專利名稱：一種向植物葉片注入外源物的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種向植物葉片注入外源物的方法，具體而言是一種通過在多微孔軟 塑料載體的微孔內形成正負壓，高效、簡便和微損傷地向植物葉片注入小分子成分，或蛋白 質，或核酸，或質粒，或病毒，或細菌，或真菌等外源物的方法。本發(fā)明屬于農業(yè)及生物技術 領域。
背景技術：
植物生長發(fā)育過程往往會受到外源物侵入的影響。人為地將小分子成分、或蛋白 質、或核酸、或質粒、病毒、細菌、真菌等外源物引入到植物葉片中，這是研究和利用這些外 源物功能特征的先決條件。但是由于植物葉片本身的結構特點，采用常規(guī)的噴施、浸泡、涂 抹等方法很難有效地將一些外源物，特別是大分子外源物轉入葉片組織中；同時由于植物 葉片幼嫩，葉片薄，可接觸面積小等原因，現(xiàn)有的外源物注入方法，如機械損傷涂抹法(中 國專利申請?zhí)?200810233643. 5)、針刺注入法(中國專利申請?zhí)?200910025033. 0)、基因 槍注入法等，均存在不同程度的效率低下、操作繁瑣、傷害植物等問題。已有的文獻(鄧恩 新，王文忠，王智圻.一種簡易的向植物薄葉片內注入溶液的裝置.植物生理學通訊，1992， 28 296.)曾報道利用注射器、舌鉗和橡膠墊圈等工具，借助壓力將液體樣品通過氣孔壓入 葉片內，但這類方法極易對注射孔四周的葉片組織造成損傷，且單純施加正壓難以有效地 將外源物送入葉片細胞間隙或細胞內。因此，極有必要建立高效和簡便的向植物葉片注入 外源物的技術方法，用于研究及利用這些外源物在植物葉片中的功能特征。采用含有外源物液體的多微孔軟塑料載體及注入裝置，均勻地對葉片施加正壓和 負壓，可最大限度地減少對葉片的機械損傷，更有效地將外源物送入葉片內。與本發(fā)明有關 的注入裝置制作簡單方便，外源物的檢測方法極易從相關科學書籍和文獻中獲得，用于本 發(fā)明的不同規(guī)格的具有回彈特性的多微孔軟載體也極易從相關市場獲得或實驗室自己加 工制備。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，結合植物葉片的特點，采用具有回彈特性的多 微孔軟聚氯乙烯等軟塑料載體的正負壓注入法(Positive and NegativePressure Introduction by Using Soft Polyvinyl Chloride withMulti-Micro—Tubules, PNPi-SPCT，PNPi)，實現(xiàn)了高效、簡便和微損傷地向植物葉片注入外源物的目標。因此，本發(fā)明提供了一種高效、簡便、微損傷的向植物葉片注入外源物的方法。步 驟包括(1)根據外源物和葉片的種類和特性，選擇具有一定體積、軟硬程度的具有回彈 特性的多微孔軟塑料載體，一般采用軟聚氯乙烯載體，其外表應光滑無孔，內部微孔孔徑約 1-100微米；(2)制備不同形狀和特點的用于固定多微孔軟塑載體的注入裝置；
