(nèi)途徑給予50mg黃體酮和雌二醇。喂養(yǎng)動(dòng)物的食物量提高至6kg/天，含有相同含量的蛋白質(zhì)。然后，在第12、13和14天兩次肌內(nèi)注射FSH和LH(PLUSET,Calier)(—次在早晨，另一次在下午)。接下來(lái)的一天(第15天)，通過(guò)肌內(nèi)途徑繼續(xù)給藥處理，兩次注射PLUSET(—次在早晨，另一次在下午)和兩次注射每次150jag前列腺素(相同給藥方案)。在第16天的早晨，除去CIDR。整個(gè)超排卵期給予的？1^387@總量為350IU。該階段包括來(lái)自供體jersey公牛的精子的三次連續(xù)給予(第一次和第二次，各自在第17天的早晨和下午，最后一次，在第18天的早晨)，之前已經(jīng)獲得精子并冰凍保存以保持游動(dòng)精子的存活力。收集胚胎并將它們植入代孕奶牛中在第26天的早晨通過(guò)用1LDMPBS(Nutricell)沖洗奶牛子宮的兩個(gè)角來(lái)收集胚胎。此后立刻在每個(gè)受體奶牛中非外科手術(shù)地移植兩個(gè)胚胎，并通過(guò)超聲波在30-35天測(cè)定懷孕。使植入的奶牛正常地從懷孕直至自然分娩。最后可以使用chirurgic方法(Caesarea)來(lái)分娩。在頭48小時(shí)給新生兒喂養(yǎng)富含Ig的初乳，然后使用合成的，之后天然的食物(它們都不含動(dòng)物來(lái)源的化合物)。由于生物后代的產(chǎn)生遵循孟德?tīng)栠z傳定律，作為上述方法的結(jié)果出生的動(dòng)物的一半是轉(zhuǎn)基因的，這些中的一半是雄性，而另一半是雌性。因此，存在獲得轉(zhuǎn)基因雄性(起始動(dòng)物)的高概率，為了擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因畜群，其精子可以用于建立jersey轉(zhuǎn)基因精子的母種庫(kù)(MasterBank)，用于超排卵的轉(zhuǎn)基因/非轉(zhuǎn)基因奶牛的授精。實(shí)施例7從奶中純化重組hGH一旦證實(shí)近似分子量、蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果和小牛的奶中產(chǎn)生的重組hGH的生物活性是正確的，就進(jìn)行徹底的純化過(guò)程，因?yàn)楫?dāng)制造生物藥物產(chǎn)品時(shí)，為了避免所述產(chǎn)品中存在可能的污染物，必不可少的是應(yīng)該將目標(biāo)蛋白純化至均一性。該過(guò)程包括以下步驟通過(guò)離心獲得奶的撇渣并將獲得的上清液稀釋以達(dá)到最終保留于酪蛋白膠束中的重組hGH更好的溶解度(澄清)；并使該溶液通過(guò)膨脹床陰離子交換色譜柱(該步驟可替換的方案是使用免疫親和柱，參見(jiàn)以下的實(shí)施例8);使所得到的溶液接受反相HPLC(C4)步驟；然后對(duì)富含重組hGH的級(jí)分進(jìn)行陰離子交換色傳。將純化的物料脫鹽、濃縮并接受分子排阻色鐠。為了獲得純的重組hGH，通過(guò)分子量來(lái)分離。從奶中純化人生長(zhǎng)激素(hGH)的方法包括以下步驟，依次為(a)澄清(b)膨脹床陰離子交換色譜，(c)反相色譜，(d)陰離子交換色鐠，(e)分子排阻色譜(脫鹽)，(f)濃縮和(g)分子排阻色譜。澄清為了獲得0.5%的溶液，將新鮮的奶與足量的吐溫80混合。加入吐溫80后，加入2M的Tris-HC1來(lái)獲得7.3±0.1的pH。然后，將產(chǎn)物均化30分鐘，然后為了分離脂肪層在14000g下離心。之后，將所得到的溶液用0.5%的吐溫80稀釋直至低于或等于1500/jS/cm的傳導(dǎo)率。用2MTris-HCl將pH調(diào)節(jié)至7.3±0.1，然后將產(chǎn)物通過(guò)0.8jam孔的膜過(guò)濾并方便地保存。膨脹床陰離子交換色鐠根據(jù)以下參數(shù)，使用陰離子交換基質(zhì)將前一步驟所獲得的物料進(jìn)行色鐠1.設(shè)備A.柱子1)直徑5cm2)床高30cm(壓實(shí)的床)3)基質(zhì)a)StreamlineQXL(Amersham)b)體積600ml2.溶液和緩沖液A.0.5NNaOHB.20%乙醇C.緩沖液A:20mMTris.HCl,pH7.3D.緩沖液B:500mMTris.HC1，pH7.3E.緩沖液C:20mMTris.HCl，150mMNaCl，pH7.3F.緩沖液D:20mMTris.HCl，500mMNaCl，pH7.33.待色譜的物料A.澄清的奶B.樣品條件1)體積25±5L2)傳導(dǎo)率<1500uS/cm3)pH:7.3土0.1為了平衡柱子，使1.5倍柱體積("vc")(900niL)的純水通過(guò)柱子，流速為115士5cm/小時(shí)(下行流)。然后，使下列溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過(guò)柱子，流速為230±30cm/小時(shí)(上行流)3.0vc(1，800ml)的0.5NNaOH;3.0vc(1，800ml)的純水；1.0vc(600ml)的緩沖液B;和最后，3.0vc(1，800ml)的緩沖液A。