專利名稱:一種基于活細(xì)胞矩陣技術(shù)的物質(zhì)毒性的確定方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于快速確定物質(zhì)毒性和其致毒機(jī)理的新方法,更具體的說(shuō)是一種用于純化合物或復(fù)雜環(huán)境介質(zhì)樣品的毒性預(yù)測(cè)致毒機(jī)理的高通量篩選方法。
背景技術(shù):
關(guān)于從分子水平研究化合物致毒機(jī)理的研究,目前已經(jīng)被大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的致毒機(jī)理有一氧化碳與血紅蛋白的緊密結(jié)合,使其失去輸氧能力而致毒;汞等重金屬毒物會(huì)與酶活性中心的巰基結(jié)合,抑制酶的活性而致毒。還有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,一些環(huán)境有毒污染物的致癌、致畸和致突變作用與它們能改變或損傷機(jī)體的DNA的結(jié)構(gòu)和相應(yīng)功能有密切關(guān)系。例如亞硝胺改變DNA的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄功能,會(huì)造成染色體的突變而致癌;多環(huán)芳烴、芳香胺和芳香族偶氮化合物由于會(huì)引起DNA損傷,使細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖失控,從而形成腫瘤。然而,從宏觀上全方位的評(píng)價(jià)一個(gè)化合物或環(huán)境毒物的致毒機(jī)理,僅僅掌握這些信息是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的?!ご竽c埃希氏菌,又稱大腸桿菌,作為一種通常用來(lái)揭示某種具有某種普遍規(guī)律的生命現(xiàn)象的模式生物,有研究者繪制其體內(nèi)的染色體藍(lán)圖,并對(duì)其體內(nèi)大部分基因的功能進(jìn)行了推斷和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,這就為基于毒理生物個(gè)體從宏觀上對(duì)環(huán)境毒物的致毒機(jī)理進(jìn)行判斷提供了一種可能。隨后,在Nature Method有文章刊出,Alon Zaslaver等人進(jìn)一步對(duì)大腸桿菌體內(nèi)2000多個(gè)不同的、涵蓋大部分基因的啟動(dòng)子進(jìn)行標(biāo)記,每一個(gè)啟動(dòng)子均由低拷貝質(zhì)粒表達(dá)而來(lái),這就使得大腸桿菌體內(nèi)聞精度基因表達(dá)數(shù)據(jù)的獲得提供一個(gè)便利的手段。目前,采用該技術(shù)相關(guān)研究報(bào)道,大多數(shù)僅限于某種或者某一類具有特定功能的基因。通過(guò)檢索發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)沒(méi)有關(guān)于采用全基因組對(duì)環(huán)境毒物進(jìn)行毒性的確定和致毒機(jī)理評(píng)價(jià)的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
I.發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有的對(duì)環(huán)境毒物進(jìn)行毒性的確定方法的完整性和準(zhǔn)確度的缺乏,本發(fā)明提供一種基于大腸桿菌全基因組活細(xì)胞芯片技術(shù)的評(píng)價(jià)方法,通過(guò)本發(fā)明可以對(duì)環(huán)境毒物的細(xì)胞毒性和致毒機(jī)理進(jìn)行高通量測(cè)試全基因組測(cè)試。2.技術(shù)方案
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種基于高通量篩選技術(shù)和大腸桿菌全基因組的環(huán)境毒物致毒機(jī)理評(píng)價(jià)方法,其包括以下步驟
