專利名稱：與黃瓜果瘤基因Tu共分離的顯性分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域的分子標(biāo)記，特別涉及兩個(gè)與黃瓜果瘤基因Tu共分尚的顯性分子標(biāo)記。
背景技術(shù)：
黃瓜(Cucumissativus L.)是葫蘆科(Cucurbitaceae)甜瓜屬(Cucumis) —年蔓生的草本植物，黃瓜作為世界十大重要的蔬菜作物之一，也是我國主栽蔬菜作物之一。果實(shí)是黃瓜經(jīng)濟(jì)性狀最重要的部分，黃瓜果實(shí)屬于瓠果，由子房和花托共同發(fā)育而成。在黃瓜果實(shí)上有一個(gè)重要的性狀是果瘤，果瘤是黃瓜果實(shí)表面的瘤狀突起。果瘤基因的研究始于1913年,有果瘤是黃瓜的野生性狀,果瘤性狀是由Tu (Tuberculate fruit)基因調(diào)控，有果瘤(Tu)為顯性，無果瘤(Tu)為隱性。在經(jīng)典遺傳圖譜上，果瘤基因(Tu，·Tuberculate fruit)和無光澤果皮基因(D)及一致果皮顏色基因(u, uniform immaturefruit color)緊密連鎖在一起。曹辰興通過分離群體的遺傳分析結(jié)果表明控制莖、葉、果實(shí)表皮毛性狀的無毛基因?qū)刂乒鲂誀畹墓龌虼嬖陔[性上位作用(曹辰興等.黃瓜莖葉無毛性狀與果實(shí)瘤刺性狀的遺傳關(guān)系.園藝學(xué)報(bào)，2001，28 ￠) :565-566)。因此，果瘤基因Tu的研究將有助于揭示黃瓜果刺基因形成的分子機(jī)制，為黃瓜遺傳和育種工作奠定基礎(chǔ)。2009年張微微等得出黃瓜果瘤性狀屬于單基因顯性性狀，利用247個(gè)F2群體將果瘤基因初步定位于第五染色體SSR標(biāo)記16203和SCAR標(biāo)記C_SC933之間，遺傳距離分別為I. 3cM和 5. 9cM,詳細(xì)結(jié)果可以參看Zhang W W等在《Theoretical and Applied Genetics))(理論應(yīng)用遺傳學(xué))2009年第120卷第3期645-654頁發(fā)表的題為《Identificationand mapping of molecular markers linked to the tuberculate fruit gene in thecucumber (Cucumis sativus L.)))(黃瓜果瘤基因緊密連鎖分子標(biāo)記初步定位)一文,上述標(biāo)記還存在分析群體相對較小，連鎖距離相對較遠(yuǎn)等問題，候選區(qū)間存在100多個(gè)候選基因，也沒有對候選基因分析。隨著人們生活水平的提高，品質(zhì)育種已提到重要位置。黃瓜果實(shí)刺瘤性狀屬于感觀品質(zhì)范疇。歐美溫室類型的黃瓜為無果瘤、少刺的果皮，稱其為水果黃瓜，其市場價(jià)格為普通黃瓜的2-3倍。外觀光滑黃瓜污染少，清洗方便，食用衛(wèi)生，是無公害蔬菜的理想品種。經(jīng)檢測表明無瘤少刺黃瓜果肉農(nóng)藥殘留量比有刺黃瓜低27%，果皮農(nóng)藥殘留量低18%。黃瓜果瘤基因Tu控制果瘤的形成，它的研究將會推動(dòng)品質(zhì)育種進(jìn)程。用與目的性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇在黃瓜遺傳育種中是十分有效的方法，分子標(biāo)記是在DNA水平上對目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，具有高效、快速、不受環(huán)境條件限制等優(yōu)點(diǎn)，可在苗期進(jìn)行選擇，加快育種的進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供兩個(gè)與黃瓜果瘤基因Tu共分離的顯性分子標(biāo)記。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及的第一個(gè)與黃瓜果瘤基因Tu共分離的顯性分子標(biāo)記，命名為DT-1，由序列表中SEQ ID NO. I所示的236個(gè)核苷酸組成，無果瘤基因不含有這236個(gè)核苷酸。世界各地有瘤黃瓜品種均含有該顯性分子標(biāo)記，無瘤黃瓜品種(除了突變體無毛無瘤品種gl)不含有該顯性分子標(biāo)記，該顯性分子標(biāo)記可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于世界各地黃瓜有瘤/無瘤類型(除了突變體無毛無瘤品種gl)的篩選。上述與果瘤基因Tu共分離的顯性分子標(biāo)記，由SEQ ID NO. 3所示的上游引物和SEQ ID NO. 4所示的下游引物擴(kuò)增得到。