專利名稱：從玉米中高產(chǎn)率提取超氧化物歧化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從植物中提取生物活性物的方法，特別涉及一種從玉米中提取超氧化物歧化酶的方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(以下可采用英文簡稱:S0D)是生物體內(nèi)防御氧化損傷的一種十分重要的金屬酶，作為超氧陰離子自由基的專一清除劑，在疾病的治療、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)等方面具有廣泛的應(yīng)用。但目前超氧化物歧化酶的生產(chǎn)主要來源于動物血液和肝臟。雖然動物血液中提取SOD時(shí)，可用簡單的工藝獲得SOD純品，但是在提取過程中可能不可避免地使血液中的一些病毒帶入SOD產(chǎn)品中而產(chǎn)生人畜交叉感染的情況。1996年起，歐盟就明令禁止血液制品應(yīng)用于人類疾病的治療，因此從植物中提取SOD是臨床研究的大勢所趨。但從植物中獲取SOD時(shí)，因組織相對于動物原料成分更復(fù)雜，一方面較難用常規(guī)的工藝獲得高純度的S0D，另一面某些可獲得高純度SOD的工藝則工業(yè)化難度較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種可從玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，在可獲得高純度超氧化物歧化酶的同時(shí)，工業(yè)化實(shí)現(xiàn)也較容易。本發(fā)明通過以下方案實(shí)現(xiàn):一種從玉米 中提取超氧化物歧化酶的方法，包括以下步驟:第一步:將玉米進(jìn)行預(yù)處理得到玉米漿液。一般的預(yù)處理工藝方法為:漂洗植物——浸泡——浙干水分——加水磨漿等常規(guī)步驟。第二步:在上述玉米漿液中加入水溶性銅鹽，保持pH值7 9，之后經(jīng)固液分離，得到超氧化物歧化酶原液。水溶性銅鹽一般可采用:硫酸銅、氯化銅、硝酸銅等無機(jī)銅鹽，也可采用乙酸銅等有機(jī)銅鹽。為了便于工業(yè)化，一般采用氨水調(diào)節(jié)pH值。第三步:將第二步所得的超氧化物歧化酶原液再經(jīng)兩級以上的膜過濾，依次去除分子量>12萬和分子量〈I萬的雜質(zhì)，得到超氧化物歧化酶濃縮液。為進(jìn)一步提高超氧化物歧化酶的純度，在所述的第三步之后，再進(jìn)行如下步驟，向超氧化物歧化酶濃縮液中加入可與水互溶的有機(jī)物液體經(jīng)分離得到沉淀物，干燥后，再加水使沉淀物溶解；之后重復(fù)下述步驟若干次:向溶液中加入可與水互溶的有機(jī)物液體一分離得到沉淀物——干燥——加水溶解沉淀物；在進(jìn)行最后一次時(shí)，分離得到的沉淀物經(jīng)干燥后不再加水溶解，得到超氧化物歧化酶粗產(chǎn)品。所述的這種可與水互溶的有機(jī)物液體一般采用丙酮、無水乙醇、甲醇等。為進(jìn)一步提高超氧化物歧化酶的純度，從而獲得純品，則將上述步驟得到的超氧化物歧化酶粗產(chǎn)品再次溶于水，取清液進(jìn)行三次以上的柱層析，得到超氧化物歧化酶酶液，酶液經(jīng)冷凍干燥得超氧化物歧化酶干粉。所述三次以上的柱層析優(yōu)選采用至少三種不同層析材料的層析柱效果為佳，依據(jù)層析順序先后三種不同層析材料再進(jìn)一步優(yōu)選大孔樹脂、纖維素和Sephadex G_75?？紤]工業(yè)化應(yīng)用的便利，上述的膜過濾優(yōu)選至少包含陶瓷膜過濾和超濾膜兩級，陶瓷膜過濾去除分子量大于12萬的大分子雜質(zhì)，超濾膜濃縮則除去分子量小于I萬的小分子雜質(zhì)。與現(xiàn)有的提取方法相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):1、本發(fā)明方法中，向玉米漿液中加入適量水溶性銅鹽可以提高單位質(zhì)量漿液中超氧化物歧化酶的活性。這是因?yàn)橛衩自谏L過程中因銅離子獲取的局限性，一部分SOD原蛋白因缺乏銅離子而不顯示活性，故在原漿處理過程中加入適量的銅鹽可以催化激活超氧化物歧化酶的活性，從而提高約20%的SOD活性。