(1)首先,測(cè)試環(huán)境毒物對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用,在96孔板內(nèi)接種相同密度的大腸桿菌,當(dāng)細(xì)菌吸光度0D600值達(dá)到O. I時(shí),根據(jù)細(xì)菌對(duì)環(huán)境毒物的耐受性,加入具有一定劑量的環(huán)境毒物,并繪制S型曲線,求算環(huán)境毒物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制的EC20 ;
(2)取出凍存于-80攝氏度的存有大腸桿菌的96孔板母板(共21塊,大腸桿菌基因庫(kù)購(gòu)自Thermo Scientific公司),在室溫下放置至其融化,迅速用復(fù)制觸角將其轉(zhuǎn)移復(fù)制入一塊裝有新鮮培養(yǎng)基的96孔板新板,培養(yǎng)細(xì)菌約3個(gè)小時(shí),將其分裝入384孔板,此時(shí),板孔內(nèi)吸光度0D600應(yīng)該在O. I左右;
(3)選擇O、O.01*EC20、0. 1*EC20和EC20作為4個(gè)測(cè)試濃度,在384孔板內(nèi)快速加入受
試環(huán)境毒物;
(4)將加過(guò)受試化合物的384孔板放入酶標(biāo)儀,記錄其熒光讀數(shù)在4個(gè)小時(shí)內(nèi)的變化情況。本發(fā)明步驟(I)中的96孔板,由Corning (NY, USA)公司提供,貨號(hào)CLS3599。步驟(2)中的384孔板由NUNC (NY, USA)公司提供,貨號(hào)142761。步驟(3)中酶標(biāo)儀由BioTek (Winooski, VT)公司提供。
有益效果
本發(fā)明基于高通量篩選技術(shù),采用熒光標(biāo)記的大腸桿菌作為模式生物,提供了一種涵蓋大腸桿菌體內(nèi)大部分基因的環(huán)境毒物致毒機(jī)理評(píng)價(jià)方法。它一方面具有基因芯片技術(shù)的研究效果,為研究者提供高品質(zhì)的基因表達(dá)數(shù)據(jù);同時(shí)該技術(shù)更快捷、簡(jiǎn)便,無(wú)需復(fù)雜的前處理過(guò)程;并且,該技術(shù)具有很高的可重復(fù)性;成本低,可以最大程度的避免人為操作誤差或干擾。同時(shí),該技術(shù)在污染毒物篩選中,不僅可以考慮到化合物的可利用性,同時(shí)可以兼顧多化合物的復(fù)合毒性,以便可以對(duì)生物樣品的潛在毒性有一個(gè)更加全面的分析;它采用更敏感的基因表達(dá)變化作為指標(biāo),它結(jié)束了許久以來(lái)僅僅依靠細(xì)菌生長(zhǎng)抑制、生存這些簡(jiǎn)單生理指標(biāo)來(lái)判斷化合物毒性的現(xiàn)狀;它所標(biāo)記的每一個(gè)菌種所標(biāo)記的基因均代表一種致毒通道,這對(duì)于判斷化合物的致毒機(jī)理提供了大量的信息。盡管該技術(shù)可以給實(shí)驗(yàn)者提供大量的基因變化信息從而判斷化合物的生物毒性和致毒機(jī)理,然而,它并不需要高超的操作技能,只需要一般生物實(shí)驗(yàn)室所具有的操作平臺(tái)。因此,具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明 實(shí)施例I:
采用整體稀釋的方法,在96孔板內(nèi)種入具有相同細(xì)菌密度的培養(yǎng)基,放入37攝氏度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約3小時(shí),此時(shí)細(xì)菌的吸光度0D600值大約為O. I。配制濃度為2000 mg/mL的6-H0-BDE-47母液,并逐級(jí)稀釋,將其加入培養(yǎng)好的96孔板內(nèi),保證板內(nèi)6-H0-BDE-47的濃度梯度為 210、100、25、6· 4,1. 6,0. 39,0. 098,0. 024 和 O. 006 mg/mL(n=3)。在 37 攝氏度下繼續(xù)培養(yǎng)4個(gè)小時(shí),再次測(cè)定其吸光度值,觀察不同濃度下細(xì)胞受抑制的情況,最終確定其半效應(yīng)濃度 EC50 為 22. 52 ±2. 20 mg/L。實(shí)施例2
