專利名稱：一種3’-cDNA展示方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種3’ -CDNA展示方法。
背景技術(shù)：
對不同生物不同發(fā)育階段的基因表達(dá)狀況進行遺傳分析，可以為研究生命活動過程提供十分重要的信息，研究基因在特定時期轉(zhuǎn)錄水平上的差異表達(dá)及表達(dá)豐度等情況。目前已有多種可在轉(zhuǎn)錄水平對差異表達(dá)基因篩選分析的方法，如DDRT-PCR、cDNA-AFLP和SSH等。但冗余度、假陽性高等問題依然制約著這些技術(shù)的廣泛應(yīng)用。mRNA 差異顯不聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(differential display of mRNA reversetranscription polymerase chain reaction, DDRT PCR),是由 Liang 等首先建立的。此技術(shù)是以PCR技術(shù)和聚丙烯凝膠電泳技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合銀染或放射性自顯影等顯色技術(shù)，能快速有效地鑒定并克隆兩個或多個平行材料之間的差異表達(dá)基因，在植物研究方面已經(jīng)取得了很多成果。現(xiàn)有技術(shù)一的缺點是假陽性高，效率較低。cDNA-AFLP是Bachem等在一種應(yīng)用于基因組DNA的選擇性擴增限制性片段即(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)的基礎(chǔ)上設(shè)計出來的用于 RNA 指紋分析的方法。它將RT2PCR和AFLP結(jié)合起來，由于PCR中使用較高的退火溫度和應(yīng)用特定引物對包含信息較多的內(nèi)部特異片段進行選擇性擴增，增加了反應(yīng)條件的嚴(yán)謹(jǐn)度，使其比DDRT-PCR的可靠性和可重復(fù)性大大提高。SSH的基本原理是利用消減雜交和兩次抑制PCR，使差異表達(dá)基因的cDNA片段得到高度富集，從而實現(xiàn)對差異表達(dá)基因的分離和克隆。消減雜交運用了雜交二級動力學(xué)原理，即豐度高的單鏈cDNA在退火時產(chǎn)生同源雜交的速度要快于豐度低的單鏈cDNA，從而在雜交過程中，使豐度高的單鏈cDNA雜交形成雙鏈，在雜交完畢后，原來在豐度上有差別的單鏈cDNA達(dá)到均一化的目的。抑制PCR是利用DNA鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火，且比鏈間退火更穩(wěn)定的動力學(xué)特性，使非目的系列片段兩端反向重復(fù)序列在退火時產(chǎn)生類似“鍋柄”的結(jié)構(gòu)，無法與引物配對不能擴增，從而選擇性富集目的基因序列片段?，F(xiàn)有技術(shù)二的缺點是無法處理多個樣本多個時期的mRNA差異表達(dá)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明實施例的目的在于提供一種3’ -cDNA展示方法，旨在解決假陽性高，效率較低，無法處理多個樣本多個時期的mRNA差異表達(dá)研究的問題。本發(fā)明實施例是這樣實現(xiàn)的，一種3’ -cDNA展示方法，其特征在于，該方法的主要步驟包括(I)以總RNA或者mRNA為模板，以設(shè)計合成的Oligo (dT) 18V引物通反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈；(2)將步驟⑴得到產(chǎn)物通過Taq I內(nèi)切酶進行酶切；
(3)將步驟⑵產(chǎn)物與設(shè)計合成的“Y”形接頭用T4連接酶連接；(4)以O(shè)ligo (dT)18V及Taq I “Y”形接頭序列設(shè)計引物進行PCR擴增。(5)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。進一步，所述變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法進一步包括(I)以總RNA或者mRNA為模板，以設(shè)計合成的Oligo (dT) 18V引物通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈；(2)將步驟⑴得到產(chǎn)物通過Taq I內(nèi)切酶進行酶切，得到兩端具有粘性末端的cDNA片段及一端為粘性末端另一端為PolyA末端的cDNA片段；(3)將步驟⑵產(chǎn)物與設(shè)計合成的“Y”形接頭用T4連接酶連接，得到兩種產(chǎn)物，一 種是兩端都連接上“Y”形接頭的片段，另一種是一端連接上“Y”形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段；(4)以O(shè)ligo (dT)18V及Taq I“Y”形接頭序列設(shè)計引物進行PCR擴增，其結(jié)果是兩端都連接上“Y”形接頭的片段在PCR擴增中因其片段兩尾的互補序列而形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)，擴增受到抑制；而一端連接上“Y”形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段在擴增中得到正常指數(shù)擴增。進一步，所述展示方法應(yīng)用“Y”形接頭與酶切片段連接，抑制非PolyA末端的cDNA擴增，讓具有“Y”形接頭及PolyA末端的cDNA得到指數(shù)擴增，排除了非PolyA末端cDNA的干擾，從而只擴增cDNA 3’末端序列。本發(fā)明應(yīng)用“Y”形接頭與酶切片段連接，抑制非PolyA末端的cDNA擴增，讓具有“Y”形接頭及PolyA末端的cDNA得到指數(shù)擴增，排除了非PolyA末端cDNA的干擾。因此，本發(fā)明方法能夠展示基于mRNA水平的基因表達(dá)譜，可用來篩選差異表達(dá)基因。方案中RNA模板需要量少，適用于任何來源生物樣品RNA，具有經(jīng)濟性好、效率高、可靠性強、冗余度低及假陽性低等優(yōu)點。


圖1是本發(fā)明實施例提供的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的流程圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明公開一種基于mRNA水平的3’ -cDNA限制性片段展示方法，其特點是經(jīng)濟性好、冗余度低及假陽性低。該方法的主要步驟包括(I)以總RNA(或者mRNA)為模板，以設(shè)計合成的Oligo (dT)18V引物通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈。(2)將步驟(I)得到產(chǎn)物通過Taq I內(nèi)切酶進行酶切。(3)將步驟(2)產(chǎn)物與設(shè)計合成的“Y”形接頭用T4連接酶連接。
