專利名稱：抗稻瘟病基因pi5的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及抗稻瘟病基因pi5的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
稻痕病(Pyriculariagrisea cav.)是由稻痕病菌(Magnaporthe oryzae ;無性態(tài):Pyri cu I aria)引起的水稻病害,其分布范圍十分廣泛。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界有80余個(gè)國(guó)家均有發(fā)生，一般流行年份可造成10 % -20 %的減產(chǎn)，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)則達(dá)到40 % -50 %。20世紀(jì)90年代以來，我國(guó)稻瘟病的年發(fā)生面積均在380萬hm2以上，每年損失稻谷達(dá)數(shù)億千克。隨著品種應(yīng)用的單一化、集中化以及氣候的影響，稻瘟病的危害也越來越重。盡管人們?cè)诓『Ψ乐紊虾馁M(fèi)了巨大的精力和物質(zhì)投入，但限于諸多方面因素的影響，防病效果一直不盡人意，尤其在病害嚴(yán)重發(fā)生年份，常常給生產(chǎn)、育種造成重大損失。以遼寧省為例，自20世紀(jì)90年代起，分別發(fā)生了因遼粳287、遼鹽241、遼粳454和遼星I號(hào)幾個(gè)主栽品種抗病性退化導(dǎo)致的穗頸瘟大面積發(fā)生，嚴(yán)重影響了北方粳稻的生產(chǎn)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的根本原因就是主栽品種對(duì)稻瘟病菌的抗譜狹窄，且單一化、集中化種植現(xiàn)象普遍，這樣一旦稻瘟菌流行小種發(fā)生變化，品種對(duì)稻瘟病的抗性便迅速下降。因此，選育聚合多基因或具廣譜抗性的水稻品種尤為必要。目前，在抗稻瘟病品種選育的過程中，育種家主要采用系譜法，或結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇抗病個(gè)體。傳統(tǒng)的系譜法通過兩親本組配，從分離后代中擇優(yōu)選育品種，抗瘟表型依賴于田間自然鑒定或人工接種鑒定，鑒別難度大，準(zhǔn)確率低。由于不了解親本的抗瘟基因型，育種者在親本選擇上非常盲目，通常是海量配組，海量選擇后代，工作量大，育種效率低。在利用分子標(biāo)記輔助選擇進(jìn)行抗病育種時(shí)，所選用的多是與抗病基因連鎖的SSR標(biāo)記，易造成假陽性的判斷，如能根據(jù)抗感等位基因本身的序列差異來設(shè)計(jì)不同基因的共分離標(biāo)記，不僅可首先檢測(cè)親本所攜帶的抗瘟基因，也能在后代輔助選擇時(shí)大大提高抗性品種選擇的準(zhǔn)確性。

水稻抗稻痕病基因Pi5 (Jeon J S, et al.Genetic and physical mappingof Pi5 (t), a locus associated with broad-spectrum resistance to rice blast.Molecular Genetics and Genomics,2003,269(2):280-289 ；ffang G L, et al..RFLPMapping of Genes Conferring Complete and Partial Resistance to Blast in aDurably Resistant Rice Cultivar Genetics, 1994,136 (4): 1421-1434)位于水稻第 9 染色體上S04G03和C1454之間的170kb區(qū)間內(nèi)，包含兩個(gè)獨(dú)立遺傳的NBS-LRR類基因(Pi5_l和Pi5-2)，且兩個(gè)基因的蛋白產(chǎn)物在氨基端都有CC結(jié)構(gòu)。Pi5-1和Pi5-2分別有5和6個(gè)外顯子，蛋白產(chǎn)物分別含有1025和1063個(gè)氨基酸；基因表達(dá)分析表明Pi5-1受病原菌誘導(dǎo)表達(dá)，而Pi5-2是組成性表達(dá)，在溫室人工接種條件下對(duì)P06-6等5個(gè)稻瘟病小種表現(xiàn)完全抗性，Pi5基因原始抗性供體為RIL260 (Wang G L, et al..RFLP Mapping of GenesConferring Complete and Partial Resistance to Blast in a Durably Resistant RiceCultivar Genetics,1994,136(4):1421-1434)。

發(fā)明內(nèi)容
