專利名稱：利用共分離標(biāo)記pi5-2-4檢測抗稻瘟病基因pi5的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及利用共分離標(biāo)記pi5-2-4檢測水稻育種材料中的抗稻瘟病基因Pi5的方法。
背景技術(shù)：
稻痕病(Pyricularia grisea cav.)是由稻痕病菌(Magnaporthe oryzae ;無性態(tài):Pyri cu I aria)引起的水稻病害,其分布范圍十分廣泛。據(jù)統(tǒng)計,全世界有80余個國家均有發(fā)生，一般流行年份可造成10 % -20 %的減產(chǎn)，嚴(yán)重發(fā)生時則達(dá)到40 % -50 %。20世紀(jì)90年代以來，我國稻瘟病的年發(fā)生面積均在380萬hm2以上，每年損失稻谷達(dá)數(shù)億千克。隨著品種應(yīng)用的單一化、集中化以及氣候的影響，稻瘟病的危害也越來越重。盡管人們在病害防治上耗費(fèi)了巨大的精力和物質(zhì)投入，但限于諸多方面因素的影響，防病效果一直不盡人意，尤其在病害嚴(yán)重發(fā)生年份，常常給生產(chǎn)、育種造成重大損失。以遼寧省為例，自20世紀(jì)90年代起，分別發(fā)生了因遼粳287、遼鹽241、遼粳454和遼星I號幾個主栽品種抗病性退化導(dǎo)致的穗頸瘟大面積發(fā)生，嚴(yán)重影響了北方粳稻的生產(chǎn)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的根本原因就是主栽品種對稻瘟病菌的抗譜狹窄，且單一化、集中化種植現(xiàn)象普遍，這樣一旦稻瘟菌流行小種發(fā)生變化，品種對稻瘟病的抗性便迅速下降。因此，選育聚合多基因或具廣譜抗性的水稻品種尤為必要。目前，在抗稻瘟病品種選育的過程中，育種家主要采用系譜法，或結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇抗病個體。傳統(tǒng)的系譜法通過兩親本組配，從分離后代中擇優(yōu)選育品種，抗瘟表型依賴于田間自然鑒定或人工接種鑒定，鑒別難度大，準(zhǔn)確率低。由于不了解親本的抗瘟基因型，育種者在親本選擇上非常盲目，通常是海量配組，海量選擇后代，工作量大，育種效率低。在利用分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行抗病育種時，所選用的多是與抗病基因連鎖的SSR標(biāo)記，易造成假陽性的判斷，如能根據(jù)抗感等位基因本身的序列差異來設(shè)計不同基因的共分離標(biāo)記，不僅可首先檢測親本所攜帶的抗瘟基因，也能在后代輔助選擇時大大提高抗性品種選擇的準(zhǔn)確性。水稻抗稻痕病基因Pi5 (Jeon J S, et al.Genetic and physical mappingof Pi5 (t), a locus associated with broad-spectrum resistance to rice blast.Molecular Genetics and Genomics,2003,269(2):280-289 ；ffang G L, et al..RFLPMapping of Genes Conferring Complete and Partial Resistance to Blast in aDurably Resistant Rice Cultivar Genetics, 1994,136 (4):1421-1434)位于水稻第 9 染色體上S04G03和C1454之間的170kb區(qū)間內(nèi)，包含兩個獨(dú)立遺傳的NBS-LRR類基因(Pi5_l和Pi5-2)，且兩個基因的蛋白產(chǎn)物在氨基端都有CC結(jié)構(gòu)。Pi5-1和Pi5-2分別有5和6個外顯子，蛋白產(chǎn)物分別含有1025和1063個氨基酸；基因表達(dá)分析表明Pi5-1受病原菌誘導(dǎo)表達(dá)，而Pi5-2是組成性表達(dá)，在溫室人工接種條件下對P06-6等5個稻瘟病小種表現(xiàn)完全抗性，Pi5基因原始抗性供體為RIL260 (Wang G L, et al..RFLP Mapping of GenesConferring Complete and Partial Resistance to Blast in a Durably Resistant RiceCultivar Genetics,1994,136(4):1421-1434)。

發(fā)明內(nèi)容