引物由上海生工合成。本發(fā)明涉及的第二個(gè)與黃瓜果瘤基因Tu共分離的顯性分子標(biāo)記，命名為DT-2，由序列表中SEQ ID NO. 2所示的468個(gè)核苷酸組成，無果瘤基因不含有這468個(gè)核苷酸。世界 各地有瘤黃瓜品種均含有該顯性分子標(biāo)記，無瘤黃瓜品種(除了突變體無毛無瘤品種gl)不含有該顯性分子標(biāo)記，該顯性分子標(biāo)記可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于世界各地黃瓜有瘤/無瘤類型(除了突變體無毛無瘤品種gl)的篩選。上述與果瘤基因Tu共分離的顯性分子標(biāo)記，由SEQ ID NO. 5所示的上游引物和SEQ ID NO. 6所示的下游引物擴(kuò)增得到。引物由上海生工合成。用于控制黃瓜果瘤性狀的果瘤基因Tu的cDNA區(qū)域，由序列表中SEQ ID NO. 7所示的642個(gè)核苷酸組成，可以根據(jù)該基因設(shè)計(jì)更多的顯性分子標(biāo)記用于黃瓜的有瘤/無瘤(除了突變體無毛無瘤品種gl)類型的篩選、還可以為無毛基因，光澤基因的克隆提供分子基礎(chǔ)。所述用于控制黃瓜果瘤性狀的果瘤基因Tu的cDNA區(qū)域來自于已經(jīng)公布的黃瓜品種9330基因組序列Scaffold000083和gyl4黃瓜基因組序列Scaffold02633。本發(fā)明利用多種有瘤親本和無瘤親本雜交獲得F1, F1再自交獲得多種F2分離群體，確定黃瓜果瘤性狀屬于單基因顯性性狀。利用果瘤基因存在于SSR標(biāo)記分子標(biāo)記Y32和分子標(biāo)記Y46之間的50Kb的序列，進(jìn)行基因預(yù)測。這50Kb的序列同時(shí)存在于已經(jīng)公布的黃瓜品種 9330 ScaffoId000083 和 gy 14 黃瓜基因組序列 ScaffoId02633 中(http://cucumber, vcru. wise, edu/wenglab/gy 14-9930/index, html)。對其中含有基因的 cDNA 區(qū)設(shè)計(jì)引物，查找多態(tài)性位點(diǎn)。開發(fā)果瘤基因共分離的標(biāo)記和確定控制黃瓜果瘤性狀的果瘤基因的cDNA序列。本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明的兩種顯性分子標(biāo)記與黃瓜果瘤性狀完全共分離，所有世界各地的黃瓜品種均可以用這兩個(gè)顯性分子標(biāo)記篩選有瘤/無瘤品種(除無毛無瘤黃瓜品種gl)。根據(jù)本發(fā)明中提供的控制黃瓜果瘤性狀的果瘤基因，可以設(shè)計(jì)多種顯性分子標(biāo)記，篩選有瘤/無瘤品種(除無毛無瘤黃瓜品種gl)，還可以為黃瓜無毛基因、光澤基因的克隆奠定分子基礎(chǔ)。本發(fā)明中涉及的2個(gè)SSR分子標(biāo)記Y32和Y46已于同日申請專利。


圖I是SSR標(biāo)記Y32和Y46之間50Kb的序列包含的3個(gè)候選基因結(jié)構(gòu)示意圖圖中所示，I表示nudix水解酶基因；2為磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因；3為C2H2鋅指蛋白基因。圖2是2個(gè)顯性分子標(biāo)記DT-I和DT-2的PCR擴(kuò)增效果圖，圖中所示，M代表MarkerDL2000, S52為有瘤親本；S06為無瘤親本R代表兩親本雜交后代；F2無果瘤單株和F2無果瘤單株分別代表在F2群體中隨機(jī)挑選的10株有瘤和10株無瘤植株。圖3是2個(gè)顯性分子標(biāo)記DT-I和DT-2對世界不同黃瓜品種的篩選效果藍(lán)圖圖中所示，M代表Marker DL2000。
具體實(shí)施例方式一，遺傳分離群體的構(gòu)建與黃瓜果瘤基因的鑒定I.多種F2群體的構(gòu)建構(gòu)建F2群體所用到的無瘤自交系品種有歐洲溫室類型自交系S06(母本)、·H34(母本)，S42。有瘤品種有中國自交系S110、S94、G1、華南類型自交系S52。本實(shí)施例利用這7個(gè)親本配制了多種雜交組合，得到F1代，F(xiàn)1代自交或回交產(chǎn)生F2代群體。在多種F2群體鑒定有/無果瘤表型，最后分析F1表型和F2分離比，卡方分析法進(jìn)行驗(yàn)證，最后得出黃瓜果瘤性狀屬于單基因控制的顯性性狀。2.黃瓜果瘤基因的鑒定2. I黃瓜基因組DNA的提取用CTAB法提取親本及F2分離群體的葉片總DNA。2. 2確定果瘤基因序列用標(biāo)記SSR標(biāo)記Y32和Y46確定果瘤基因候選區(qū)域大概50Kb的序列，這50Kb的序列同時(shí)存在于已經(jīng)公布的黃瓜品種9330基因組序列Scaffold000083和黃瓜品種gyl4基因組序列 Scaffold02633 中(http://cucumber.vcru.wisc.edu/wenglab/gyl4-9930/index, html)。