一旦柱子得到了平衡，裝載待色譜的物料。所述裝栽在12士3X:下和以230±30cm/小時(shí)的流速進(jìn)行。此后，以115±15cm/小時(shí)的流速和在相同的溫度下進(jìn)行洗脫。首先，使足夠量的緩沖液A通過(guò)柱子(上行流)，其次使下文中詳述的溶液和緩沖液以下列次序通過(guò)柱子(下行流)1.5vc(900ml)的緩沖液A;2.0vc(1,200ml)的緩沖液C;和最后，2.0vc(1,200ml)的緩沖液D。一旦完成該步驟，為了清洗柱子，使以下的溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過(guò)柱子1.5vc(900ml)的純水；1.5vc(900ml)的0.5NNaOH;2.0vc(1，200ml)的純水；1.0vc(600ml)的緩沖液B;1.5vc(900ml)的純水；和最后，1.5vc(900ml)的20%乙醇。測(cè)定所選擇的含有hGH級(jí)分的總蛋白(通過(guò)Bradford方法)和目標(biāo)蛋白(通過(guò)RIA)，并保存于2-8匸。反相色譜根據(jù)以下參數(shù)將前一步驟所獲得的物料進(jìn)行色謙1，設(shè)備A.柱子1)直徑4cm2)床高48cm3)基質(zhì)a.BakerBondWide-PoreButyl(C4)15jimprepLCPacking(Baker)b,體積600ml2.溶液和緩沖液A.移動(dòng)相l(xiāng)(MPl):30mMNaHC03，pH7.2:純水乙腈(35:55:10)B.移動(dòng)相2(MP2):30mMNaHC03，pH7.2:純水乙腈(20:10:70)C.50%曱醇3.待色譜的物料A.從前一步驟得到的所選級(jí)分的集合體B.樣品條件1)體積30±15L2)pH:7.3±0.3為了平衡柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過(guò)柱子，流速低于或等于478cm/小時(shí)0.3vc(180ml)50%甲醇；此后，運(yùn)用50。/4甲醇-MP2的梯度，從所述溶液100:0的比例開(kāi)始直至達(dá)到在1.Ovc(600ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；一旦完成梯度，使1.Ovc(600ml)的MP2通過(guò)柱子；此后，運(yùn)用MP2-MP1的梯度，從所述溶液100:0的比例開(kāi)始直至達(dá)到在1.Ovc(600ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；和最后，使2.Ovc(1，200ml)的MPl通過(guò)柱子。一旦柱子得到了平衡，使待色譜的物料通過(guò)0.45um孔的膜過(guò)濾，此后立即裝載。所述裝栽在20土5X:和低于或等于238cm/小時(shí)的流速下進(jìn)行。此后，在478土78cm/小時(shí)的流速和相同的溫度下進(jìn)^f亍洗脫，使下文中詳述的溶液和緩沖液以以下的次序通過(guò)柱子1.Ovc(600ml)的MP1;MP1-MP2的梯度，從所述溶液65:35的比例開(kāi)始直至達(dá)到在18.Ovc(9，OOOml)的總體積中所述溶液45:55的比例；1.Ovc(600ml)45:55比例的MP1-MP2;和最后，2.Ovc(1，200ml)的MP2。一旦完成該步驟，為了清洗柱子，運(yùn)用MP2-50。/。曱醇的梯度，從所述溶液100:0的比例開(kāi)始直至達(dá)到在1.Ovc(600ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；和最后，使2.Ovc(1，200ml)的50%甲醇通過(guò)柱子。通過(guò)SDS-PAGE測(cè)定該色語(yǔ)所得到的級(jí)分，均質(zhì)性為20%且對(duì)于氧化的hGH，根據(jù)結(jié)果，進(jìn)行選擇。此后，測(cè)定所選擇的含有hGH級(jí)分的總蛋白(通過(guò)Bradford方法)，并保存于2-8'C。陰離子交換色i普使用陰離子交換基質(zhì)將前一步驟所獲得的物料進(jìn)行色^普，如下1.設(shè)備A.柱子1)直徑5cm2)床高25cm3)基質(zhì)a.Source30Q(Pharmacia)b.體積500ml2.溶液和緩沖液A.20%乙醇B.溶液K:0.5NNaOH,3MNaClC.溶液L:50mMTris，pH7.50D.溶液M:0.INHCl，3MNaClE.移動(dòng)相3(MP3):溶液L:乙腈(70:30)F.移動(dòng)相4(MP4):50mMTris，0.1MNaCl，pH7.50:乙腈(70:30)3.待色鐠的物料A.從前一步驟獲得的所選級(jí)分B.樣品條件1)體積4.5±1L2)pH:7.2±0.2為了平衡和清潔柱子，使以下的溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過(guò)柱子，流速低于或等于183土20cm/小時(shí)1.Ovc(500ml)純水；l.Ovc(500ml)的溶液K;1.Ovc(500ml)的溶液L;和最后，1.Ovc(500mL)的MP3。