2、本發(fā)明方法，為降低由于引入銅鹽帶來的銅離子危害，還在后續(xù)采用膜過濾以及多次有機(jī)液沉淀一干燥的方法來將其除去。3、本發(fā)明方法中，采用多次水溶解一一有機(jī)液沉淀一干燥步驟，一方面可有效除去殘余銅離子，另一方面我 們還可以利用SOD與大部分雜質(zhì)(雜蛋白、核酸和可溶性淀粉)完全溶于水的時(shí)間差，有效去除SOD中大部分雜質(zhì)。4、本發(fā)明方法中，調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶原液的pH至7 9，以改變SOD酶活性部位有關(guān)基因的解離狀態(tài)，使酶分子上活性基團(tuán)的解離狀態(tài)最適于酶與底物的結(jié)合，而使活性釋放出來，提高了 SOD的產(chǎn)率。另外，超氧化物歧化酶原液的pH在7 9時(shí)，酶穩(wěn)定性最好。過高或過低的PH會改變酶的活性中心構(gòu)象，甚至改變整個(gè)酶分子的結(jié)構(gòu)使其變性失活。而調(diào)節(jié)PH值的氨水可以在后續(xù)濃縮過程中除去，不會對產(chǎn)品造成任何污染。5、本發(fā)明中的采用膜過濾先除去大于12萬的懸浮物和不溶性雜質(zhì)，得到澄清溶液；再去除分子量小于I萬的雜質(zhì)，從而達(dá)到濃縮與初步純化的目的，得到單位活性較高的超氧化物歧化酶濃縮液。而優(yōu)選的陶瓷膜則由于其耐用性較好，更適合工業(yè)應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1一種從玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，步驟如下:第一步:取干玉米粒120Kg，洗凈，用溫水(30°C)浸泡24h后，取出浙干，得到濕玉米140Kg。將該玉米加180L水磨漿，得到含有超氧化物歧化酶的玉米漿液350L。第二步:將上述玉米衆(zhòng)液加入24.5g無水硫酸銅后用氨水調(diào)節(jié)pH至7 9,通過壓濾進(jìn)行固液分離，得到超氧化物歧化酶活性為468U/mL的粗酶液210L。第三步:將上步得到的超氧化物歧化酶粗酶液依次通過陶瓷膜過濾和超濾膜濃縮，陶瓷膜去除分子量>12萬的雜質(zhì)，超濾膜則去除分子量〈I萬的雜質(zhì)，得到超氧化物歧化酶濃縮液，濃縮液中超氧化物歧化酶的活性為9691U/mL，體積為10L，活性保持率為98.6%。實(shí)施例2一種從玉米中高產(chǎn)率提取超氧化物歧化酶的方法，在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，再進(jìn)行以下步驟。第四步:向第三步所得濃縮液加入丙酮，分離取沉淀物，再干燥沉淀物；之后再將干燥得到的沉淀物溶于水，再向溶液中加入丙酮，再分離取沉淀物，干燥沉淀物，得超氧化物歧化酶粗產(chǎn)品，其中超氧化物歧化酶活性保持率為90.3%。
實(shí)施例3一種從玉米中高產(chǎn)率提取超氧化物歧化酶的方法，在實(shí)施例2的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步純化，再進(jìn)行以下步驟。第五步:將第四步所得到的超氧化物歧化酶粗產(chǎn)品溶于水后離心，取清液，并依次通過:大孔樹脂一DEAE-纖維素一Sephadex G-75層析柱，三級層析后即得到高純度的超氧化物歧化酶酶液，其中超氧化物歧化酶活性保持率為78.3%。上述酶液冷凍干燥后即可得到活性為6058U/mg的超氧化物歧化酶干粉。實(shí)施例4第一步:取干玉米粒200Kg，洗凈，用溫水浸泡24h后，取出浙干，得到濕玉米240Kg。將該玉米加300L水磨漿，得到含有超氧化物歧化酶的玉米漿液550L。第二步:將該玉米衆(zhòng)液加入38.5g無水硫酸銅后用氨水調(diào)節(jié)pH至7 9,通過壓濾進(jìn)行固液分離，得到超氧化物歧化酶活性為505U/mL的粗酶液350L。第三步:將上步所得的超氧化物歧化酶粗酶液依次先后通過陶瓷膜過濾和超濾膜濃縮，得到超氧化物歧化酶濃縮液活性為9800U/mL，體積為16.5L，超氧化物歧化酶活性保持率為98.0%。第四步:向上步所得濃縮液加入無水乙醇，分離取沉淀物，再干燥沉淀物；之后再將干燥得到的沉淀物溶于水，再向溶液中加入無水乙醇，再分離取沉淀物，干燥沉淀物；重復(fù)沉淀物溶于水一加入無水乙醇一分離一干燥步驟三次，取經(jīng)第三次處理的干燥后的沉淀物，得超氧化物歧化酶粗產(chǎn)品。 第五步:將上步所得超氧化物歧化酶粗產(chǎn)品再溶于水后離心，取上清液依次通過大孔樹脂——DEAE-纖維素——Sephadex G-75層析柱，得到高純度的超氧化物歧化酶酶液，其中超氧化物歧化酶活性保持率為77.5%。酶液再經(jīng)冷凍干燥可得到活性為5960U/mg的超氧化物歧化酶干粉。
