與菠菜性別基因y共分離的分子標記s5.7及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子遺傳育種領域，具體涉及與菠菜性別基因Y共分離的的分子 標記S5. 7及其應用。
【背景技術】
[0002] 菠菜（SpinaciaoleraceaL.)，別名波斯草、赤根菜，黎科菠菜屬作物，栽培歷史 悠久，是我國重要的蔬菜作物之一。菠菜營養(yǎng)豐富，抗寒性強，適應性廣，生產(chǎn)周期短，復種 指數(shù)高，產(chǎn)量產(chǎn)值高，深受生產(chǎn)者和消費者歡迎。
[0003] 菠菜一般是雌雄異株作物，少量植株表現(xiàn)為雌雄同株。菠菜性型受遺傳因素和環(huán) 境因素的影響。Rosa等（1925)認為菠菜性型主要受遺傳因子控制，并不受土壤肥力、株間 距離、光照強弱、種植期等外界因素的影響。Nicolaisen等（1940)報道菠菜性型受外界 環(huán)境因素的影響，在瘠薄土地上生長時多雄株，夏播比秋播多雌株。Janick等（1955)研 宄表明菠菜性型受環(huán)境條件的影響，高溫短日照能使雄性增強雌性減弱，日溫26. 6°C、夜溫 24°C比日溫21°C、夜溫18°C有增加雄性的趨勢；不論溫度高低，在15~18h光照下都比在 12h光照下多雌株雌花，但是溫度愈高則長短日之間的差異愈小。Ge〇rge(1985)研宄表明 少數(shù)菠菜品種性型僅受遺傳因子的控制，而不受其他環(huán)境因子的控制。徐躍進等（1996)對 65個菠菜品種的性型表現(xiàn)進行調(diào)查分析，植株群體雌雄比約為1: 1，但是有1/3的品種雌雄 之比不符合1: 1，進一步對其中的4個品種進行分析，其中濰坊尖葉的性型表現(xiàn)僅受遺傳因 子控制，而其它3個品種的性型既受遺傳因子控制，也受環(huán)境因子影響。
[0004] 國內(nèi)外學者普遍認為菠菜的性型遺傳主要受存在于性染色體上的一對X和Y基因 的控制，菠菜植株群體中雌雄比約為1:1，但是可能同時還受其它的基因控制，據(jù)此提出了 不同的假說，但是至今還沒有一種得到普遍認同。Janick等（1954)經(jīng)過研宄認為性基因 型為XX的植株表現(xiàn)為雌株，XY型的植株為能結少量或不結種子的雄株，YY型的植株為不 能結籽的雄株。Janick等（1955,1961，1963)還認為雌雄同株性別受另一個與X及Y等位 的基因Xm控制，另有一些修飾基因影響雌花和雄花的比例，即雌雄同株性狀是由Xm基因控 制的，Xm和X和Y是等位基因，XmXm的表型是雌雄異花同株而多雄花，XmX為雌雄異花同株 而多雌花，XX為雌株（譚其猛，1980)。Bemis和Wilson(1953)經(jīng)過研宄提出性別連鎖基因 平衡假說，認為除性染色體（X/Y)外，在常染色體上還存在二對強連鎖的性平衡基因Aa和 Gg，A能使XX株表現(xiàn)為雌兩性株，G能使XY株表現(xiàn)為雄兩性株。當二對基因呈平衡狀態(tài)時， 如AG/AG或AG/ag或ag/ag時，XX為純雌株，XY為純雄株。但在發(fā)生交叉、互換破壞平衡 后，就產(chǎn)生兩性株。白密斯等的假說，雖大體上能解釋一些遺傳現(xiàn)象，但缺乏充分的后代驗 證（譚其猛，1980)。
[0005] 菠菜在苗期難以區(qū)分雌雄株，菠菜只有生長至抽薹期時，性型表型才能有效區(qū)分， 因此為更早對菠菜植物性型進行鑒定及提升育種效率，國內(nèi)外針對菠菜性型進行分子標記 研宄，獲得了一些與性型基因連鎖的分子標記。Akamatsu(1998)開發(fā)與菠菜X/Y位點連鎖 的分子標記T11A、V20A，可用于鑒別菠菜雌雄植株。Khattak等（2006)認為菠菜性型受X/ Y位點控制，用AFLP和SSR技術構建菠菜的七個遺傳連鎖圖，總長為580cM，標記間平均距 離為5. 18cM，X/Y位點被定位在連鎖群3上較小的遺傳區(qū)域內(nèi)，與SSR標記S04相距1. 9cM。 