一旦柱子得到了平衡，裝載待色鐠的物料。所述裝載在2G士5X:和低于或等于183cm/小時(shí)的流速下進(jìn)行。此后，在183土20cm/小時(shí)的流速和相同的溫度下進(jìn)行洗脫，使下文中詳述的溶液和緩沖液以以下的次序通過(guò)柱子1.Ovc(500邁1)的MP3;MP3-MP4的梯度，從所述溶液15:85的比例開(kāi)始直至達(dá)到在5.Ovc(2500ml)的總體積中所述溶液25:75的比例；和最后，使2.Ovc(1000ml)的MP4通過(guò)柱子。一旦完成該步驟，為了清洗柱子，將以下溶液或緩沖液以下文中詳迷的量按次序通過(guò)柱子MP4-純水的梯度，從所述溶液100:0的比例開(kāi)始直至達(dá)到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；0.5vc(250ml)的純水；純水-溶液K的梯度，從所述溶液100:0的比例開(kāi)始直至所述達(dá)到在0.5vc(250ml)的總體積中溶液0:100的比例；l.Ovc(500ml)的溶液K;溶液K-純水的梯度，從所述溶液100:0的比例開(kāi)始直至達(dá)到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；0.5vc(250ml)的純水；純水-溶液M的梯度，從所迷i^液100:0的比例開(kāi)始直至達(dá)到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；1.Ovc(500ml)的溶液M;溶液M-純水的梯度，從所迷溶液100:0的比例開(kāi)始直至達(dá)到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；1.0vc(500ml)的純水；純水-溶液L的梯度，從所述溶液100:0的比例開(kāi)始直至達(dá)到在0.5vc(250ffll)的總體積中所述溶液0:100的比例；0.5vc(250ml)的溶液L;溶液L-純水的梯度，從所述溶液100:0的比例開(kāi)始直至達(dá)到在0.5vc(250ml)的總體積中所述溶液0:100的比例；和最后，1.5vc(750ml)的純水。測(cè)定所選的含有hGH級(jí)分的總蛋白(通過(guò)Bradford方法)，并保存于2-8匸。分子排阻色謙使用分子排阻基質(zhì)將前一步驟所獲得的物料進(jìn)行色譜，如下1.設(shè)備A.柱子1)直徑5cm2)床高25cm3)基質(zhì)a.CellufineGH25(Millipore)b.體積500ml2.溶液和緩沖液A.0.5NNaOHB.20%乙醇C.緩沖液C:150mMNaH氛pH7.2D.緩沖液G:320mM甘氨酸，10mMNaH2PO4，0.1%吐溫80，pH6.93.待色鐠的物料A.從前一步驟得到的所選級(jí)分B.樣品條件1)體積0.5士0.2L2)pH:7.5±0.5為了平衡和清潔柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過(guò)柱子，流速低于或等于180cm/小時(shí)1.0vc(500ml)的純水；l.Ovc(500niL)的0.5NNaOH;0.5vc(250ml)的純水0.5vc(250ml)的緩沖液C;和最后，2.Ovc(1000ml)的緩沖液G。一旦柱子得到了平衡，裝載待色鐠的物料。所述裝載在20±5匸和183土20cm/小時(shí)的流速下進(jìn)行。此后，在相同流速和溫度下進(jìn)行洗脫，并使l.0vc(500ml)的緩沖液G通過(guò)柱子，運(yùn)行所需進(jìn)行的次數(shù)。一旦完成該步驟，為了清洗柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過(guò)柱子0.5vc(250ml)的純水；1.Ovc(500ml)的0.5N歸H;0.5vc(250ml)的純水；0.5vc(250ml)的緩沖液C;0.5vc(250ml)的純水；和最后，1.5vc(750ml)的20%乙醇。測(cè)定所選的含有hGH級(jí)分的總蛋白(通過(guò)Bradford方法)，并保存于2-8t:。濃縮根據(jù)以下所述的條件將前一實(shí)施例中所得到的級(jí)分濃縮1.設(shè)備A.蠕動(dòng)泵WatsonMarlow—Cat，No.302SB.管道WatsonMarlow-Cat.No.902.0080.016C.濃縮器PrepScaleMillipore—Cat.No.CDUF006LC2.溶液和緩沖液A.0.28%的十二烷基硫酸鈉(SDS)B.0.06%的TritonC.0.125NNaOHD.緩沖液G:320mM甘氨酸，10mM的NaH2P04，0.1%的吐溫80，pH6.93.待處理的物料A.從前一實(shí)施例獲得的所選級(jí)分B.