用FGENESH軟件和GENSCAN軟件預(yù)測該候選區(qū)域，共包含3個(gè)基因(參見圖I)，分別為 nudix (nucleoside diphosphate linked moiety X)水解酶、憐酸烯醇式丙酮酸羧激酶、C2H2鋅指蛋白。針對每個(gè)基因的編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增有瘤品種S52和無瘤品種S06兩親本，在前兩個(gè)基因設(shè)計(jì)的引物序列擴(kuò)增片段經(jīng)測序后分析發(fā)現(xiàn)沒區(qū)別，最后發(fā)現(xiàn)C2H2鋅指蛋白基因序列中的標(biāo)記DT-I和標(biāo)記DT-2在兩親本產(chǎn)生很大差異，在有瘤親本S52有該2個(gè)標(biāo)記，在無瘤親本S06中完全不存在2個(gè)標(biāo)記。該2個(gè)顯性分子標(biāo)記在親本S52和S06得到的2200株F2群體中已經(jīng)完全共分離(參見圖2)。該2個(gè)顯性分子標(biāo)記的PCR均為基因組 DNA30ng，引物 O. 2ymol/L，200ymol/L dNTPs, 2mmol/L MgCl2,1 X Taq 緩沖液，
O.5U TaqDNA聚合酶，總反應(yīng)體系為10 μ L，其中TaqDNA聚合酶購于Promega公司。顯性分子標(biāo)記DT-I 的 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 5min ；35cycles, 94°C 25s ；56°C 25s ；72°C 30s ；72°C 5min。顯性分子標(biāo)記DT-2 的 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 5min ；35cycles, 94°C 30s ；58°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。由于果瘤性狀單基因控制的顯性性狀，推測該C2H2鋅指蛋白基因就是目的基因。2. 3多態(tài)性片段的回收、克隆和測序在PCR產(chǎn)物中加入goldview熒光染料3ul，4°C下放置IOmin讓染料同DNA結(jié)合，然后加入上樣緩沖液2ul，混勻后通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下切下目標(biāo)片段放入I. 5ml的離心管中，用DNA回收試劑盒回收，其中DNA回收試劑盒為上海生工UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒，產(chǎn)品號為Cat. No. SKl 132。將回收產(chǎn)物與載體連接采用上海申能博彩公司的pUCm-T vector系統(tǒng)。用電擊法將連有目標(biāo)片段的T_vector轉(zhuǎn)化進(jìn)入E. coliDH5 α感受態(tài)細(xì)胞，將菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基的平板上，涂好的平板倒置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，挑菌、搖菌及PCR菌液檢測，進(jìn)行相關(guān)序列的測定。二，果瘤基因Tu的品種驗(yàn)證I.選取多種黃瓜品種由于推測C2H2鋅指蛋白基因是控制果瘤性狀的目的基因，隨機(jī)對來自世界各地的22個(gè)黃瓜自交系品種對這2個(gè)顯性分子標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證其中無瘤品種有以色列親本的S06、荷蘭的 S46-2、S49-l、S49-2 和 S51-2，以色列的 S03、S04 和 S05，西班牙的 S75 和 S76,歐洲的H34，共11個(gè)無瘤黃瓜品種；有瘤品種有中國的S52、S94、S110、G1、M3、M12、419、493和S124-5，韓國的S112-7，美國的83G，共11個(gè)有瘤黃瓜品種。2.用2個(gè)顯性分子標(biāo)記驗(yàn)證22種黃瓜品種如圖3所示，11種無果瘤品種均沒出現(xiàn)DT-I和DT_2標(biāo)記，而11種有果瘤品種均出現(xiàn)DT-I和DT-2標(biāo)記。