為了高效選擇抗稻瘟病水稻品種，有針對性的、特異性的選擇含Pi5基因的后代材料，本發(fā)明提供一種用于檢測水稻抗稻瘟病基因Pi5的分子標(biāo)記pi5-2-4，分子標(biāo)記與Pi5基因共分離，可以用于Pi5基因的輔助選擇，以提高分子標(biāo)記輔助選擇的效率及抗病品種選育的效率。本發(fā)明提供如下解決方案:一種與水稻抗稻瘟病基因pi5連鎖的分子標(biāo)記pi5-2_4，如SEQ ID NO:3所示，所述分子標(biāo)記pi5-2-4與水稻抗稻痕病基因pi5共分尚。一種用于檢測分子標(biāo)記pi5-2-4是否存在的引物對DNA，如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2 所示。一種檢測水稻DNA中是否存在水稻抗稻瘟病基因pi5的方法，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列為引物，擴(kuò)增待檢測DNA，且擴(kuò)增子含有如SEQ ID NO:3 (741bp)所示序列即為含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。一種抗稻瘟病水稻品種分子標(biāo) 記輔助選擇方法，以含有抗稻瘟病基因pi5的水稻材料為親本，與其他水稻品種雜交，提取雜交后代個體基因組DNA，以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，且擴(kuò)增子含有如SEQ ID NO:3所示序列的對應(yīng)個體即含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。上述引物對優(yōu)選對水稻苗期所提取的DNA進(jìn)行標(biāo)記鑒定，檢測是否攜帶抗稻瘟病基因Pi5，由于上述引物對是基于基因組CDS序列的差異設(shè)計的，因此檢測方便，準(zhǔn)確率高，該分子標(biāo)記可以作為水稻稻瘟病抗病育種中Pi5基因分子標(biāo)記輔助選擇的應(yīng)用。


圖1是分子標(biāo)記pi5-2_4在抗稻瘟病基因Pi5供體品種RIL260、pi5單基因系和5個高感水稻品種中擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖；其中，M:2000bp分子量標(biāo)記(TIANGEN MD114-02)，200ng ;片段長度分別為:lOObp,250bp，500bp，750bp，lOOObp，2000bp。I:RIL260 ；2:麗江新團(tuán)黑谷；3:遼鹽241 ；4:鹽豐47 ；5:日本晴；6:遼星I號；7:pi5單基因系其中抗病基因供體品種RIL260和pi5單基因系擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為741bp，而感病品種無擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2是分子標(biāo)記pi5-2-4在抗稻瘟病基因Pi5供體品種RIL260、pi5單基因系(從IRRI引進(jìn))及22個水稻品種中擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。其中，M:2000bp分子量標(biāo)記(TIANGEN MD114-02)，200ng ;片段長度分別為:IOObp,250bp,500bp,750bp,lOOObp,2000bp。I:RIL260 ；2:麗江新團(tuán)黑谷；3:遼粳454 ；4:遼粳371 ；5:沈農(nóng)265 ；6:遼星I號7:沈稻7 ;8:越光；9:遼農(nóng)968 ；10:港源8號；11:遼鹽241 ；12:遼粳101 ；13:遼農(nóng)979 ；14:遼粳294 ；15:遼開79 ；16:遼星20 ；17:鐵粳4號；18:鹽粳456 ；19:稻花香；20:日本晴；21:沈農(nóng)606 ；22:千重浪2號；23 ;鹽粳218 ；24:pi5單基因系。
其中13號品種擴(kuò)增產(chǎn)物片段產(chǎn)度和pi5單基因系及供體品種RIL260 —致，進(jìn)一步測序結(jié)果表明其擴(kuò)增產(chǎn)物序列與SEQ ID NO:3所述序列一致，確定攜帶抗稻瘟病基因pi5，而其余品種均無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，說明不含有抗稻瘟病基因pi5。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳分析一、DNA 提取(CTAB 法):稱取0.1 0.2g水稻葉片并剪成Icm長，在液氮中研磨，待液氮蒸發(fā)完后(注意:勿使樣品融化)，迅速轉(zhuǎn)入含65°C預(yù)熱過的提取液(1M Tris pH8.0, IOOmM ；5M NaCl, 1.0M ；0.5M EDTA, 20mM ；10% CTAB, 2.0% )400 μ L 的離心管中。輕輕搖勻。60 65°C水浴30 60分鐘，每10分鐘輕輕搖動均勻。加等體積的氯仿/異戊醇(24: I)，溫和搖動，使成乳狀液。室溫下(溫度不低于15°C )，12000r/min離心5min，取上清液。