(3)將多微孔軟塑料載體固定到注入裝置上；(4)將外源物吸附到具有彈性的多微孔軟塑料載體中；(5)將含外源物液體的多微孔軟塑料載體的微孔開口面緊貼植物葉片表面；(6)根據外源物和葉片的種類和特性，用一定的頻率和力度擠壓注入裝置，通過擠 壓在多微孔軟塑料載體的微孔內形成正負壓，將含有外源物的液體注入葉片中。在一個實施方案中，步驟1中的多微孔軟塑料載體可以直接從市場購買，也可以 自己根據化學合成步驟合成，或根據實際需求向塑料制造商定制。在另一個實施方案中，步驟2中的注入裝置根據需要可以在鑷式簡易注入裝置、 剪式簡易注入裝置和帶護管的鑷型注入裝置三種不同特點的注入裝置中進行選擇。在另一個實施方案中，植物材料可以是小麥葉片，水稻葉片，玉米葉片，大豆葉片， 煙草葉片等。在另一個實施方案中，可以用注入器將外源物吸附到多微孔的軟塑料載體中，優(yōu) 選用移液器。在另一個實施方案中，擠壓頻率、擠壓次數和擠壓時間可以根據葉片的韌度和幼 嫩程度進行調整。


圖1:鑷式簡易注入裝置1-多微孔軟塑料載體；2-硬塑料板；3-固定螺絲；4-鑷片；圖2:剪式簡易注入裝置1-多微孔軟塑料載體；2-硬塑料板；3-固定螺絲；4-薄鋼板；5-連接軸；6-手持把；圖3 帶護套的鑷式注入裝置的制作(一)1-活塞；2-護套；3-多微孔軟塑料載體；4-橡皮帶；5-固定栓；6-支持板；7-螺栓；8-角度墊片；9-固定夾卡；10-角度墊片；11-螺母；12-螺孔；13-鑷片；14-螺栓滑槽；圖4 帶護套的鑷式注入裝置的制作(二)1-活塞；2-護套；3-多微孔軟塑料載體；4-橡皮帶；5-固定栓；6-支持板；7-螺栓；8-螺母；9-固定夾卡；10-墊片；11_螺孔；12-鑷板；13-螺栓滑槽；14-連接螺絲；
具體實施例方式下面，本發(fā)明將實施例進行進一步說明，但是它不限于這些實施例的任一個或類 似實例。實施例1 鑷式簡易注入裝置的制作取一條2mm厚，寬20mm，長360mm的薄鋼板，用管鉗在中間彎曲成30度，形成鑷形， 并且兩端彎曲一定的鈍角，使兩端平行。兩端分別用螺絲固定150x150mm方形硬塑料板，并 將多微孔軟塑料載體固定在硬塑料板上。通過用手使用一定的頻率、力度擠壓鋼板中央，將 外源物從微孔軟塑料載體中注入到小麥葉片中。如附圖1。
實施例2 剪式簡易注入裝置的制作分別取兩塊2mm厚，寬20mm，長180mm的薄鋼板，在鋼板中央用連接軸將兩塊鋼板 連接，兩鋼板可以在一定的角度內活動。每鋼板兩端彎曲一定的鈍角，使兩端平行。一端分 別用螺絲固定150x150mm方形硬塑料板，并將多微孔軟塑料載體固定在硬塑料板上。通過 用手使用一定的頻率、力度擠壓另一端的手持把將外源物從微孔軟塑料載體中注入到小麥 葉片中。如附圖2。實施例3 帶護套的鑷式注入裝置的制作取兩塊2mm厚，寬20mm，長180mm的薄鋼板，用管鉗將鋼板兩端彎曲成鈍角，并且平 行，形成一副鑷片。鑷片的一端切割成弧形，并且做一個寬3mm，長20mm的螺栓滑槽。另取 兩塊2mm厚，寬20mm，長160mm的薄鋼板，一端彎曲成比鑷片小一些鈍角，另一端切割成30 度角的楔形槽，并連接一條橡皮帶，將護管固定在楔形槽內。將圓形的微孔軟塑料載體放在 護管內，用活塞輕輕的接觸到微孔軟塑料載體，用螺絲將表面光滑的活塞連接到鑷片上，然 后用長螺母將四片鋼板連接固定。用三叉狀的固定夾卡在護套支板上，調節(jié)固定夾的上下 位置使護管貼在葉片的兩側。用手使用一定的頻率，力度擠壓鑷片，通過活塞擠壓多微孔軟 塑料載體將外源物注入到葉片內。如附圖3。實施例4 帶護套的鑷式注入裝置的制作取兩塊2mm厚，寬20mm，長180mm的薄鋼板，用管鉗將鋼板一端彎曲成鈍角，形成 一副鑷片。鑷片的一端切割成弧形，并且做一個寬3mm，長20mm的螺栓滑槽。另取兩塊2mm 厚，寬20mm，長160mm的薄鋼板，一端彎曲成比鑷片小一些鈍角，另一端切割成30度角的楔 形槽，并連接一條橡皮帶，將護管固定在楔形槽內。