Onodera等（2011)利用BSA法篩選到10個AFLP標記與菠菜X/Y位點緊密連鎖，4個標記 與Y位點共分離；驗證已發(fā)表的與Y位點連鎖的SSR標記T11A、V20A，其均于Y位點連鎖； 發(fā)現(xiàn)了一個單獨的、不完全顯性的強雄兩性基因，其與X/Y位點連鎖標記S04相距4. 3cM， 證實雌雄同株決定基因不是X/Y位點的等位基因，但是與X/Y位點緊密相連。目前國內(nèi)外 已發(fā)表的與菠菜性別基因Y連鎖標記有4個，第一個是T11A、V20A與菠菜性別基因Y共分 離，但是在大群體驗證時V20A擴增效果不夠穩(wěn)定，T11A與Y共分離；第二個是S04,其與菠 菜性別基因Y相距4. 3cM，在群體中驗證時不連鎖，在該基因片段上開發(fā)另外的SSR進行分 析，遺傳距離約為llcM;第三個為楊金華（2009)通過ISSR分析，篩選到一個與雌性相關的 標記，全長1176bp，并將其轉(zhuǎn)化為SCAR標記，該標記在群體中驗證時不連鎖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種與菠菜性別基因Y共分離的分子標記。
[0007] 本發(fā)明另一目的是提供一種利用分子標記鑒別菠菜性別的方法。
[0008] 為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，首先利用菠菜雜交一代商業(yè)品種冬綠1號（F1)中的雌株X 雄株構建F2群體，提取343個F2單株的基因組DNA，研宄菠菜性別基因的遺傳基礎，利用SRAP標記篩選與性別基因連鎖的分子標記，對連鎖的特異片段進行克隆測序，并將其轉(zhuǎn)化 成SCAR標記，利用轉(zhuǎn)化成功的SCAR標記在菠菜其他7個群體中進行雌雄性別鑒定，分子標 記鑒定結果與表型鑒定結果一致。
[0009] 本發(fā)明提供的與菠菜性別基因Y共分離的分子標記為SCAR標記S5. 7,在菠菜雄 株里可以擴出了 126bp的特異條帶，在雌株里沒有擴出條帶。性別基因Y位于菠菜Y染色 體上，SCAR標記S5. 7與Y基因共分離，處在Y染色體特異片段上。
[0010] 進一步地，本發(fā)明的SCAR標記S5. 7通過以下特異性引物對擴增獲得：
[0011] 上游引物F:5' -TGAGTCCAAACCGGAAGTCGTATC-3'
[0012] 下游引物R: 5' -TGACTGCGTACGAATTCAAGATAAAT-3 '。
[0013] 本發(fā)明提供了用于檢測SCAR分子標記S5. 7的特異性引物對，其為：
[0014]上游引物F :5，-TGAGTCCAAACCGGAAGTCGTATC-3，(SEQ ID NO. 2)
[0015]下游引物R:5，-TGACTGCGTACGAAITCAAGATAAAT-3'(SEQIDNO. 3)〇
[0016] 本發(fā)明提供了含有上述特異性引物對的試劑盒。
[0017] 本發(fā)明提供了分子標記S5. 7在菠菜性別鑒定中的應用。
[0018] 本發(fā)明提供了分子標記S5. 7在菠菜分子標記輔助育種中的應用。
[0019] 本發(fā)明提供了SEQIDNO. 2-3所示的特異性引物對或含有該特異性引物對的試劑 盒在菠菜性別鑒定中的應用。
[0020] 本發(fā)明提供了SEQIDNO. 2-3所示的特異性引物對或含有該特異性引物對的試劑 盒在菠菜分子標記輔助育種中的應用。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種鑒定菠菜性別的方法，包括以下步驟：
[0022] (1)提取待測菠菜的基因組DNA;
[0023] (2)以待測菠菜的基因組DNA為模板，利用SEQIDNO. 2-3所示的特異性引物對進 行PCR擴增反應；
[0024] (3)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，若擴出了 126bp的特異條帶，則為雄性， 若無擴增條帶，則為雌性。
[0025] 上述方法中，步驟（2)中PCR擴增反應10yL體系為：20-25ng/yLDNA2yL， 10uM上、下游引物各 0.2yL，10XPCRbufferlyL，2.5mMdNTP0.8yL，Taq酶