專利名稱：將外源物質(zhì)大量導入活細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的領(lǐng)域是生物技術(shù)。
基因工程是七十年代發(fā)展起來的一項生物高技術(shù)。這項技術(shù)為改造生物性狀和快速育種提供了有力的工具。它包括相對獨立的兩大部分。其一，用分子克隆手段分離出目的基因(如抗病抗蟲基因，耐鹽堿基因，抗旱抗逆基因等等)。其二，將目的基因?qū)肷锛毎?，使目的基因在細胞或個體水平上表達。目前，克隆目的基因已有一些較為有效的方法，而將外源目的基因有效地導入細胞，尤其是導入農(nóng)作物細胞和動物受精卵則是基因工程的一大難題。
目前，往植物細胞導入外源基因還沒有一種行之有效的方法。如土壤農(nóng)桿菌-Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)，是研究的最深入的植物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，但它僅適于轉(zhuǎn)化雙子葉植物，對單子葉植物不能普遍適用。病毒載體法是以植物病毒做為載體，將外源DNA導入植物細胞，它嚴格受制于植物病毒的寄主范圍。顯微注射法則利用顯微注射器直接將外源DNA注入細胞內(nèi)，但其操作非常煩瑣，技術(shù)條件要求高，難以推廣。PEG法、電擊法以及脂質(zhì)體介導法雖使植物轉(zhuǎn)化成功的機會增多，但這些方法都以植物原生質(zhì)體為受體，工作量大，成功率低。因為植物原生質(zhì)體再生是一項極為困難的工作，并且許多植物原生質(zhì)體至今難以再生成植株?；驑尫m然以不去壁的植物材料為受體，但它導入受體的DNA量少，實際轉(zhuǎn)化效率不高。國外已有人用激光微束穿刺植物細胞，試圖通過激光孔轉(zhuǎn)化植物細胞，但他們只能造成細胞壁穿孔，而不能保證外源物質(zhì)大量進入細胞內(nèi)，因此收效甚微。
在動物受精卵的轉(zhuǎn)化中，最常用的是顯微注射法，也有人用PEG法、電擊法等，總的來說效率都不高。
我們認為創(chuàng)造一種高效的細胞轉(zhuǎn)化方法對于加速基因工程研究進程具有重要意義。新的轉(zhuǎn)化方法必須滿足兩點要求①對生物細胞造成的損傷小，不影響細胞的生理活性。②能夠使外源物質(zhì)大量進入細胞內(nèi)，以保證有足夠的DNA分子進入細胞核，使目的基因整合到染色體上。
本發(fā)明的原理是用高滲緩沖液浸泡細胞一定時間，使細胞內(nèi)部部分水分外流，然后將細胞轉(zhuǎn)入含有DNA的普通培養(yǎng)液中，以形成細胞滲透壓內(nèi)高外低的梯度。此刻，在用物理方法造成細胞膜穿孔，在細胞滲透壓的作用下，細胞周圍的物質(zhì)就通過這些微孔迅速進入細胞內(nèi)，在很短的時間內(nèi)，細胞穿孔自然閉合。這樣，細胞外環(huán)境中的DNA就大量地進入了被穿孔的細胞。
受體細胞的預處理是本發(fā)明成功的關(guān)鍵。各種植物的滲透壓一般在0.25-0.65mol/L之間。因此，要人工建立起細胞滲透壓內(nèi)高外低的梯度，就必須將細胞浸入比細胞滲透壓高的緩沖液中，這樣才能使細胞內(nèi)水分外流。據(jù)此我們設(shè)計高滲緩沖液濃度在0.5-1.0mol/L之間。根據(jù)不同植物材料，配制相應(yīng)的高滲液，以高滲液濃度與細胞滲透壓之差超過0.05mol/L為準。
配制高滲緩沖液一般采用對細胞無毒的糖醇類分子，如葡萄糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、蔗糖等，其通式為C6H12-14O6或C12H22O11緩沖液采用Tris-鹽酸緩沖液，磷酸緩沖液等，pH5.6-7.5。
植物材料在高滲緩沖液中浸泡的時間，以出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離為準，一般應(yīng)超過20分鐘，最佳浸泡時間范圍為1-5小時。
將高滲緩沖液浸泡過的細胞轉(zhuǎn)入含有外源DNA的普通培養(yǎng)液中，就建立起了細胞滲透壓內(nèi)高外低的梯度，這時應(yīng)盡快用物理方法造成細胞壁穿孔，使細胞周圍溶液迅速進入細胞內(nèi)。造成細胞壁穿孔的方法有激光微束照射、用基因槍加速的金屬微粒、超聲波、高壓電擊等。