將圓形的微孔軟塑料載體放在護管內， 用活塞輕輕的接觸到微孔軟塑料載體，用螺絲將表面光滑的活塞連接到鑷片上，然后用長 螺母將四片鋼板連接固定，并通過中間角度不同的墊片使兩副鋼板形成不同的角度。用三 叉狀的固定夾卡在護套支板上，調節(jié)固定夾的上下位置使護管貼在葉片的兩側。用手使用 一定的頻率，力度擠壓鑷片，通過活塞擠壓多微孔軟塑料載體將外源物注入到葉片內。如附 圖4。實施例5 利用簡易注入器向小麥葉片注入高鹽用去離子水配制0. 5M、IM的NaCl的高鹽溶液，用0. 45um的濾膜過濾除熱源，置4 度冰箱備用。所用的材料是小麥Taichimg^，小麥種子經浸種、催芽后種于口徑IOcm花盆 中，至于室溫(溫度晝15 18°C /夜11 14°C，光照強度6000Lx，光照時間14h)，當幼 苗長至1葉期作為實驗植物材料。分別用移液器把0. 5ml的去離子水和0. 5M、1M的NaCl 的高鹽溶液吸附到具有彈性的多微孔軟塑料的微孔載體中，將微孔載體放置在小麥葉片兩 側，用帶無粉乳膠手套以每分鐘30次擠壓多微孔軟塑料的微孔載體，力度以不損傷葉片為 宜。注入操作完成后，注入對照去離子水的小麥葉片無彎曲，注入0. 5M的NaCl高鹽溶液的 小麥葉片微彎曲，注入IM的NaCl高鹽溶液的小麥葉片彎曲度最大。放置M小時后，觀察 三盆不同處理的小麥葉片恢復到處理前。結果表明NaCl已經成功注入到小麥葉片內。實施例6 利用鑷型注入器向小麥葉片注入異硫氰酸熒光素用去離子水配制0. 的異硫氰酸熒光素(FITC)溶液，用0. 45um的濾膜過濾除 熱源和未溶解的熒光素鈉顆粒，置4度冰箱備用。所用的材料是小麥TaiChimg29，小麥種 子經浸種、催芽后種于口徑IOcm花盆中，至于室溫(溫度晝15 18°C /夜11 14°C，光照強度6000Lx，光照時間14h)，當幼苗長至1葉期作為實驗植物材料。分別用移液器把去 0. 5ml離子水和0. 的異硫氰酸熒光素溶液吸附到具有彈性的多微孔軟塑料的微孔載體 中，將微孔載體固定在硬塑料支持板上，通過捏片擠壓微孔載體，這樣可以防止污染物的干 擾。操作一向小麥葉片注入去離子水時用每分鐘30次的頻率擠壓多微孔軟塑料的微孔載 體，擠壓30秒，擠壓力度以不損傷葉片為宜，然后用去離子水沖洗小麥葉片；操作二 向小 麥葉片注入0. 的異硫氰酸熒光素溶液時用每分鐘30次的頻率擠壓多微孔軟塑料的微 孔載體，擠壓30秒，擠壓力度以不損傷葉片為宜，然后用去離子水沖洗小麥葉片；操作三 將含有0. 的異硫氰酸熒光素溶液的微孔載體輕輕貼附在小麥葉片兩側一定時間，然后 用去離子水沖洗小麥葉片。注入操作完成后，冷凍切片后，用共聚焦熒光顯微鏡在吸收光波 長為495nm，發(fā)散光波長為525nm觀察小麥葉片。觀察結果是操作一處理的小麥葉片中無熒 光點，操作二處理的小麥葉片有大量的熒光點，操作三處理的小麥葉片無熒光點。結果表明 異硫氰酸熒光素成功注入到小麥葉片內。實施例7 利用帶護管的鑷型注入器向小麥葉片注入紅色熒光蛋白用去5mM的PBS緩沖液(pH = 7. 2)配制濃度為lmg/ml的Dsred紅色熒光蛋白的 溶液，用0. 45um的濾膜過濾除熱源，置4度冰箱備用。所用的材料是小麥TaiChimg29，小麥 種子經浸種、催芽后種于口徑IOcm花盆中，至于室溫(溫度晝15 18°C /夜11 14°C， 光照強度6000Lx，光照時間14h)，當幼苗長至1葉期作為實驗植物材料。