用大孔Tip頭小心抽取上清液200 μ L加入預(yù)冷的2倍體積的無水乙醇(或等體積的異戊醇)，-200C的條件下放置20分鐘以上，5000r/min離心5分鐘，收集沉淀。70%乙醇洗滌沉淀I 2次。打開管蓋，放潔凈場所晾干，乳白色的DNA沉淀透明即可。100 μ LTE (Tris-HclIOmM, ΡΗ8.0 ；EDTAlmM, PH8.0)溶解沉淀，并稀釋至 100 μ g/mL，-20°C保存?zhèn)溆谩?二、PCR 擴(kuò)增:PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。1.反應(yīng)體系如下:2 X Taq PCR Master Mix (艾德萊 PC0902) 10 μ L，10 μ M 的引物各 0.5 μ L，100 μ g/mL 的模板 DNAl μ L, ddH208 μ L。3.PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 50s，35個循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。三、PCR產(chǎn)物檢測取4μ L PCR產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)goldview染色，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)記錄試驗(yàn)結(jié)果。實(shí)施例2:pi5供體品種和單基因系的pi5-2_4標(biāo)記檢測。以抗稻瘟病基因Pi5供體品種RIL260、pi5單基因系和5個高感水稻品種(麗江新團(tuán)黑谷；遼鹽241 ;鹽豐47 ;遼星I號；日本晴)為試材，種植于溫室，將遼寧地區(qū)流行的稻瘟病菌ZA9、ZA33、ZB1和ZB17分別移植于燕麥片番茄汁瓊脂培養(yǎng)基上，25 27°C條件下培養(yǎng)5 7d，待菌絲長滿，用滅菌的棉簽擦掉氣生菌絲后保濕培養(yǎng)，稻瘟病菌會大量產(chǎn)孢。待7個品種稻苗長至5葉I心時，將上述擴(kuò)繁培養(yǎng)的各菌株分生孢子分別用120ml無菌水清洗，用雙層紗布過濾裝入三角瓶中，配制孢子懸液(濃度為120倍顯微鏡視野下有20個左右孢子)，分別隔離噴霧接種。接種后24h，用塑料膜覆于塑料盤上方的鐵架上保濕，在塑料膜上覆蓋遮陽網(wǎng)防止陽光直射。于接種后IOd調(diào)查，致病反應(yīng)型和小種確定按全國稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組(1980)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評定。
調(diào)查記載標(biāo)準(zhǔn):O級無病......................................................................................................高抗(HR)I級僅t針尖大小的褐點(diǎn)......................................................................................杭2級稍大的褐點(diǎn)...................................................................................................抗(R)3級圓形稍大的灰色小病斑，邊緣褐色，病斑直徑I 2mm.......................................中抗(MR)
4級典型紡錘形病斑，長I 2cm，通常局限于兩條主脈之間。為害面積2%以下…...............................................................................................................中
感(MS)5級典M斑，為害面積3% 10%........................................................................中感(MS)6級典麵斑，為害面積11% 25%........................................................................感(S)7 級典SM,為害面IR 26% 50%...........................................................................感(S)8級典型病斑，為害面積51% 75%.....................................................................