樣品條件1)體積1.0±0.5L2)傳導(dǎo)率1200±lOOyS/cm3)pH:6.9±0.1首先清洗、清潔和平衡設(shè)備，并使以下次序的溶液和緩沖液流過(guò)設(shè)備2L的0.125NNaOH;10L的純水；和最后，2L的緩沖液G。然后準(zhǔn)備好設(shè)備以便用于按照通常的方法，濃縮所選的級(jí)分。進(jìn)行濃縮程序直至達(dá)到15mg/ml的蛋白濃度(通過(guò)Bradford方法測(cè)得)。使所選的級(jí)分通過(guò)0.22jum孔的膜過(guò)濾，測(cè)定總蛋白(通過(guò)Bradford方法)，并保存于41c。所選級(jí)分的傳導(dǎo)率和pH分別為1，100-1，300mS/cm和6.9±0.1。分子排阻色鐠使用分子排阻基質(zhì)將前一步驟所得到的物料進(jìn)行色鐠，如下1.設(shè)備A.柱子1)直徑5cm2)床高92cm3)基質(zhì)a.SephacrylS-200HighResolution(AmershamPharmacia)b.體積1，800ml2.溶液和緩沖液A.0.5NNaOHB.20%乙醇C.緩沖液H:320mM甘氨酸，2.2mMNaH2P04，1.8mMNa2HP04，pH7.303.待色譜的物料A.從前一步驟所選的，濃縮的級(jí)分B.樣品條件1)體積40±20ml2)傳導(dǎo)率l,200±100pS/cm3)pH:7.3±0.1為了平衡和清潔柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過(guò)柱子，流速低于46cm/小時(shí)1.Ovc(1，800ml)的純水;1.Ovc(1，800ml)的0.5NNaOH;和最后，2.0vc(3，600ml)的緩沖液H。一旦柱子得到了平衡，裝載待色鐠的物料。所述裝載在20±5匸和46士15cm/小時(shí)的流速下進(jìn)行。此后，在相同流速和溫度下進(jìn)行洗脫，并使1.0vc(1，800ml)的緩沖液H通過(guò)柱子，運(yùn)行所需進(jìn)行的次數(shù)。一旦完成該步驟，為了清洗柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過(guò)柱子l.Ovc(1，800ml)的純水；和1.5vc(2，700ml)的20%乙醇。將含有純hGH的級(jí)分通過(guò)O.22jim孔的膜無(wú)菌過(guò)濾至無(wú)菌的、去熱原的塑料瓶中，測(cè)定總蛋白，并保存于-2ox:。實(shí)施例8從奶中純化hGH的可替換的方法替代之前所述的純化方法，為了純化奶中所含有的重組hGH，可以使用可替換的方案。實(shí)施例7中所述方法和該實(shí)施例中所呈現(xiàn)的可替換方法之間的主要差異在于前者的第二個(gè)步驟包括膨脹床陰離子交換色鐠，而后者相應(yīng)的步驟需要免疫親和色鐠。兩種方法的澄清步驟也略有差別。因?yàn)閮蓚€(gè)純化方案的其余部分是相同的，以下只描述可替換方法的頭兩個(gè)步驟。澄清為了獲得O.5%的溶液，將新鮮的奶與足量的吐溫80混合。加入吐溫80后，加入1M的Tris來(lái)獲得7.3±0.3的pH。此后，將產(chǎn)物均化30分鐘，然后為了分離脂肪層在14000g下離心。之后，用緩沖液S(50mMTris.HCl，500mMNaCl，0.5%吐溫80，pH7.3)將所得到的溶液稀釋20倍，然后將產(chǎn)物通過(guò)0.45um孔的膜過(guò)濾并方便地保存。免疫親和色鐠根據(jù)以下參數(shù)使用免疫親和相互作用基質(zhì)(Affigel10EsterAgarose,BioRad制造，共價(jià)連接的抗-GH單克隆抗體，BioSidus制造)將前一步驟所獲得的物料進(jìn)行色譜1.設(shè)備A.柱子1)直徑30cm2)床高15cm3)基質(zhì)a)Affigel10EsterAgarose(BioRad)，共價(jià)連接的抗-GH單克隆抗體(BioSidus)b)體積10L2.溶液和緩沖液A.緩沖液A:20mMTris.HCl，500mMNaClB.緩沖液B:100mM檸檬酸，pH3.0C.緩沖液C:150mMNaH2P04，pH7.2D.緩沖液D:50mMTris.HCl，500mMNaClpH7.2E.緩沖液E:50mMTris.HCl，500mMNaCl，化鈉，0.lg/L慶大霉素3.待色語(yǔ)的物料A.澄清的奶B.樣品條件1)體積30-50L2)傳導(dǎo)率45±15mS/cm3)pH:7.3±0.3為了平衡和清潔柱子，如果在最近七天中沒(méi)有使用過(guò)，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過(guò)柱子，流速低于51cm/小時(shí)l.O柱體積("vc")(IOL)的緩沖液A;2.Ovc(20L)的緩沖液D;2.Ovc(20L)的緩沖液A;1.Ovc(10L)的緩沖液B;,2.Ovc(20L)的緩沖液C;和最后，1.Ovc(10L)的緩沖液A。，pH7.2,500mM胍.HCl，pH7.2，0.2%疊氮另一方面，如果在最近七天中已經(jīng)用過(guò)柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過(guò)柱子，流速低于51cm/小時(shí)l.Ovc(10L)的緩沖液C;和最后，2.Ovc(20L)的緩沖液A。