(4)以O(shè)ligo (dT)18V及Taq I“Y”形接頭序列設(shè)計引物進行PCR擴增。(5)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(原理見圖1)。本發(fā)明方法能夠展示基于mRNA水平的基因表達(dá)譜，可用來篩選差異表達(dá)基因。方案中RNA模板需要量少，適用于任何來源生物樣品RNA，具有經(jīng)濟性好、冗余度低及假陽性低等優(yōu)點。
所述變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測進一步包括(I)以總RNA或者mRNA為模板，以設(shè)計合成的Oligo (dT) 18V引物通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈；(2)將步驟(I)得到產(chǎn)物通過Taq I內(nèi)切酶進行酶切，得到兩端具有粘性末端的cDNA片段及一端為粘性末端另一端為PolyA末端的cDNA片段；(3)將步驟⑵產(chǎn)物與設(shè)計合成的“Y”形接頭用T4連接酶連接，得到兩種產(chǎn)物，一種是兩端都連接上“Y”形接頭的片段，另一種是一端連接上“Y”形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段；(4)以O(shè)ligo (dT)18V及Taq I“Y”形接頭序列設(shè)計引物進行PCR擴增，其結(jié)果是兩端都連接上“Y”形接頭的片段在PCR擴增中因其片段兩尾的互補序列而形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)，擴增受到抑制；而一端連接上“Y”形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段在擴增中得 到正常指數(shù)擴增。進一步，所述展示方法應(yīng)用“Y”形接頭與酶切片段連接，抑制非PolyA末端的cDNA擴增，讓具有“Y”形接頭及PolyA末端的cDNA得到指數(shù)擴增，排除了非PolyA末端cDNA的干擾，從而只擴增cDNA 3’末端序列。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種3’ -CDNA展示方法，其特征在于，該方法的主要步驟包括 (1)以總RNA或者mRNA為模板，以設(shè)計合成的Oligo(dT) 18V引物通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈； (2)將步驟(I)得到產(chǎn)物通過TaqI內(nèi)切酶進行酶切； (3)將步驟(2)產(chǎn)物與設(shè)計合成的“Y”形接頭用T4連接酶連接； (4)以O(shè)ligo(dT)18V及Taq I “Y”形接頭序列設(shè)計引物進行PCR擴增； (5)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。
2.如權(quán)利要求1所述的3’-cDNA展示方法，其特征在于，所述變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法進一步包括 (1)以總RNA或者mRNA為模板，以設(shè)計合成的Oligo(dT) 18V引物通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈； (2)將步驟(I)得到產(chǎn)物通過TaqI內(nèi)切酶進行酶切，得到兩端具有粘性末端的cDNA片段及一端為粘性末端另一端為PolyA末端的cDNA片段； (3)將步驟(2)產(chǎn)物與設(shè)計合成的“Y”形接頭用T4連接酶連接，得到兩種產(chǎn)物，一種是兩端都連接上“Y”形接頭的片段，另一種是一端連接上“Y”形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段； (4)以O(shè)ligo(dT)18V及Taq I “Y”形接頭序列設(shè)計引物進行PCR擴增，其結(jié)果是兩端都連接上“Y”形接頭的片段在PCR擴增中因其片段兩尾的互補序列而形成鍋柄狀結(jié)構(gòu)，擴增受到抑制；而一端連接上“Y”形接頭一端具有PolyA末端的cDNA片段在擴增中得到正常指數(shù)擴增。
3.如權(quán)利要求1所述的3’-cDNA展示方法，其特征在于，所述展示方法應(yīng)用“Y”形接頭與酶切片段連接，抑制非PolyA末端的cDNA擴增，讓具有“Y”形接頭及PolyA末端的cDNA得到指數(shù)擴增，排除了非PolyA末端cDNA的干擾，從而只擴增cDNA 3’末端序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種3’-cDNA展示方法，步驟為(1)以總RNA(或者mRNA)為模板，以設(shè)計合成的Oligo (dT)18V引物通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA雙鏈；(2)將步驟(1)得到產(chǎn)物通過TaqⅠ內(nèi)切酶進行酶切；(3)將步驟(2)產(chǎn)物與設(shè)計合成的“Y”形接頭用T4連接酶連接；(4)以O(shè)ligo (dT)18V及TaqⅠ“Y”形接頭序列設(shè)計引物進行PCR擴增。(5)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。本發(fā)明應(yīng)用“Y”形接頭與酶切片段連接，抑制非PolyA末端的cDNA擴增，讓具有“Y”形接頭及PolyA末端的cDNA得到指數(shù)擴增，排除了非PolyA末端cDNA的干擾，從而只擴增cDNA 3’末端序列，具有經(jīng)濟性好、效率高、可靠性強、冗余度低及假陽性低等優(yōu)點，能夠同時研究多個樣本多個時期的生物體mRNA時空特異表達(dá)情況，是發(fā)掘基因的功能、探索生物發(fā)育機制等的有力工具。
文檔編號C12Q1/68GK102994632SQ201210382040
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月10日
發(fā)明者賈定洪, 鄭林用, 彭衛(wèi)紅, 甘炳成, 黃忠乾, 譚偉, 王波, 謝麗源 申請人:四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所