高感(HS)9級全部葉片枯死..........................................................................................高感(HS)接種鑒定結(jié)果表明，抗稻瘟病基因Pi5供體品種RIL260和pi5單基因系對遼寧地區(qū)流行的4個稻瘟病菌生理小種表現(xiàn)為抗病(R)，而麗江新團(tuán)黑谷、遼鹽241、鹽豐47、日本晴、遼星I號5個水稻品種對ZA9、ZA33、ZBl和ZB17均表現(xiàn)為感病(S)。在苗期按實(shí)施例1所述方法提取DNA，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示:Pi5供體品種RIL260和pi5單基因系均有擴(kuò)增產(chǎn)物，長度約為750bp，經(jīng)測序分析，表明產(chǎn)物片段長為741bp，經(jīng)序列分析如SEQ ID N0:3所示。而另外5個感病品種則無擴(kuò)增產(chǎn)物。以上結(jié)果表明，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的片段可以做為檢測抗稻瘟病基因Pi5是否存在的標(biāo)記。有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的品種可確定為攜帶抗稻瘟病基因Pi5，而無擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)物的品種不攜帶該抗病基因。結(jié)論:用該標(biāo)記可以可靠地檢測抗稻瘟病基因pi5的存在。實(shí)施例3:利用分子標(biāo)記pi5-2_4檢測育種親本材料是否含有抗稻瘟病基因pi5以抗稻瘟病基因Pi5供體品種RIL260、pi5單基因系(從IRRI引進(jìn))及22個水稻品種為試材，正常栽植于田間，于苗期按實(shí)施例1所述方法提取DNA，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，24個品種擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，除抗稻瘟病基因Pi5供體品種RIL260和pi5單基因系(從IRRI引進(jìn))外，13號品種遼農(nóng)979也擴(kuò)增出與供體品種和單基因系一致的特異性產(chǎn)物，進(jìn)一步測序結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物序列SEQ ID N0:3所示序列一致。接種鑒定結(jié)果表明，遼農(nóng)979對遼寧地區(qū)流行的4個稻瘟病菌生理小種表現(xiàn)為抗病(R)?；诜肿訕?biāo)記鑒定的結(jié)果可確定這3個品種含有抗稻瘟病基因pi5?；驒z測表明，遼農(nóng)979含pi5基因。結(jié)論:用該標(biāo)記可以高效地用于抗稻病育種中親本及后代材料的抗稻瘟病基因pi5的 鑒定。
權(quán)利要求
1.一種檢測水稻DNA中是否存在水稻抗稻瘟病基因pi5的方法，以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示序列為引物，擴(kuò)增待檢測DNA，且擴(kuò)增子含有如SEQ ID NO:3所示序列即為含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。
2.一種抗稻瘟病水稻品種分子標(biāo)記輔助選擇方法，以含有抗稻瘟病基因pi5的水稻材料為親本，與其他水稻品種雜交，提取雜交后代個體基因組DNA，以SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，且擴(kuò)增子含有如SEQ ID NO:3所示序列的對應(yīng)個體即含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及利用共分離標(biāo)記pi5-2-4檢測水稻育種材料中的抗稻瘟病基因pi5的方法。本發(fā)明公開了一種抗稻瘟病基因pi5的顯性分子標(biāo)記pi5-2-4，它是用引物對SEQ ID NO1和SEQ ID NO2從水稻總DNA中擴(kuò)增出的核苷酸序列，可以應(yīng)用于水稻稻瘟病抗性育種中pi5的分子標(biāo)記輔助選擇，以提高抗病品種選育的效率，減少田間鑒定的工作量。
文檔編號C12Q1/68GK103205506SQ20131016451
公開日2013年7月17日 申請日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者叢玲, 陸曉春, 鄭文靜, 趙家銘, 王妍 申請人:遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 鄭文靜, 陸曉春