采用整體稀釋的方法,在96孔板內(nèi)種入具有相同細(xì)菌密度的培養(yǎng)基,放入37攝氏度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約3小時(shí),此時(shí)細(xì)菌的吸光度0D600值大約為O. I。配制濃度為2000 mg/mL的6-H0-BDE-47母液,并逐級(jí)稀釋,將其加入培養(yǎng)好的96孔板內(nèi),保證板內(nèi)6-H0-BDE-47的濃度梯度為 210、100、25、6· 4,1. 6,0. 39,0. 098,0. 024 和 O. 006 mg/mL(n=3)。在 37 攝氏度下繼續(xù)培養(yǎng)3個(gè)小時(shí)后,每一孔內(nèi)加入10微升對(duì)細(xì)菌無(wú)毒性的阿爾馬蘭(Beijing CellChipBiotechnology Inc.,Beijing, BJ),繼續(xù)培養(yǎng)I個(gè)小時(shí),測(cè)定其熒光值(發(fā)射光/吸收光545nm/590nm),最終確定其半效應(yīng)濃度EC50為12. 13土 L 12 mg/L。實(shí)施例3:
細(xì)胞毒性是由細(xì)胞或者化學(xué)物質(zhì)引起的單純的細(xì)胞殺傷事件,不依賴于凋亡或壞死的細(xì)胞死亡機(jī)理,同時(shí)它也反應(yīng)了三種結(jié)構(gòu)不同的化合物對(duì)生物體的作用模式差異。將大腸桿菌暴露于三種化合物4小時(shí)后,觀察其對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制情況,結(jié)果顯示,在測(cè)試濃度下,BDE-47和6-Me0-BDE-47對(duì)大腸桿菌并無(wú)明顯的抑制作用,然而6-H0-BDE-47卻可以強(qiáng)烈抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。這也從一定程度上證實(shí)了三種化合物由于結(jié)構(gòu)官能團(tuán)的不同,對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生的毒性差異。同時(shí),為了選取一個(gè)更為敏感的細(xì)胞活力判定指標(biāo),我們還嘗試同時(shí)采用測(cè)定吸光度和阿爾馬蘭檢測(cè)來(lái)判定大腸桿菌活力,兩種情況下,算的其EC50值分別為22.52 土 2. 20和12. 13 土 1.12 mg/L,說(shuō)明在吸光度表現(xiàn)出下降趨勢(shì)前,細(xì)胞的生長(zhǎng)已經(jīng)開(kāi)始受到抑制,同時(shí)也說(shuō)明了阿爾馬蘭是一種更為敏感的大腸桿菌活力判定指標(biāo)。實(shí)施例4:
從-80攝氏度冰箱中取出熒光標(biāo)記的大腸桿菌母板,在室溫下放置約半個(gè)小時(shí)待溶解,然后將其中的菌株一一對(duì)應(yīng)地轉(zhuǎn)新鮮的裝有300微升LBX I培養(yǎng)基的96孔板中,在37攝氏度下培養(yǎng)約3個(gè)小時(shí),此時(shí)細(xì)菌的吸光度0D600值約為O. 1,將其轉(zhuǎn)入384孔板中,這里,96孔板每個(gè)孔對(duì)應(yīng)384孔板上的4個(gè)孔,384孔板每個(gè)孔的菌液濃度為72微升。將用DMSO配制好的6-H0-BDE-47,按1/20的比例加入384孔板內(nèi),共4個(gè)濃度梯度,最終暴露濃度分別為9、0. 9、0. 09和O mg/L,加液體積為3. 75微升。加入化合物后,將384孔板放入酶標(biāo)儀,測(cè)定大腸桿菌受6-H0-BDE-47暴露后的基因表達(dá)變化。共計(jì)21塊大腸桿菌母板。實(shí)施例5:
暴露于6-H0-BDE-47后,大腸桿菌的基因表達(dá)同時(shí)表現(xiàn)出了時(shí)間依存性(time-dependent)和濃度依存性(concentration-dependent)。6-H0-BDE-47 所引起的基因下調(diào)數(shù)量要明顯多于上調(diào)基因的數(shù)量,采用2. O作為基因異常倍數(shù)表達(dá)閾值,一共有65個(gè)基因被判定為異常表達(dá),其中11個(gè)基因被上調(diào),54個(gè)基因被下調(diào);采用I. 5作為基因異常表達(dá)倍數(shù)判定閾值,一共129個(gè)基因被判定為異常表達(dá),其中有97個(gè)基因呈現(xiàn)為下調(diào)趨勢(shì),32個(gè)基因表現(xiàn)為上調(diào)趨勢(shì)。