為了高效選擇抗稻瘟病水稻品種，有針對(duì)性的、特異性的選擇含Pi5基因的后代材料，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)水稻抗稻瘟病基因Pi5的分子標(biāo)記pi5-2-3，分子標(biāo)記與Pi5基因共分離，可以用于Pi5基因的輔助選擇，以提高分子標(biāo)記輔助選擇的效率及抗病品種選育的效率。本發(fā)明提供如下解決方案:一種與水稻抗稻瘟病基因pi5連鎖的分子標(biāo)記pi5-2_3，如SEQ ID NO:3所示，所述分子標(biāo)記pi5-2-3與水稻抗稻痕病基因pi5共分尚。一種用于檢測(cè)分子標(biāo)記pi5-2-3是否存在的引物對(duì)DNA，如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2 所示。一種檢測(cè)水稻DNA中是否存在水稻抗稻瘟病基因pi5的方法，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示序列為引物，擴(kuò)增待檢測(cè)DNA，且擴(kuò)增子含有如SEQ ID NO:3 (960bp)所示序列即為含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。一種抗稻瘟病水稻品種分子標(biāo)記輔助選擇方法，以含有抗稻瘟病基因pi5的水稻材料為親本，與其他水稻品種雜交，提取雜交后代個(gè)體基因組DNA，以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，且擴(kuò)增子含有如SEQ ID NO:3所示序列的對(duì)應(yīng)個(gè)體即含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。上述引物對(duì)優(yōu)選對(duì)水稻苗期所提取的DNA進(jìn)行標(biāo)記鑒定，檢測(cè)是否攜帶抗稻瘟病基因Pi5，由于上述引物對(duì)是基于基因組CDS序列的差異設(shè)計(jì)的，因此檢測(cè)方便，準(zhǔn)確率高，該分子標(biāo)記可以作為水稻稻瘟病抗病育種中Pi5基因分子標(biāo)記輔助選擇的應(yīng)用。


圖1是分子標(biāo)記pi5-2_3在抗稻瘟病基因Pi5供體品種RIL260、pi5單基因系和5個(gè)高感水稻品種中擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖；其中，M:2000bp分子量標(biāo)記(TIANGEN MD114-02)，200ng ;片段長(zhǎng)度分別為:lOObp,250bp，500bp，750bp，lOOObp,2000bp。I:RIL260 ；2:麗江新團(tuán)黑谷；3:遼鹽241 ；4:鹽豐47 ；5:日本晴；6:遼星I號(hào)；7:pi5單基因系其中抗病基因供體品種RIL260、pi5單基因系擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為960bp，而感病品種無擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2是分子標(biāo)記pi5-2-3在抗稻瘟病基因Pi5供體品種RIL260、pi5單基因系(從IRRI引進(jìn))及9個(gè)水稻品種中擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。其中，M:2000bp分子量標(biāo)記(TIANGEN MD114-02)，200ng ;片段長(zhǎng)度分別為:IOObp,250bp,500bp,750bp,lOOObp,2000bp。I:RIL260 ；2:麗江新團(tuán)黑谷；3:遼粳454 ；4:遼粳371 ；5:沈農(nóng)265 ；6:遼農(nóng)979 ；7:沈稻7 ；8:越光；9:pi5單基因系；10:港源8號(hào)；11:遼鹽241。其中6號(hào)品種擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度和pi5單基因系及供體品種RIL260 —致，進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明其擴(kuò)增產(chǎn)物序列與SEQ ID NO:3所述序列一致，確定攜帶抗稻瘟病基因pi5，而其余品種均無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，說明不含有抗稻瘟病基因pi5。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:DNA提取、PCR擴(kuò)增和電泳分析一、DNA 提取(CTAB 法):稱取0.1 0.2g水稻葉片并剪成Icm長(zhǎng)，在液氮中研磨，待液氮蒸發(fā)完后(注意:勿使樣品融化)，迅速轉(zhuǎn)入含65°C預(yù)熱過的提取液(1M Tris pH8.0, IOOmM ；5M NaCl, 1.0M ；0.5M EDTA, 20mM ；10% CTAB, 2.0% )400 μ L 的離心管中。輕輕搖勻。60 65°C水浴30 60分鐘，每10分鐘輕輕搖動(dòng)均勻。加等體積的氯仿/異戊醇(24: I)，溫和搖動(dòng)，使成乳狀液。室溫下(溫度不低于15°C )，12000r/min離心5min，取上清液。用大孔Tip頭小心抽取上清液200 μ L加入預(yù)冷的2倍體積的無水乙醇(或等體積的異戊醇)，-200C的條件下放置20分鐘以上，5000r/min離心5分鐘，收集沉淀。70%乙醇洗滌沉淀I 2次。打開管蓋，放潔凈場(chǎng)所晾干，乳白色的DNA沉淀透明即可。100 μ LTE (Tris-HclIOmM, PH8.0 ；EDTAlmM, PH8.0)溶解沉淀，并稀釋至 100 μ g/mL，-20°C保存?zhèn)溆?。二、PCR 擴(kuò)增:
PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。1.反應(yīng)體系如下:2 X Taq PCR Master Mix (艾德萊 PC0902) 10 μ L，10 μ M 的引物各 0.5 μ L，100 μ g/mL 的模板 DNAl μ L, ddH208 μ L。3.PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 60s，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存。三、PCR產(chǎn)物檢測(cè)取4μ L PCR產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)goldview染色，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)記錄試驗(yàn)結(jié)果。實(shí)施例2:pi5供體品種和單基因系的pi5-2_3標(biāo)記檢測(cè)。以抗稻瘟病基因Pi5供體品種RIL260、pi5單基因系和5個(gè)高感水稻品種(麗江新團(tuán)黑谷；遼鹽241 ;鹽豐47 ;日本晴、遼星I號(hào))為試材，種植于溫室，將遼寧地區(qū)流行的稻瘟病菌ZA9、ZA33、ZB1和ZB17分別移植于燕麥片番茄汁瓊脂培養(yǎng)基上，25 27°C條件下培養(yǎng)5 7d，待菌絲長(zhǎng)滿，用滅菌的棉簽擦掉氣生菌絲后保濕培養(yǎng)，稻瘟病菌會(huì)大量產(chǎn)孢。待7個(gè)品種稻苗長(zhǎng)至5葉I心時(shí)，將上述擴(kuò)繁培養(yǎng)的各菌株分生孢子分別用120ml無菌水清洗，用雙層紗布過濾裝入三角瓶中，配制孢子懸液(濃度為120倍顯微鏡視野下有20個(gè)左右孢子)，分別隔離噴霧接種。接種后24h，用塑料膜覆于塑料盤上方的鐵架上保濕，在塑料膜上覆蓋遮陽網(wǎng)防止陽光直射。于接種后IOd調(diào)查，致病反應(yīng)型和小種確定按全國(guó)稻瘟病菌生理小種聯(lián)合試驗(yàn)組(1980)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定。調(diào)查記載標(biāo)準(zhǔn):O級(jí)無病......................................................................................................高抗(HR)
I 級(jí)僅有針尖大小的褐點(diǎn)、.......................................................................................抗(R)2級(jí)稍大的褐點(diǎn)...................................................................................................抗(R)3級(jí)圓形稍大的灰色小病斑，邊緣褐色，病斑直徑I 2mm.......................................中抗(MR)4級(jí)典型紡錘形病斑，長(zhǎng)I 2cm，通常局限于兩條主脈之間。為害面積2%以下…...............................................................................................................中
感(MS)5 級(jí)典型病斑， 為害面積 3 % 10%.....................................................................中感(MS)6 級(jí)典型病斑， 為害面積 I I % 25%...........................................................................感(S)