權(quán)利要求
1.一種從玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:包括以下步驟， 第一步:將玉米進(jìn)行預(yù)處理得到玉米漿液； 第二步:在玉米漿液中加入水溶性銅鹽，保持pH值7 9，之后經(jīng)固液分離，得到超氧化物歧化酶原液； 第三步:將第二步所得的超氧化物歧化酶原液再經(jīng)兩級以上的膜過濾，依次去除分子量>12萬和分子量〈I萬的雜質(zhì)，得到超氧化物歧化酶濃縮液。
2.如權(quán)利要求1所述的從玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:在所述的第三步之后，再進(jìn)行如下步驟，向超氧化物歧化酶濃縮液中加入可與水互溶的有機(jī)物液體經(jīng)分離得到沉淀物，干燥后，再加水使沉淀物溶解；之后重復(fù)下述步驟若干次，向溶液中加入可與水互溶的有機(jī)物液體一分離得到沉淀物一干燥一加水溶解沉淀物；將最后一次分離得到的沉淀物干燥，得到超氧化物歧化酶粗產(chǎn)品。
3.如權(quán)利要求2所述的從玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:將所述的超氧化物歧化酶粗產(chǎn)品再次溶于水，取清液進(jìn)行三次以上的柱層析，得到超氧化物歧化酶酶液，酶液經(jīng)冷凍干燥得超氧化物歧化酶干粉。
4.如權(quán)利要求3所述的從玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:所述三次以上的柱層析優(yōu)選采用至少三種不同層析材料的層析柱。
5.如權(quán)利要求4所述的從玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:所述至少三種不同層析材料，依據(jù)層析順序先后選擇大孔樹脂、纖維素和S^hadex G-75。
6.如權(quán)利要求1 5之一所述的從玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:所述的兩級以上膜過濾優(yōu)選至少包含陶瓷膜過濾和超濾膜兩級。
7.如權(quán)利要求1 5之一所述的從玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，其特征在于:所述的第二步中優(yōu)選采用氨水調(diào)節(jié)PH值。
8.如權(quán)利要求6所述的從玉米中提取超氧化物歧化酶的方法， 其特征在于:所述的第二步中優(yōu)選采用氨水調(diào)節(jié)pH值。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從玉米中提取超氧化物歧化酶的方法，包括玉米漿液——加入銅鹽后分離——膜過濾——有機(jī)液沉淀——干燥——溶解——層析——冷凍干燥等步驟。本發(fā)明方法采用銅鹽可提高約20%的超氧化物歧化酶活性，而銅鹽帶來的銅離子危害，可在后續(xù)采用膜過濾以及多次有機(jī)液沉淀——干燥的方法來將其除去。并且本發(fā)明利用超氧化物歧化酶與大部分雜質(zhì)(雜蛋白、核酸和可溶性淀粉)完全溶于水的時(shí)間差，采用多次沉淀——干燥——溶解的組合步驟去除SOD中大部分雜質(zhì)，提高其純度。
文檔編號C12N9/02GK103173423SQ20131010622
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月29日
發(fā)明者詹擁共, 梁姣, 高建軍, 劉西洋 申請人:湖南大學(xué)