采用2. O作為基因異常表達(dá)倍數(shù)判定閾值,暴露于O. 09,0. 9和9mg/L的6-H0-BDE-47后,分別有11、17和60基因出現(xiàn)了異常表達(dá)的情況。若采用2. O作為基因異常表達(dá)判定閾值,暴露于三個(gè)濃度后,分別有40、55和116基因有異常表達(dá)的情況,其中有24個(gè)基因?qū)θ齻€(gè)濃度均有異常表達(dá)的現(xiàn)象。同時(shí),有三個(gè)基因(yccF ygbA yddM)在6-H0-BDE-47濃度為O. 09mg/L時(shí)有異常表達(dá),然后當(dāng)其暴露濃度提升至O. 9和9mg/L時(shí),并未出現(xiàn)異常表達(dá),這也顯現(xiàn)了其濃度依存性?;谶@些異常表達(dá)的基因,6-H0-BDE-47的NOTEC和TEC50值分別被計(jì)算為O. 0438和O. 580mg/L,這兩個(gè)基于基因水平的判定終點(diǎn)指標(biāo)要比傳統(tǒng)的EC50分別敏感了 274和21倍。實(shí)施例6:
基于這些異常表達(dá)的基因,6-H0-BDE-47的NOTEC和TEC50值分別被計(jì)算為O. 0438和
O.580mg/L,這兩個(gè)基于基因水平的判定終點(diǎn)指標(biāo)要比傳統(tǒng)的EC50分別敏感了 274和21倍。同時(shí),這里也驗(yàn)證了,NOTEC作為一個(gè)新出現(xiàn)的化合物毒性評(píng)價(jià)終點(diǎn)判定指標(biāo),它反映了生物的亞致死和分子水平的一些特征,相比傳中的毒性判定終點(diǎn)指標(biāo),它更敏感。實(shí)施例7:基于 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù),metabolicpathway>phosphoenolpyruvate (PEP)-dependent phosphotransferase system (PTS)和aminoacyl-tRNAs被判定為最可能被6-H0=BDE_47干擾的通路。采用2. O作為基因異常表達(dá)倍數(shù)閾值,所篩選出來(lái)的基因中有十個(gè)屬于metabolie pathway通路,其中fdhF和katG呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì),ofct/ dgkA IacZ IpxC manX moaA pepD則表現(xiàn)出了下調(diào)的趨勢(shì)。通常來(lái)說(shuō),代謝反應(yīng)是指生物體內(nèi)的物質(zhì)利用一系列的酶最終轉(zhuǎn)化為另一類物質(zhì)的過(guò)程。6-H0-BDE-47表現(xiàn)出了對(duì)代謝通路的破壞性,這與文獻(xiàn)報(bào)道中6-H0-BDE-47難以代謝轉(zhuǎn)化的事實(shí)相符。phosphoeno lpyruvate (PEP)-dependent phosphotransferase system (PTS)的通路則與微生物攝取碳源的過(guò)程息息相關(guān),尤其是己糖、己糖醇和二糖。暴露于6-H0-BDE-47后,一些與PTS相關(guān)的基因(jmnX, srlA,treB)出現(xiàn)了下調(diào)的情況。氨基?;?tRNAs則是可能被6-H0-BDE-47調(diào)控的另一條通路,它在氨基酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯中起著至關(guān)重要的作用,其中有三個(gè)基因在暴露于6-H0-BDE-47后的下調(diào)倍數(shù)超過(guò)了 2,包括ileX, 和serlh這些基因的下調(diào),將造成氨基酸向核糖體轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的阻斷。環(huán)境脅迫基因,是一類當(dāng)細(xì)胞受到外來(lái)壓力就開(kāi)始異常表達(dá)的廣譜性基因,當(dāng)閾值設(shè)定為2. O時(shí),4個(gè)脅迫基因被判定為異常表達(dá),分別為 bolA、katG、ybgl 和 yhjX,他們分別與 general stress, redox stress,general function 和 drug resistance/sensitivity 有關(guān)。·