分別用移液器把 0. 5mlPBS緩沖液和lmg/ml的紅色熒光蛋白的蛋白溶液吸附到具有彈性的多微孔軟塑料的 微孔載體中，用鑷子將微孔載體輕輕放置在護管內(在放置過程中保證載體中的液體不被 擠出)。用角度固定夾輕輕的將護管固定在小麥葉片的兩側，然后用手通過鑷片以每分鐘 25次的頻率擠壓微孔載體，擠壓30秒，力度以不損傷小麥葉片為宜。操作完成后，冷凍切 片，用共聚焦顯微鏡在吸收光波長563nm，發(fā)散光波長582nm檢測觀察。觀察結果注入PBS 緩沖液的小麥葉片中無熒光點，注入紅色熒光蛋白的小麥葉片中含有大量的熒光點。結果 表明紅色熒光蛋白成功注入到小麥葉片內。實施例8 利用帶護管的鑷型注入器向小麥葉片注入可以表達紅色熒光蛋白的大 腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)攜有紅色熒光蛋白基因的大腸桿菌至對數期，用無菌的LB培養(yǎng) 基帶護套的鑷式注入裝置清洗菌體并制成濃度為lxl05CFU/ml菌液。所用的材料是小麥 Taichung29,小麥種子經浸種、催芽后種于口徑IOcm花盆中，至于室溫(溫度晝15 18°C / 夜11 14°C，光照強度6000Lx，光照時間14h)，當幼苗長至1葉期作為實驗植物材料。分 別用移液器把0. 5ml無菌的LB培養(yǎng)基和含有攜帶紅色熒光蛋白基因的大腸桿菌的菌液吸 附到具有彈性的多微孔軟塑料的微孔載體中，用鑷子將微孔載體輕輕放置在護管內(在放 置過程中保證載體中的液體不被擠出)。用角度固定夾輕輕的將護管固定在小麥葉片的兩 側，然后用手通過鑷片以每分鐘20次的頻率擠壓微孔載體，擠壓60秒，力度以不損傷小麥 葉片為宜。操作完成后，冷凍切片，用共聚焦顯微鏡在吸收光波長563nm，發(fā)散光波長582nm 檢測觀察。鏡檢后發(fā)現(xiàn)注入無菌LB培養(yǎng)基的小麥葉片無熒光點，注入攜帶紅色熒光蛋白基 因的大腸桿菌的LB培養(yǎng)基的小麥葉片有大量的熒光點。結果表明大腸桿菌已經轉入到小 麥葉片中，并且表達了紅色熒光蛋白。實施例9 利用帶護管的鑷型注入器向煙草葉片注入煙草花葉病毒[ 0048] 分別取已經感染和未感染煙草花葉病毒的煙草葉片擠壓榨取液汁，并用無菌的去 離子水稀釋病毒至lOug/mL備用。將易感病的煙草在溫室中培養(yǎng)到5片的心葉期，選取健 康、生長旺盛葉片作為實驗材料。分別用移液器把0. 5ml未感染煙草花葉病毒葉片液汁和 已感染煙草花葉病毒的葉片液汁吸附到具有彈性的多微孔軟塑料的微孔載體中，用鑷子將 微孔載體輕輕放置在護管內(在放置過程中保證載體中的液體不被擠出)。用角度固定夾 輕輕的將護管固定在煙草葉片的兩側，然后用手通過鑷片以每分鐘30次的頻率擠壓微孔 載體，擠壓60秒，力度以不損傷小麥葉片為宜。置溫室7天后觀察，注入未感染煙草花葉 病毒葉片液汁的煙草葉片沒有感染病毒，注入已感染煙草花葉病毒的葉片液汁的煙草葉片 開始是脈明，隨培養(yǎng)時間的延長形成淺綠病斑，葉緣向背面卷曲最后葉片厚薄不勻，皺縮扭 曲，呈畸形，并有不規(guī)則的缺刻。結果表明注入已感染煙草花葉病毒的葉片液汁的煙草葉片 以被煙草花葉病毒感染，證明通過該方法成功的將煙草花葉病毒注入到煙草葉片中。
權利要求