一旦柱子得到平衡，裝載待色鐠的物料。所述裝載在5土3X:和低于51cm/小時(shí)的流速下進(jìn)行。此后，在42±9cm/小時(shí)的流速和相同的溫度下進(jìn)行洗脫。將下文中詳述的溶液和緩沖液以以下的次序通過(guò)柱子2.0vc(20L)的緩沖液A;和1.5vc(15L)的緩沖液B。一旦完成該步驟，為了清洗柱子，使以下溶液或緩沖液以下文中詳述的量按次序通過(guò)柱子2.Ovc(20L)的緩沖液D;2.0vc(20L)的緩沖液A;和最后，2.0vc(20L)的緩沖液E。測(cè)定所選的含有hGH級(jí)分的總蛋白(通過(guò)Bradford方法)和目標(biāo)蛋白(通過(guò)RIA)，并保存于4"C。實(shí)施例9純的重組hGH的質(zhì)量控制對(duì)兩批純的重組hGH進(jìn)行一系列的測(cè)定來(lái)證實(shí)該產(chǎn)物與天然hGH沒(méi)有差別。這樣的方法包括，但不限于，SDS/PAGE、蛋白質(zhì)印跡、體外(細(xì)胞nb2)和體內(nèi)(切除垂體的大鼠)的生物活性、肽圖譜、完整氨基酸序列的測(cè)定、等電聚焦(IEF),以及反相和大小排阻HPLC分析。對(duì)于重組的和天然的hGH，所有那些測(cè)定中所獲得的結(jié)果完全相同，其證明了純的重組hGH完全對(duì)應(yīng)于天然hGH,因此適用于制造生物藥物產(chǎn)品?，F(xiàn)在已經(jīng)充分地描迷了本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解可以在寬和相等范圍的條件、配制和其它參數(shù)下進(jìn)行相同的發(fā)明而不會(huì)影響本發(fā)明或其任何實(shí)施方案的范圍。在此所引用的所有專利和出版物在此以其整體全部引入作為參考。序列表<110>SterrenbeldBiotechnologieNorthMelo,CarlosAlbertoBaranao,LinoCarbonetto，Cesar<120>在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物奶中生產(chǎn)外源蛋白的方法以及從其中純化蛋白的方法〈130>1909.010PC02〈腸4<170>Patentlnversion3.2<210>1<2U>31<212>DNA<213〉人工的<220><223>引物PB1<400〉1tctactcgaggatcatctatctgtcccaaag31<210>2<211〉27<212>腿<213〉人工的<220><223〉引物PB2<400>ctaggatccaatgatctgattttgtgg〈210〉<211〉<212><213>腿人工的<220〉<223〉引物PB4<400〉3ctaggatccatggctacaggtaagcgcc<210>4<211>20<212>薩<213>人工的<220><223>引物G町E<400〉4atgctgtgtctggacgtcct權(quán)利要求1.生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括a)制造在其奶中產(chǎn)生目標(biāo)蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物；b)從所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物獲得所述奶；和c)從所述奶中純化所述目標(biāo)蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物是通過(guò)以下方法制得的，該方法包括a)獲得編碼目標(biāo)蛋白的基因；b)將所述基因克隆至質(zhì)粒中，借此將所述基因可操作地連接至指導(dǎo)所述基因在乳房細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子，形成表達(dá)質(zhì)粒；c)用所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體細(xì)胞，使得所述質(zhì)粒摻入到所述體細(xì)胞的基因組中，得到轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞；d)將成熟卵母細(xì)胞去核，得到去核的卵母細(xì)胞；e)將一個(gè)所述的轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞與所述去核的卵母細(xì)胞融合，得到單細(xì)胞胚胎；f)將所述胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中；和g)監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。3.權(quán)利要求2的方法，其中所述啟動(dòng)子是P酪蛋白啟動(dòng)子，而其中所述的目標(biāo)蛋白是人生長(zhǎng)激素。