以水稻懸浮細胞的轉(zhuǎn)化為例，具體操作方法如下水稻懸浮細胞在繼代3-4天后，轉(zhuǎn)入高滲緩沖液(10mMTris·Cl，pH7.2，0.7M山梨醇)中浸泡3-4小時。在超凈臺上，將高滲液處理過的細胞用80目篩網(wǎng)過濾，取0.1ml過濾后的小細胞團轉(zhuǎn)入1.5mlEppendorf管中，用普通培養(yǎng)液洗一次，立即加入5μgPBI121質(zhì)粒DNA，混勻后將細胞裝進Rose小室進行激光顯微照射。照射裝置為Nd-YAG四倍頻脈沖顯微儀。輸出波長為1060nm、532nm、355nm和266nm，脈寬為10ns。激光器在532nm波長時，輸出能量為10mJ。激光束經(jīng)匹配引入一臺相差顯微鏡，用40X物鏡聚焦于待照射的細胞，光斑直徑為1.3μm。照射時，通過前后左右移動載物臺使激光脈沖在植物細胞團上進行掃描照射，激光照射時間為每樣品60分鐘，約打4000個脈沖。照射后的細胞按常規(guī)方法進行培養(yǎng)、篩選、檢測及再生。
本發(fā)明具有的優(yōu)點和應(yīng)用范圍滲透壓梯度加膜穿孔轉(zhuǎn)化方法是一套簡便，高效的轉(zhuǎn)化方法。因為它能保證外源物質(zhì)大量進入細胞，同時使受體細胞所遭受的損傷減至最小，轉(zhuǎn)化后的細胞能保存其正常的生理狀態(tài)。
本方法以細胞滲透理論作為基礎(chǔ)，因此具有維持細胞滲透壓功能的植物細胞和組織、動物細胞與受精卵，甚至微生物細胞均可用本方法進行外源基因?qū)?。從理論上講，本方法可將任何經(jīng)分子克隆手段得到的基因?qū)肴魏位畹纳锛毎?。因此本方法可適用于許多方面①將農(nóng)藝性狀優(yōu)良的基因?qū)胱魑锛毎嘤鲂碌淖魑镄缕贩N。②將產(chǎn)生某種生物藥品的基因?qū)雱游锘蛑参锛毎?，然后通過組織培養(yǎng)法生產(chǎn)藥品。③將優(yōu)良性狀基因?qū)雱游锸芫?，培育出動物新品種。④在基因治療時，可先用本方法將目的基因?qū)肴祟惣毎Y選出整合細胞后再將后者植入患者體內(nèi)，就可達到治療目的。
權(quán)利要求
1.一種將外源物質(zhì)導入活細胞的方法，其特征是將細胞在高滲緩沖液中浸泡20分鐘以上，最佳時間為1--5小時，然后將該細胞轉(zhuǎn)入含有外源物質(zhì)的普通培養(yǎng)液，盡快使用物理方法使細胞壁穿孔，外源物質(zhì)就大量進入細胞內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征是配制高滲緩沖液使用對細胞無毒的糖醇類分子，通式為C8H12-14O6或C12H22O11，采用Tris-鹽酸緩沖液或磷酸緩沖液，pH5.6-7.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是糖醇類分子，最好使用葡萄糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、蔗糖等。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是預導入活細胞的外源物質(zhì)主要指通過分子克隆手段分離得到的各種基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所說物理方法是激光微束照射，用基因槍加速的金屬微粒，超聲波，高壓電擊法。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是激光微束照射輸出波長為1060nm、532nm、355nm和266nm，脈寬10ns，激光在532nm時輸出能量為10mJ。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。用高滲緩沖液浸泡細胞，使細胞內(nèi)部部分水分外流，然后將細胞轉(zhuǎn)入含有外源物質(zhì)的普通培養(yǎng)液中，以形成細胞滲透壓內(nèi)高外低的梯度，用物理方法造成細胞膜穿孔，外源物質(zhì)就大量進入細胞。用本方法可以改良動植物的遺傳特性，生產(chǎn)生物藥品以及對疾病進行治療。
文檔編號C12N15/63GK1078261SQ92103259
公開日1993年11月10日 申請日期1992年5月7日 優(yōu)先權(quán)日1992年5月7日
發(fā)明者郭延德, 王蘭嵐, 宋桂英, 徐正平, 張健, 田文忠 申請人:中國科學院遺傳研究所