7 級(jí)典型病斑， 為害面積 2 6 % 50%...........................................................................感(S)8 級(jí)典型病斑， 為害面積 5 I % 75%.....................................................................高感(HS)9 級(jí)全部葉片枯死..........................................................................................高感(HS)接種鑒定結(jié)果表明，抗稻瘟病基因Pi5供體品種RIL260和pi5單基因系對(duì)遼寧地區(qū)流行的4個(gè)稻瘟病菌生理小種表現(xiàn)為抗病(R)，而麗江新團(tuán)黑谷、遼鹽241、鹽豐47、日本晴、遼星I號(hào)5個(gè)水稻品種對(duì)ZA9、ZA33、ZBl和ZB17均表現(xiàn)為感病(S)。在苗期按實(shí)施例1所述方法提取DNA，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示:Pi5供體品種RIL260和pi5單基因系均有擴(kuò)增產(chǎn)物，長(zhǎng)度約為900bp，經(jīng)測(cè)序分析，表明產(chǎn)物片段長(zhǎng)為960bp，經(jīng)序列分析如SEQ ID N0:3所示。而另外5個(gè)感病品種則無擴(kuò)增產(chǎn)物。以上結(jié)果表明，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的片段可以做為檢測(cè)抗稻瘟病基因Pi5是否存在的標(biāo)記。有特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的品種可確定為攜帶抗稻瘟病基因Pi5，而無擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)物的品種不攜帶該抗病基因。基于分子標(biāo)記和抗病鑒定的結(jié)果可確定以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可擴(kuò)增出960bp特異性帶型的DNA即為含有抗稻瘟病基因pi5。結(jié)論:用該標(biāo)記可以可靠地檢測(cè)抗稻瘟病基因pi5的存在。實(shí)施例3:利用分子標(biāo)記pi5-2_3檢測(cè)育種親本材料是否含有抗稻瘟病基因pi5以抗稻瘟病基因Pi5供體品種RIL260、pi5單基因系(從IRRI引進(jìn))及9個(gè)水稻品種為試材，正常栽植于田間，于苗期按實(shí)施例1所述方法提取DNA，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，11個(gè)品種擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，除抗稻瘟病基因Pi5供體品種RIL260和pi5單基因系(從IRRI引進(jìn))外，6號(hào)品種遼農(nóng)979也擴(kuò)增出與供體品種和單基因系一致的特異性產(chǎn)物，進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物序列SEQ ID NO:3所示序列一致。接種鑒定結(jié)果表明，遼農(nóng)979對(duì)遼寧地區(qū)流行的4個(gè)稻瘟病菌生理小種表現(xiàn)為抗病(R)?；诜肿訕?biāo)記鑒定的結(jié)果可確定這3個(gè)品種含有抗稻瘟病基因pi5?；驒z測(cè)表明，遼農(nóng)979含pi5基因。結(jié)論:用該 標(biāo)記可以高效地用于抗稻病育種中親本及后代材料的抗稻瘟病基因pi5的鑒定。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)水稻DNA中是否存在水稻抗稻瘟病基因pi5的方法，以SEQ ID NO :1和SEQID NO :2所示序列為引物，擴(kuò)增待檢測(cè)DNA，且擴(kuò)增子含有如SEQ ID NO :3所示序列即為含有水稻抗稻瘟病基因Pi5。
2.一種抗稻瘟病水稻品種分子標(biāo)記輔助選擇方法，以含有抗稻瘟病基因pi5的水稻材料為親本，與其他水稻品種雜交，提取雜交后代個(gè)體基因組DNA，以SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2所示序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，且擴(kuò)增子含有如SEQ ID NO 3所示序列的對(duì)應(yīng)個(gè)體即含有水稻抗稻瘟病 基因Pi5。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及抗稻瘟病基因pi5的檢測(cè)方法。本發(fā)明公開了一種抗稻瘟病基因pi5的顯性分子標(biāo)記pi5-2-3，它是用引物對(duì)SEQ ID NO1和SEQ ID NO2從水稻總DNA中擴(kuò)增出的核苷酸序列，可以應(yīng)用于水稻稻瘟病抗性育種中pi5的分子標(biāo)記輔助選擇，以提高抗病品種選育的效率，減少田間鑒定的工作量。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103215370SQ20131016449
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月8日
發(fā)明者張麗霞, 王妍, 陸曉春, 鄭文靜, 趙家銘 申請(qǐng)人:遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 鄭文靜, 陸曉春