1.一種向植物葉片注入外源物的方法，包括1)根據外源物和葉片的種類和特性，選擇具有一定體積、軟硬程度的具有回彈特性的 多微孔軟塑料載體，一般采用軟聚氯乙烯載體，其外表應光滑無孔，內部微孔孔徑約1-100 微米；..2)制備不同形狀和特點的用于固定多微孔軟塑 載體的注入裝置；3)將多微孔軟塑料載體固定到注入裝置上；4)將外源物吸附到具有彈性的多微孔軟塑料載體中；5)將含外源物液體的多微孔軟塑料載體的微孔開口面緊貼植物葉片表面；6)根據外源物和葉片的種類和特性，用一定的頻率和力度擠壓注入裝置，通過擠壓在 多微孔軟塑料載體的微孔內形成正負壓，將含有外源物的液體注入葉片中。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于根據外源物和葉片的種類和特性，選擇具 有不同回彈特性軟塑料載體，載體體積、載體軟硬程度以及載體微孔孔徑大小。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于制備不同形狀和用途的用于固定多微孔塑 料載體的器具。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的具有彈性的多微孔軟塑料為具 有回彈特性的多微孔聚氯乙烯塑料。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于將吸附有外源物的彈性多微孔軟塑料的微 孔開口面緊貼植物葉片表面。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于根據外源物和葉片的種類和特性，選擇多 微孔軟載體的擠壓頻率和力度，將含有外源物的液體注入葉片中。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于在擠壓多微孔軟載體，通過形成正負壓將 外源物注入葉片中。
8.權利要求1-5中任一權利要求所述的方法，可用于高效、簡便和微損傷地向植物葉 片注入小分子成分，或蛋白質，或核酸，或質粒，或病毒，或細菌等外源物。
9.權利要求1-8中任一權利要求所述的方法，可用于植物生理學、植物病理學和蛋白 質與基因功能等方面的研究。
10.權利要求1-8中任一權利要求所述的方法，可用于大規(guī)模植物生長發(fā)育干預或特 殊植物的培養(yǎng)生產。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效和簡便的向植物葉片注入外源物的方法。通過具有彈性的多微孔軟聚氯乙烯等軟塑料器具，采用的正負壓注入法(Positive andNegative Pressure Introduction by Using Soft Polyvinyl Chloride with Multi-Micro-Tubules，PNPi-SPCT，PNPi)實現(xiàn)了高效、簡便和微損傷地向植物葉片注入外源物的目標。本發(fā)明在植物生理學、植物病理學和蛋白質與基因功能等方面的研究中，以及大規(guī)模植物生長發(fā)育干預和特殊植物的培養(yǎng)生產中，具有廣泛的適用性。
文檔編號A01G7/06GK102047816SQ200910209539
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月29日 優(yōu)先權日2009年10月29日
發(fā)明者孔德權, 孟慶石, 張擘, 潘映紅, 胡新明 申請人:中國農業(yè)科學院作物科學研究所