以上兩種新開發(fā)的顯性分子標(biāo)記均存在于序列表中SEQ ID NO. 7所示果瘤基因Tu的cDNA區(qū)域的642個(gè)核苷酸中，經(jīng)過分離群體驗(yàn)證和品種驗(yàn)證，由于都是特異性PCR擴(kuò)增，·故兩個(gè)顯性分子標(biāo)記具有高穩(wěn)定性。所以本發(fā)明的兩個(gè)顯性分子標(biāo)記可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于世界各地黃瓜有瘤/無瘤類型(除了突變體無毛無瘤品種gl)的篩選。本發(fā)明中的提供的果瘤基因的642個(gè)核苷酸序列還可以為黃瓜無毛基因和光澤基因的克隆奠定分子基礎(chǔ)。本發(fā)明中PCR產(chǎn)物克隆測序中所使用的E. coli DH5a菌株已在文獻(xiàn)《李欣等，電轉(zhuǎn)化法制備高轉(zhuǎn)化效率的E. coli感受態(tài)細(xì)胞研究。食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，26 (6) 48 51》中公開；本發(fā)明中涉及的E. coli DH5a菌株可通過公開市售的商業(yè)渠道取得，購于寶生物工程(大連)有限公司，公司地址大連經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)東北二街19號。

權(quán)利要求
1.一個(gè)與黃瓜果瘤基因Tu共分離的顯性分子標(biāo)記，命名為DT-I，由序列表中SEQ IDNO. I所示的236個(gè)核苷酸組成,無瘤基因tu不含有該標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的與黃瓜果瘤基因Tu共分離的顯性分子標(biāo)記，其特征在于由SEQ ID NO. 3所示的上游引物和SEQ ID NO. 4所示的下游引物擴(kuò)增得到，其擴(kuò)增程序940C 5min ；35cycles, 94°C 25s ；56°C 25s ；72°C 30s ；72°C 5min。
3.一個(gè)與黃瓜果瘤基因Tu共分離的顯性分子標(biāo)記，命名為DT-2，由序列表中SEQ IDNO. 2所示的468個(gè)核苷酸組成,無瘤基因tu不含有該標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的與黃瓜果瘤基因Tu共分離的顯性分子標(biāo)記，其特征在于由SEQ ID NO. 5所示的上游引物和SEQ ID NO. 6所示的下游引物擴(kuò)增得到，其擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 5min ；35cycles,94°C 30s ；58°C 30s ；72°C 30s ；72°C 5min。
5.用于控制黃瓜果瘤性狀的果瘤基因Tu的cDNA區(qū)域，由序列表中SEQID NO. 7所示的642個(gè)核苷酸組成，無瘤基因tu不含有該642個(gè)核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于控制黃瓜果瘤性狀的果瘤基因Tu的cDNA區(qū)域，其特征在于由黃瓜品種9330基因組序列Scaffold000083和黃瓜品種gyl4黃瓜基因組序列Scaffold02633 得到。
全文摘要
本發(fā)明提供了兩個(gè)與黃瓜果瘤基因Tu共分離的顯性分子標(biāo)記，第一個(gè)顯性分子標(biāo)記由序列表中SEQ ID NO.1所示的236個(gè)核苷酸組成；第二個(gè)顯性分子標(biāo)記由序列表中SEQ ID NO.2所示的468個(gè)核苷酸組成。本發(fā)明的兩個(gè)顯性分子標(biāo)記均存在于序列表中SEQ ID NO.7所示果瘤基因Tu的cDNA區(qū)域中，兩個(gè)顯性分子標(biāo)記都具有高穩(wěn)定性，可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于世界各地黃瓜有瘤/無瘤類型(除了突變體無毛無瘤品種gl)的篩選。根據(jù)SEQ ID NO.7所示果瘤基因Tu的cDNA區(qū)域，還可以設(shè)計(jì)多對分子標(biāo)記作為世界各地黃瓜有瘤/無瘤類型(除了突變體無毛無瘤品種g1)篩選的顯性分子標(biāo)記，果瘤基因Tu的cDNA區(qū)域還可以為黃瓜無毛基因和光澤基因的克隆奠定分子基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/29GK102925434SQ201210382888
公開日2013年2月13日 申請日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者蔡潤, 楊緒勤, 何歡樂, 潘俊松, 任國良 申請人:上海交通大學(xué)