4.權(quán)利要求3的方法，其中表達(dá)質(zhì)粒是pRPhGH。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)一步包含新霉素抗性基因。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述表達(dá)質(zhì)粒是pRNeo。7.權(quán)利要求2的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是在其奶中產(chǎn)生重組人生長(zhǎng)激素的牛，其基因組包含整合的質(zhì)粒，其中所述的質(zhì)粒包含人生長(zhǎng)激素基因和指導(dǎo)所述基因在所述哺乳動(dòng)物的乳房細(xì)胞中表達(dá)的P酪蛋白啟動(dòng)子。8.權(quán)利要求7的方法，其中所述質(zhì)粒是pRPhGH。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述質(zhì)粒進(jìn)一步包含新霉素抗性基因。10.權(quán)利要求9的方法，其中所述質(zhì)粒是pRNeo。11.權(quán)利要求2的方法，其中所述體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。12.權(quán)利要求2的方法，其中經(jīng)從在其奶中產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)基因雌性中分離來(lái)獲得所述的轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。14.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物通過(guò)以下方法制得，該方法包括a)使在其奶中產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)基因雌性非人哺乳動(dòng)物超排卵；b)將所述哺乳動(dòng)物與從雄性非人非轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來(lái)產(chǎn)生胚胎；c)收集所述胚胎；d)將所述胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中；和e)監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。15.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物通過(guò)以下方法制得，該方法包括a)使在其奶中產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)基因雌性非人哺乳動(dòng)物超排卵；b)將所述哺乳動(dòng)物與從產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)基因雄性非人哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來(lái)產(chǎn)生胚胎；c)收集所述胚胎；d)將所述胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中；和e)監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。16.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物通過(guò)以下方法制得，該方法包括a)使雌性非人非轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物超排卵；b)將所述哺乳動(dòng)物與從產(chǎn)生所述目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)基因雄性非人哺乳動(dòng)物獲得的精子人工授精來(lái)產(chǎn)生胚胎；c)收集所迷胚胎；d)將所述胚胎植入受體哺乳動(dòng)物的子宮中；和e)監(jiān)控懷孕直至轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的出生。17.權(quán)利要求2、12、14、15或16任一項(xiàng)的方法，其中所述哺乳動(dòng)物屬于牛物種、豬物種、綿羊物種、山羊物種或嚙齒動(dòng)物物種。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述哺乳動(dòng)物屬于牛物種。19.權(quán)利要求2、12、14、15或16任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)蛋白是哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素。20.