權(quán)利要求
1.一種基于活細(xì)胞矩陣技術(shù)的物質(zhì)毒性的確定方法,包括以下步驟 (1)首先,測(cè)試環(huán)境毒物對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用,在培養(yǎng)管或微孔板內(nèi)接種相同密度的大腸桿菌,當(dāng)細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),根據(jù)細(xì)菌對(duì)環(huán)境毒物的耐受性,加入稀釋濃度的化合物、混合物、環(huán)境樣品的提取物或餾分并繪制S型曲線,求算環(huán)境毒物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制的 EC20 ; (2)取出凍存于-80攝氏度的存有大腸桿菌的培養(yǎng)管或微孔板,在室溫下放置至其融化,迅速用復(fù)制觸角將其轉(zhuǎn)移復(fù)制入一塊裝有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)管或微孔板,培養(yǎng)細(xì)菌3個(gè)小時(shí),此時(shí),細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,將其分裝入多孔微孔板; (3)選擇一個(gè)或多個(gè)測(cè)試濃度,在培養(yǎng)管或微孔板內(nèi)快速加入受試環(huán)境毒物; (4)將加過(guò)受試化合物的培養(yǎng)管或微孔板放入酶標(biāo)儀,記錄報(bào)告基因信號(hào)在此后隨時(shí)間變化的情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于活細(xì)胞矩陣技術(shù)的物質(zhì)毒性的確定方法,其特征在于細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為當(dāng)細(xì)菌吸光度OD600值達(dá)到O. I時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種基于活細(xì)胞矩陣技術(shù)的物質(zhì)毒性的確定方法,其特征在于步驟(3)中0,0. 01*EC20、0. 1*EC20和EC20作為4個(gè)測(cè)試濃度。
全文摘要
一種基于活細(xì)胞矩陣技術(shù)的物質(zhì)毒性的確定方法,屬于物質(zhì)毒性的確定方法。其步驟為首先,測(cè)試環(huán)境毒物對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用,求算環(huán)境毒物對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制的EC20;取出凍存有大腸桿菌的培養(yǎng)管或微孔板,融化,迅速轉(zhuǎn)移復(fù)制入一塊裝有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)管或微孔板,培養(yǎng)細(xì)菌3個(gè)小時(shí),將其分裝入多孔微孔板;選擇一個(gè)或多個(gè)測(cè)試濃度,在培養(yǎng)管或微孔板內(nèi)快速加入受試環(huán)境毒物;將加過(guò)受試化合物的培養(yǎng)管或微孔板放入酶標(biāo)儀,記錄報(bào)告基因信號(hào)在此后隨時(shí)間變化的情況。本發(fā)明可以提供高品質(zhì)的基因表達(dá)數(shù)據(jù);同時(shí)更快捷、簡(jiǎn)便,無(wú)需復(fù)雜的前處理過(guò)程;并且,具有很高的可重復(fù)性;成本低,可以最大程度的避免人為操作誤差或干擾。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102925532SQ201210372540
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者張效偉, 蘇冠勇, 夏潔, 于紅霞 申請(qǐng)人:南京大學(xué)