權(quán)利要求19的方法素、牛生長(zhǎng)激素、豬生長(zhǎng)激素物生長(zhǎng)激素。21.權(quán)利要求20的方法素。22.權(quán)利要求21的方法，奶的水平來(lái)產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。23.權(quán)利要求22的方法，奶的水平來(lái)產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。24.權(quán)利要求23的方法，奶的水平來(lái)產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。25.權(quán)利要求24的方法，奶的水平來(lái)產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。26.權(quán)利要求25的方法，奶的水平來(lái)產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。27.權(quán)利要求26的方法，奶的水平來(lái)產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。28.權(quán)利要求19的方法，其中所述哺乳動(dòng)物所述哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素的產(chǎn)生刺激了所述哺乳動(dòng)物產(chǎn)生更多的包含所述哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素的奶。29.權(quán)利要求2、12、14、15或16任一項(xiàng)的方法，其中在所述哺其中所述哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素是人生長(zhǎng)激綿羊生長(zhǎng)激素、山羊生長(zhǎng)激素或嚙齒動(dòng)其中所述哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)激素是人生長(zhǎng)激其中所述哺乳動(dòng)物以高于約1.0ghGH/L其中所述哺乳動(dòng)物以高于約2.0ghGH/L其中所述哺乳動(dòng)物以高于約3.0ghGH/L其中所述哺乳動(dòng)物以高于約4.0ghGH/L其中所迷哺乳動(dòng)物以高于約5.0ghGH/L其中所述哺乳動(dòng)物以高于約6.0ghGH/L指導(dǎo)所述基因在乳房細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子)。全文摘要本發(fā)明涉及生產(chǎn)目標(biāo)蛋白的方法，包括制造在其奶中產(chǎn)生所述蛋白的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，從非人轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物獲得所述奶，并從奶中純化所述目標(biāo)蛋白。方便地克隆產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因牛動(dòng)物，其能夠在乳腺中產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素。該方法包括在表達(dá)載體中方便地克隆編碼hGH基因和β酪蛋白啟動(dòng)子的遺傳構(gòu)建體。還包括胎牛體細(xì)胞，通常是成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染過(guò)程，并核移植進(jìn)去核的牛卵母細(xì)胞，因此產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎。該方法還包括產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因胚胎的其它過(guò)程用于進(jìn)一步擴(kuò)大轉(zhuǎn)基因畜群，如亞克隆轉(zhuǎn)基因雌性牛，使轉(zhuǎn)基因奶牛超排卵并與來(lái)自非轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因雄性牛的精子授精，以及使非轉(zhuǎn)基因奶牛超排卵并與來(lái)自轉(zhuǎn)基因雄性牛的精子授精。然后，轉(zhuǎn)基因胚胎產(chǎn)生在其奶中大量產(chǎn)生人生長(zhǎng)激素的轉(zhuǎn)基因牛，從奶中完全純化激素并分析以滿足制造純的生物藥物產(chǎn)品的所有要求。文檔編號(hào)C12N15/16GK101413003SQ200810170189公開(kāi)日2009年4月22日申請(qǐng)日期2004年9月29日優(yōu)先權(quán)日2003年9月30日發(fā)明者C·A·梅洛,C·卡爾博內(nèi)托,L·巴拉瑙申請(qǐng)人:斯特林貝爾德生物技術(shù)北美公司